Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Il lavoro è stato sostenuto dal programma PRESTO dell'Agenzia giapponese per la scienza e la tecnologia (JPMJPR11AA) e da un Istituto nazionale di salute (R01GM107733).

Tutte le procedure relative ai pesci sono state effettuate con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso la Harvard Medical School.
1. preparazione degli utensili e dei reagenti
<ol><li>
Fare un anello di filo per tagliare gli embrioni
	<ol>
<li>Prendere 20 cm di filo di acciaio inossidabile che è rigido e non corrosivo con un diametro di 40 μm. Loop il filo attraverso in vetro capillare (1,0 mm diametro est...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

Storicamente, tra gli animali vertebrati, la riduzione delle dimensioni è stata eseguita principalmente utilizzando embrioni anfibi, bisettrice gli embrioni lungo l'asse animale-vegetale in una Blastula fase12. Tuttavia, ci sono principalmente due differenze tra gli embrioni di rana e di pesce zebra quando si dividere gli embrioni. In primo luogo, nella fase in cui gli embrioni di pesce zebra diventano tolleranti di bisettrice (stadio Blastula), l'organizzatore si tro...

Gli scienziati hanno da tempo saputo che gli embrioni hanno una notevole capacità di formare proporzioni corporee costanti, anche se le dimensioni dell'embrione possono variare notevolmente sia in condizioni naturali che sperimentali1,2,3. Nonostante decenni di studi teorici e sperimentali, questa robustezza alla variazione dimensionale, il ridimensionamento definito, e i suoi meccanismi sottostanti rimangono sconosciuti in molti tessuti e organi. Al fine di catturare direttamente le dinamiche del sistema di sviluppo, abbiamo stabilito una tecnica di riduzione delle dimensioni riproducibile e semplice in pesce zebra4, che ha il grande vantaggio in in vivo di imaging Live5.
Zebrafish ha servito come modello di animale vertebrato per studiare diverse discipline della biologia, compresa la biologia dello sviluppo. In particolare, il pesce zebra è ideale per l'imaging Live in vivo6 perché 1) lo sviluppo può procedere normalmente al di fuori della madre e del guscio d'uovo, e 2) gli embrioni sono trasparenti. Inoltre, gli embrioni possono sopportare alcune fluttuazioni di temperatura e ambientali, che permette loro di essere studiati in condizioni di laboratorio. Inoltre, oltre alla perturbazione convenzionale dell'espressione genica per morfolino e l'iniezione di mRNA7,8, i recenti progressi nella tecnologia CRISPR/Cas9 hanno reso la genetica inversa in pesce zebra altamente efficiente9. Inoltre, molte tecniche classiche in embriologia, come il trapianto di cellule o la chirurgia tissutale possono essere applicate4,10,11.
Le tecniche di riduzione delle dimensioni sono state originariamente sviluppate in anfibi e altri animali non vertebrati12. Ad esempio, in Xenopus laevis, un altro modello popolare di animali vertebrati, la bisezione lungo l'asse animale-vegetale allo stadio Blastula può produrre embrioni di dimensioni ridotte12,13. Tuttavia, nelle nostre mani questo approccio in un solo passaggio provoca embrioni dorsalizzati o ventralizzati nel pesce zebra, presumibilmente perché i determinanti dorsali sono distribuiti in modo non uniforme e non si può conoscere la loro localizzazione dalla morfologia degli embrioni. Qui si dimostra un'alternativa tecnica di taglio a due fasi per il pesce zebra che produce embrioni normalmente in via di sviluppo ma più piccoli. Con questa tecnica, le cellule vengono prima rimosse dal palo animale, una regione di cellule ingenue prive di attività dell'organizzatore. Per bilanciare la quantità di tuorlo e cellule, che è importante per epiboly e successiva morfologenesi, il tuorlo viene quindi rimosso. Qui, dettagliamo questo protocollo e forniamo due esempi di invarianza dimensionale nella formazione del modello; la formazione di somite e il patterning del tubo neurale ventrale. In combinazione con l'imaging quantitativo, abbiamo utilizzato la tecnica di riduzione delle dimensioni per esaminare il modo in cui le dimensioni dei somiti e del tubo neurale sono influenzate in embrioni ridotti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

Nel processo di sviluppo, gli embrioni mostrano una notevole capacità di abbinare il loro modello corporeo alle loro dimensioni corporee; la loro proporzione corporea è mantenuta anche in embrioni che sono più grandi o più piccoli, entro certi limiti. Anche se questo fenomeno di scalatura ha attirato l'attenzione di oltre un secolo, la comprensione dei meccanismi di base è stata limitata, a causa in parte di una mancanza di descrizione quantitativa delle dinamiche evolutive in embrioni di varie dimensioni. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per ridurre chirurgicamente le dimensioni degli embrioni di pesce zebra, che hanno grandi vantaggi per l'imaging Live in vivo. Abbiamo dimostrato che dopo una rimozione equilibrata delle cellule e del tuorlo alla fase Blastula in fasi distinte, gli embrioni possono recuperare rapidamente nelle giuste condizioni e svilupparsi in embrioni più piccoli ma altrimenti normali. Poiché questa tecnica non richiede attrezzature speciali, è facilmente adattabile e può essere utilizzata per studiare una vasta gamma di problemi di ridimensionamento, inclusa la robustezza del patterning mediogeno.

La riduzione del volume di tuorlo è importante per la morfologia normale Come recentemente descritto in Almuedo-Castillo et al.17, la riduzione delle dimensioni degli embrioni può essere ottenuta senza ridurre il volume del tuorlo. Per confrontare con e senza riduzione del volume di tuorlo, abbiamo eseguito sia il taglio a due fasi (sia Blastula e tuorlo) che la Blastula-solo taglio (Figura 2 e film supplementare 1). Embrioni tri...

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Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

Qui descriviamo un metodo per ridurre le dimensioni degli embrioni di pesce zebra senza interrompere i normali processi di sviluppo. Questa tecnica consente lo studio del ridimensionamento del modello e della robustezza dello sviluppo contro il cambiamento delle dimensioni.

Riduzione delle dimensioni chirurgiche di zebrafish per lo studio della scala del modello embrionale

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Sebbene il ridimensionamento sia uno degli attributi universali e fondamentali dei sistemi di sviluppo, i meccanismi sottostanti non sono stati compresi in molti organi e tessuti. La tecnica di riduzione delle dimensioni di zebrafish presentata in questo video farà progredire la comprensione dei meccanismi alla base dei processi di ridimensionamento dinamico. I vantaggi di lavorare con il pesce zebra sono che è facile eseguire immagini dal vivo, genetica e analisi quantitative.La nostra tecnica è anche molto semplice e facile da applicare senza attrezzature specializzate o allenamento intensivo. La salute degli embrioni è la chiave del successo con questa tecnica. Usa i pesci giovani come genitori e fai attenzione a ridurre al minimo i danni rimuovendo i coriandoli.E anche giocare nelle dimensioni della ferita sul tuorlo, e quante cellule vengono rimosse. Poiché gli embrioni che utilizziamo sono molto giovani e fragili, devono essere maneggiati con molta attenzione durante il trasferimento e il taglio. Allo stesso tempo, deve essere veloce in modo che la procedura possa essere eseguita nel giusto lando di sviluppo.La dimostrazione visiva può dare un buon senso a come produrre embrioni più piccoli in modo efficace. Per realizzare un anello metallico per il taglio dell'embrione, alimentare un filo di acciaio inossidabile rigido e non corrosivo lungo 20 centimetri attraverso un capillare di vetro, facendo un piccolo anello lungo un millimetro nella parte superiore. Posizionare una piccola goccia di smalto chiaro sulla punta del capillare di classe, tra il capillare e l'anello del filo per tenerlo in posizione, assicurandosi di non ottenere smalto sulla porzione di loop, in quanto potrebbe danneggiare gli embrioni.E poi lasciarlo asciugare. Utilizzare il nastro da laboratorio per attaccare il capillare di vetro con l'anello su una bacchetta di legno, lasciando circa due centimetri e mezzo del capillare di vetro che si estende oltre la bacchetta in modo che la parte della bacchetta dell'utensile non si tuffi in acqua in seguito. In una piastra di Petri in vetro da 100 millimetri con spatola di plastica, stendere circa 0,5 millilitri di cellulosa metile al 2% vicino al centro del fondo in modo sottile e uniforme a uno spessore di circa 0,5 millimetri.Versare circa 30 millilitri della soluzione di Ringer di un terzo sul lato del piatto e lasciare che si diffonda sul resto del piatto e coprire la cellulosa metile. Posizionare embrioni precedentemente de-colinonati allo stadio di cellule da 256 a una K sullo stadio del 2%metilcellulosa, assicurandosi che gli embrioni siano orientati su un lato. Per tagliare la blastula, utilizzare l'anello di filo per tagliare vicino al polo animale, perpendicolarmente all'asse vegetale animale e tagliare circa il 30-40% delle cellule blastoderma.Quindi toccare delicatamente le estremità insieme per aiutare le cellule rimanenti a tornare indietro. Per il tuorlo, utilizzare il filo montato per fare una piccola ferita vicino al polo vegetale rubando la membrana dell'uovo, che farà trasliare il tuorlo per alcuni minuti, quindi guarire. Quando il tuorlo smette di trasudare, utilizzare una pipetta per spostare l'embrione al di fuori della cellulosa metile nello stesso piatto per il recupero.Ripeti blastula e tuorlo tagliando per tutti gli embrioni, quindi lascia il piatto indisturbato per 30 minuti mentre gli embrioni si riprendono. Quindi, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli embrioni nella teglia di vetro da 35 millimetri precedentemente preparata contenente la soluzione ringer fresca di un terzo e posizionarli in un incubatore Celsius di 28,5 gradi per consentire il recupero completo prima di continuare con l'imaging. Dopo aver eseguito un taglio in due fasi con blastula e tuorlo, gli embrioni hanno mostrato una morfologia complessiva apparentemente normale durante gli stadi di sviluppo rispetto agli embrioni di controllo, diversa dalla differenza di dimensioni.D'altra parte, gli embrioni tritati solo blastula mostravano una morfologia particolare, specialmente nelle fasi precedenti. Durante l'epibolità, gli embrioni avevano un aspetto ristretto e rientrato. Nella fase successiva del somite, le strutture della linea mediana sono state appiattite a molti livelli assiali.Nelle fasi successive, le strutture del corpo adiacenti al tuorlo, come il cervello medio e posteriore, mostravano ancora una forma relativamente appiattita, probabilmente a causa dell'aumento della tensione dal tuorlo relativamente più grande. L'imaging time lapse della formazione di somite ha mostrato che sia negli embrioni di controllo che in quelli tritati, le dimensioni dei somiti che si sono formati nelle fasi successive erano più piccole rispetto a quelle delle fasi precedenti. Inoltre, durante tutte le fasi di formazione del somite, gli embrioni tritati avevano somiti più piccoli di quelli negli embrioni di controllo.Quando la tecnica di taglio a due gradini è stata eseguita su embrioni iniettati di membrana mCherry, l'imaging del midollo spinale a 20 ore dopo la fecondazione ha mostrato una riduzione dell'altezza del tubo neurale a causa della riduzione delle dimensioni. Il taglio in due gradini è molto importante per ottenere embrioni più piccoli ma altrimenti normali con alta efficienza. È importante ricordare di non tagliare il tuorlo mentre si tagliano le cellule dalla blastula.Per il tuorlo, fai una piccola ferita su di esso affinché il contenuto traslochi. E la membrana del tuorlo guarirà naturalmente nel tampone corretto. Poiché gli embrioni tritati possono essere recuperati rapidamente, qualsiasi metodo o analisi può essere applicato a embrioni normali può essere eseguito seguendo il metodo di riduzione delle dimensioni.La semplicità e la versatilità di questa tecnica è molto potente in quanto chiunque potrebbe introdurre questa tecnica per studiare il problema del ridimensionamento in qualsiasi tessuto o organo in zebrafish. Crediamo che con questa tecnica i ricercatori possano affrontare i problemi di scala in una varietà di sistemi che non sono mai stati toccati prima. Abbiamo già fatto importanti scoperte nel ridimensionamento del somite e del patterning dei tubi neurali.

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Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...