Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

이 작품은 일본 과학 기술 기구 (JPMJPR11AA)의 프레스 프로그램 및 건강 보조금 (R01GM107733)의 국가 학회에 의해 지원 되었다.

모든 어류 관련 절차는 하버드 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받아 수행 하였다.
1. 공구 및 시 약 준비
<ol><li>
배아를 잘라 와이어 루프를 확인
	<ol>
<li>직경 40 μ m의 견고 하 고 부식성이 없는 스테인레스 스틸 와이어 20cm를 사용 하십시오. 와이어를 통해 유리 모 세관 (1.0 mm 외경, 0.5 mm 내경, 필 라 멘 트 없음)을 반복 하 여...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

역사적으로, 척추 동물 동물 들 중에서, 크기 감소는 주로 배아를 수 륙 양용으로 사용 하 여 수행 되었으며, blastula 스테이지 (12)에서 동물-식물성 축을 따라 배아를 양분 하였다. 그러나, 우리는 배아를 이등분 때 개구리와 제 브라 피쉬 배아 사이에는 주로 두 가지 차이점이 있습니다. 첫째, 제 브라이 어 배아가 비 대 한 (blastula 단계)의 관용이 되는 단계에?...

과학자 들은 배아 크기가 자연 및 실험 조건1,3에서 크게 다를 수 있지만 태아가 일정 한 신체 비율을 형성 하는 현저한 능력을가지고 있다고 오랫동안 알려져 있다. 이론 및 실험적 연구의 수십 년에도 불구 하 고, 크기 변화에이 견고성, 불리는 스케일링, 그리고 그것의 근본적인 메커니즘은 많은 조직과 기관에서 알 수 없는 남아. 직접 개발 시스템의 역학을 포착 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징5에서 큰 이점을가지고 zebrafish4에서 재현 가능 하 고 간단한 크기 감소 기술을 확립 했다.
Zebrafish는 발달 생물학을 포함 하 여 생물학의 여러 학문을 연구 하는 동물 모델 척추 동물 역임 했습니다. 특히, 제 브라 피쉬는 생체 내 라이브 이미징 (6 ) 때문에 1) 개발이 정상적으로 진행 될 수 있으며 모와 달걀 껍질, 그리고 2) 배아가 투명 하다. 또한, 배아는 일부 온도 및 환경 변동을 견딜 수 있으며,이는 실험실 조건에서 공부 하는 것을 허용 한다. 또한, 모 르 폴 리노와 mRNA 주입7,8에의 한 종래의 유전자 발현 섭 동에 더하여, 최근 CRISPR/Cas9 기술의 진보는 제 브라 피쉬 고효율9에서 역 유전학을 만들었다. 더욱이, 세포 이식 또는 조직 수술과 같은 발생 학의 많은 고전 기술이4,10,11에 적용 될 수 있다.
원래 크기 감소 기법은 수 륙 양용 및 기타 비 척추 동물 동물12에서 개발 되었다. 예를 들어, xenopus laevis에서 또 다른 인기 있는 척추 동물 동물 모델 인 blastula 단계에서 동물-식물성 축을 따라 양분는 크기 감소 배아12,13을 생산할 수 있다. 그러나, 우리의 손에서이 한 단계 접근은 제 브라 물고기에 있는도 배 화 된 배아를 초래 하 고, 아마도 등 쪽 결정 개미는 불균일 하 게 분포 하 고 하나는 배아의 형태학에서 그들의 현지화를 알 수 없습니다. 여기에서 우리는 일반적으로 개발 하지만 작은 배아를 생산 zebrafish에 대 한 대안 2 단계 베 지 기법을 보여줍니다. 이 기술을 통해 세포는 처음에는 동물 극에서 제거 되 고, 조직자 활동에서 부족 한 순진한 세포의 영역입니다. 노 른 자와 세포의 양을 균형을 유지 하기 위해,이는 상피와 이후의 형태 형성에 중요 한, 노 른 자는 제거. 여기서는이 프로토콜에 대해 상세히 설명 하 고, 패턴 형성에서의 크기 불변의 두 가지 예를 제공 합니다. 솜 사이트 형성 및 복 부 신경 튜브 패터 닝. 정량적 이미징과 결합 하 여 크기 감소 기법을 활용 하 여 진드기와 신경 관의 크기가 감소 된 배아의 크기에 미치는 영향을 조사 했습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

발달 과정에서, 배아는 자신의 신체 크기에 자신의 신체 패턴을 일치 시키는 현저한 능력을 나타낸다; 그들의 신체 비율은 특정 한계 내에서 더 크거나 작은 배아 에서도 유지 됩니다. 이 스케일링 현상은 한 세기 동안 주목을 받고 있지만, 근본적인 메커니즘을 이해 하는 것은 다양 한 크기의 배아에서 발달 역학에 대 한 정량적 인 설명의 부족으로 인해 제한 되었습니다. 이 한계를 극복 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징에 대 한 큰 이점이 zebrafish 배아의 크기를 감소 시키는 새로운 기술을 개발 했습니다. 우리는 별도의 단계에서 blastula 단계에서 세포와 노 른 자의 균형 잡힌 제거 후, 배아는 신속 하 게 올바른 조건에서 회복 하 고 더 작은 하지만 그렇지 않으면 정상적인 배아로 발전 할 수 있음을 보여줍니다. 이 기술은 특별 한 장비가 필요 하지 않기 때문에 쉽게 적응 할 수 있으며, 형태 적 매개 패터 닝의 견고성을 포함 하 여 광범위 한 스케일링 문제를 연구 하는 데 사용 됩니다.

노 른 자 부피 감소는 일반적인 형태학을 위해 중요 합니다 최근 알 무에도 카스 티 요 외17에 기재 된 바와 같이, 배아의 크기 감소는 노 른 자 부피를 감소 시 킴으로써 달성 될 수 있다. 노 른 자 부피 감소와 비교 하기 위해, 우리는 2 단계 장작 패기와 황 반도 (그림 2 와 보조 영화 1)를 모두 수행 했습니다. 2 단계 다진 배아는 발...

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Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

여기서, 우리는 정상적인 발달 과정을 방해 하지 않고 제 브라 피시 배아의 크기를 감소 시키는 방법을 설명 한다. 이 기술을 사용 하면 크기 변경에 대 한 패턴 스케일링 및 개발 견고성을 연구할 수 있습니다.

배아 패턴 스케일링 연구를 위한 제 브라 피시 수술 크기 감소

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

스케일링은 개발 시스템의 보편적이고 근본적인 속성 중 하나이지만, 기본 메커니즘은 많은 장기와 조직에서 이해되지 않았습니다. 이 비디오에 제시된 Zebrafish의 크기 감소 기술은 동적 스케일링 프로세스의 기본 메커니즘에 대한 이해를 향상시길 것입니다. Zebrafish와 함께 작업의 장점은 라이브 이미징, 유전학 및 정량 분석을 수행하기 쉽다는 것입니다.우리의 기술은 또한 어떤 전문 장비 또는 집중적 인 교육없이 적용하기 쉽습니다 매우 간단하고 쉽게. 배아의 건강은 이 기술로 성공의 열쇠입니다. 어린 물고기를 부모로 사용하고 축화를 제거하여 손상을 최소화하십시오.또한 노른자에 상처의 크기와 얼마나 많은 세포가 제거되는지 놀수 있습니다. 우리가 사용하는 배아는 매우 젊고 깨지기 쉽기 때문에 옮기고 자르는 경우 매우 신중하게 처리해야합니다. 동시에 프로시저를 적시에 수행할 수 있도록 빠르야 합니다.시각적 데모는 작은 배아를 효과적으로 생성하는 방법에 대한 좋은 감각을 줄 수 있습니다. 배아 자르기용 와이어 루프를 만들려면 유리 모세관을 통해 20센티미터 길이의 뻣뻣하고 비부식성 스테인리스 스틸 와이어를 공급하여 상단에 1mm 길이의 작은 루프를 만듭니다. 모세관과 와이어 루프 사이에 명확한 매니큐어의 작은 방울을 제자리에 고정시키고 배아를 손상시킬 수 있으므로 루프 부분에 매니큐어를 얻지 않도록하십시오.그리고 건조하자. 실험실 테이프를 사용하여 유리 모세관을 나무 젓가락에 부착하여 젓가락 너머로 확장되는 유리 모세관의 약 2센티미터 반센티미터를 남기고 공구의 젓가락 부분이 나중에 물에 담그지 않도록 하십시오. 플라스틱 주걱이 있는 100mm 유리 페트리 접시에서 약 0.5밀리리터의 2%메틸 셀룰로오스를 바닥 중앙 부근에 얇게, 균등하게 약 0.5밀리미터 두께로 퍼뜨리었다.링거의 용액약 약 30밀리리터를 접시 측면에 붓고 나머지 요리에 퍼지고 메틸 셀룰로오스를 덮습니다. 이전에 256세포에 있는 제분산화된 배아를 2%메틸 셀룰로오스에 1개의 K 세포 단계에 놓고, 배아가 그들의 편으로 지향되는지 확인하십시오. 블라발라를 자르려면 와이어 루프를 사용하여 동물 극 근처에서 동물 성축에 수직으로 자르고 약 30 ~40 %의 blastoderm 세포를 잘라냅니다.그런 다음 끝을 부드럽게 탭하여 나머지 셀이 다시 달라붙도록 돕습니다. 노른자의 경우, 장착 된 와이어를 사용하여 달걀 막을 닉핑하여 식물장 근처의 작은 상처를 만들어 노른자가 몇 분 동안 스며 나온 다음 치유합니다. 노른자가 스며드는 것을 멈추면 파이펫을 사용하여 회복을 위해 같은 접시에 있는 메틸 셀룰로오스 외부의 배아를 이동시십시오.모든 배아를 위해 블래술라와 노른자를 자르는 다음 배아가 회복되는 동안 30 분 동안 방해받지 않고 접시를 둡니다. 그런 다음, 유리 파이펫을 사용하여 신선한 1/3 링거 용액을 함유한 이전에 준비된 35mm 유리 접시에 배아를 옮기고 28.5도의 섭씨 인큐베이터에 배치하여 이미징을 계속하기 전에 완전한 회복을 허용합니다. 블라발라와 노른자를 잘라 두 단계를 수행 한 후, 배아는 대조군 배아에 비해 발달 단계 전반에 걸쳐 겉보기에 정상 전체 형태를 보였다, 크기 차이 이외의.다른 한편으로는, blastula 전용 다진 태아는 특히 초기 단계에서 특이한 형태를 보여주었습니다. 상피하는 동안, 배아는 수축되고 들여쓰기모양이 있었다. 다음 소미트 단계에서, 중간 선 구조는 많은 축 수준에서 평평해진 것으로 나타났습니다.나중에, 노른자에 인접한 바디 구조물은, 중간 및 힌드뇌와 같은 아직도 상대적으로 평평한 모양을 보여주었습니다, 아마도 상대적으로 더 큰 노른자에서 증가한 긴장 때문에. 솜무 형성의 시간 경과 화상 진찰은 통제와 다진 태아 둘 다에서, 나중에 단계에서 형성된 somites의 크기는 초기 단계에서 그들에 비해 더 작다는 것을 보여주었습니다. 또한, 소미트 형성 단계 전반에 걸쳐, 다진 배아는 대조군 배아에 있는 그들 보다는 더 작은 소미트가 있었습니다.멤브레인 mCherry 주입 배아에서 2단계 도마 기술이 수행되었을 때, 20시간 후 수정후 척수의 이미징은 크기 감소로 인한 신경관 높이의 감소를 보였다. 2단계 자르기는 고효율의 작지만 정상적인 배아를 얻는 것이 매우 중요합니다. 블라술라에서 세포를 자르면서 노른자를 자르지 않는 것이 중요합니다.노른자의 경우 내용이 스며들수 있도록 작은 상처를 입습니다. 그리고 노른자 막은 적절한 버퍼에서 자연적으로 치유됩니다. 다진 배아를 신속하게 회수할 수 있기 때문에, 임의의 방법또는 분석은 크기 감소 방법에 따라 정상적인 배아에 적용될 수 있다.이 기술의 단순성과 다양성은 누구나 제브라피시의 조직이나 장기에서 스케일링 문제를 연구하는 이 기술을 도입할 수 있기 때문에 매우 강력합니다. 우리는 이 기술로 연구원들이 이전에 는 손길이 닿지 않은 다양한 시스템에서 스케일링 문제를 해결할 수 있다고 믿습니다. 우리는 이미 소미트와 신경관 패터닝의 스케일링에 중요한 발견을 했습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

연구

발생학

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...