Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Arbeidet ble støttet av PRESTO-programmet i Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) og en National Institutes of Health Grant (R01GM107733).

Alle fiske relaterte prosedyrer ble utført med godkjennelse fra den institusjonelle dyre omsorgen og bruks komitéen (IACUC) ved Harvard Medical School.
1. forberedelse av verktøy og reagenser
<ol><li>
Lag en wire loop å hogge embryo
	<ol>
<li>Ta 20 cm rustfritt stål wire som er stiv og ikke-etsende med en diameter på 40 μm. Loop ledningen gjennom i glass kapillær (1,0 mm ytre diameter, 0,5 mm indre diameter, ingen filament), noe som gjør en liten sl...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

Historisk blant virveldyr dyr, har størrelsesreduksjon blitt hovedsakelig utført ved hjelp amfibier embryo, ved å halverer embryo langs dyr vegetal aksen på et Blastulastadiet trinn12. Men det er i hovedsak to forskjeller mellom frosk og sebrafisk embryo når vi halvere embryo. Først på scenen når sebrafisk embryo blir tolerant av halverer (Blastulastadiet Stadium), arrangøren ligger i et begrenset område av Blastulastadiet margin18<sup...

Forskere har lenge visst at embryo har en bemerkelsesverdig evne til å danne konstant kropps proporsjoner selv om embryo størrelse kan variere sterkt både under naturlige og eksperimentelle forhold1,2,3. Til tross for ti år med teoretiske og eksperimentelle studier, denne robusthet til størrelse variasjon, kalt skalering, og dens underliggende mekanismer forblir ukjent i mange vev og organer. For å direkte fange dynamikken i utviklingssystemet, etablerte vi en reproduserbar og enkel størrelsesreduksjon teknikk i sebrafisk4, som har den store fordelen i in vivo Live Imaging5.
Sebrafisk har fungert som en modell virveldyr dyr å studere flere disipliner av biologi, inkludert utviklingsmessige biologi. Spesielt er sebrafisk ideell for in vivo Live Imaging6 fordi 1) utviklingen kan fortsette normalt utenfor mor og eggeskall, og 2) embryo er gjennomsiktige. I tillegg kan embryo tåle noen temperatur og miljømessige svingninger, som tillater dem å bli studert i laboratorieforhold. Også, i tillegg til konvensjonelle genuttrykk forstyrrelsene av morpholino og mRNA injeksjon7,8, nylige fremskritt i CRISPR/Cas9 teknologi har gjort omvendt genetikk i sebrafisk svært effektiv9. Videre kan mange klassiske teknikker i embryologi, for eksempel celle transplantasjon eller vevs kirurgi påføres4,10,11.
Størrelsesreduksjon teknikker ble opprinnelig utviklet i amfibier og andre ikke-virveldyr dyr12. For eksempel, i Xenopus laevis, en annen populær virveldyr dyremodell, bisection langs dyret-vegetal aksen på Blastulastadiet stadiet kan produsere størrelse-redusert embryo12,13. Men i våre hender denne ett-trinns tilnærming resulterer i dorsalized eller ventralized embryo i sebrafisk, antagelig fordi rygg faktorer er fordelt ujevnt og man kan ikke kjenne sin lokalisering fra morfologi av embryo. Her viser vi en alternativ to-trinns hakke teknikk for sebrafisk som produserer normalt utvikling, men mindre embryo. Med denne teknikken, celler er først fjernet fra dyret polet, en region av naive celler mangler i arrangøraktivitet. For å balansere mengden av eggeplomme og celler, noe som er viktig for epiboly og påfølgende morphogenesis, eggeplomme blir deretter fjernet. Her detalj vi denne protokollen og gir to eksempler på størrelse invarians i mønsteret formasjon; somite dannelse og ventrale mønstre for nevrale rør. Kombinert med kvantitativ bildebehandling, benyttet vi størrelsesreduksjon teknikk for å undersøke hvordan størrelsene på somites og neural tube er påvirket i størrelse redusert embryo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

I utviklingsprosessen, embryo viser en bemerkelsesverdig evne til å matche deres kropps mønster til sin kroppsstørrelse; deres kropps andel opprettholdes selv i embryo som er større eller mindre, innenfor visse grenser. Selv om dette fenomenet skalering har tiltrukket seg oppmerksomhet i over et århundre, forstå de underliggende mekanismene har vært begrenset, skyldes delvis en mangel på kvantitativ beskrivelse av utviklingsmessige dynamikk i embryo av varierte størrelser. For å overvinne denne begrensningen, utviklet vi en ny teknikk for å kirurgisk redusere størrelsen på sebrafisk embryo, som har store fordeler for in vivo Live Imaging. Vi viser at etter balansert fjerning av celler og eggeplomme på Blastulastadiet scenen i separate trinn, kan embryo raskt komme seg under de rette forholdene og utvikle seg til mindre, men ellers normalt embryo. Siden denne teknikken ikke krever spesialutstyr, er det lett å tilpasse, og kan brukes til å studere et bredt spekter av Skalerings problemer, inkludert robusthet av morphogen mediert mønster.

Eggeplomme volumreduksjon er viktig for normal morfologi Som nylig beskrevet i Almuedo-Castillo et al.17, kan størrelsesreduksjon av embryo oppnås uten å redusere eggeplomme volum. For å sammenligne med og uten eggeplomme volumreduksjon, utførte vi både to-trinns hakking (både Blastulastadiet og eggeplomme) og Blastulastadiet hakking (figur 2 og supplerende film 1). To-trinns hakket embryo viste tilsynelatende normal generel...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

Her beskriver vi en metode for å redusere størrelsen på sebrafisk embryo uten å forstyrre normale utviklingsprosesser. Denne teknikken gjør det mulig å studere mønster skalering og utviklingsmessige robusthet mot størrelsesendring.

Kirurgisk Størrelsesreduksjon av sebrafisk for studiet av embryonale mønster skalering

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Selv om skalering er en av de universelle og grunnleggende egenskapene til utviklingssystemer, har de underliggende mekanismene ikke blitt forstått i mange organer og vev. Størrelsesreduksjonsteknikken til sebrafisk presentert i denne videoen vil fremme din forståelse av mekanismer underliggende dynamiske skaleringsprosesser. Fordelene med å jobbe med sebrafisk er at det er lett å utføre levende avbildning, genetikk og kvantitativ analyse.Vår teknikk er også veldig enkel og enkel å bruke uten spesialisert utstyr eller intensiv trening. Helsen til embryoer er nøkkelen til suksess med denne teknikken. Bruk ung fisk som foreldre og vær forsiktig med å minimere skaden ved å fjerne oppgavene.Og også leke seg i størrelsen på såret på eggeplommen, og hvor mange celler som fjernes. Siden embryoene vi bruker er svært unge og skjøre, må de håndteres veldig nøye ved overføring og hakking. Samtidig må det være raskt slik at prosedyren kan gjøres i riktig tidsvindu for utvikling.Visuell demonstrasjon kan gi en god følelse av hvordan man produserer mindre embryoer effektivt. For å lage en trådsløyfe for embryohakking, mate 20 centimeter lang stiv og ikke-korroderende rustfritt stål wire gjennom et glass kapillær, noe som gjør en liten, en millimeter lang sløyfe på toppen. Plasser en liten dråpe klar neglelakk på spissen av klassekapillæren, mellom kapillæren og trådsløyfen for å holde den på plass, og pass på at du ikke får neglelakk på sløyfedelen, da det kan skade embryoene.Og så la det tørke. Bruk lab tape for å feste glasskapillæren med løkken på en tre spisepinne, slik at omtrent to og en halv centimeter av glasskapillæren strekker seg utover spisepinnen slik at spisepinnedelen av verktøyet ikke dypper i vannet senere. I en 100 millimeter glass Petriskål med en plastspatel, spre ca 0,5 milliliter på 2% metylcellulose nær midten av bunnen tynt og jevnt til en tykkelse på ca 0,5 millimeter.Hell ca 30 milliliter av en tredjedel Ringers løsning på siden av parabolen, og la den spre seg på resten av parabolen og dekke metylcellulose. Plasser tidligere de-chorionated embryoer på 256 celle til en K celle stadium på 2% metyl cellulose, og sørg for at embryoene er orientert på deres side. For å hogge blastula, bruk trådsløyfen til å kutte nær dyrestangen, vinkelrett på dyrevegetalaksen og hogge av ca 30 til 40% av blastodermceller.Trykk deretter forsiktig endene sammen for å hjelpe de gjenværende cellene å holde seg tilbake. For eggeplomme, bruk den monterte ledningen til å lage et lite sår i nærheten av vegetalestangen ved å nicking eggmembranen, noe som vil føre til at eggeplommen oser ut i noen minutter, og deretter helbrede. Når eggeplommen slutter å ose ut, bruk en pipette til å flytte embryoet utenfor metylcellulosen i samme tallerken for gjenoppretting.Gjenta blastula og eggeplomme hakking for alle embryoer, og la deretter parabolen være uforstyrret i 30 minutter mens embryoene gjenoppretter. Deretter bruker du en glasspipette til å overføre embryoene til den tidligere tilberedte 35 millimeter glassfatet som inneholder fersk en tredjedel Ringers løsning og plasserer dem i en 28,5 graders Celsius-inkubator for å tillate fullstendig gjenoppretting før du fortsetter med bildebehandling. Etter å ha utført to trinns hakking med blastula og eggeplomme, viste embryoer tilsynelatende normal total morfologi gjennom utviklingsstadiene sammenlignet med kontrollembryoene, annet enn størrelsesforskjell.På den annen side viste blastula-bare hakkede embryoer en særegen morfologi, spesielt i tidligere stadier. Under epiboly hadde embryoene et innsnevret og innrykket utseende. På følgende somite stadium ble midline strukturer funnet å være flatet på mange aksiale nivåer.I senere stadier viste kroppsstrukturene ved siden av eggeplommen, som midten og bakbremmen fortsatt en relativt flat form, muligens på grunn av økt spenning fra den relativt større eggeplommen. Tidsforløp av somitedannelse viste at i både kontroll og hakkede embryoer var størrelsene på somites som ble dannet i senere stadier mindre sammenlignet med de fra tidligere stadier. Også gjennom de somiteformasjonsstadiene hadde hakkede embryoer mindre somites enn de som kontrollerer embryoer.Når de to trinns hakking teknikken ble utført på membran mCherry injisert embryoer, avbildning av ryggmargene på 20 timer etter befruktning viste reduksjon i nevrale rør høyder på grunn av størrelsesreduksjon. To trinns hakking er svært viktig for å oppnå mindre, men ellers normale embryoer med høy effektivitet. Det er viktig å huske å ikke hogge eggeplommen mens du hugger av celler fra blastula.For eggeplomme, gjør en liten såret på den for innholdet å ose ut. Og eggeplommemembranen vil helbrede seg naturlig i riktig buffer. Fordi de hakkede embryoene kan gjenopprettes raskt, kan eventuelle metoder eller analyser påføres normale embryoer etter størrelsesreduksjonsmetoden.Enkelheten og allsidigheten til denne teknikken er veldig kraftig da noen kan introdusere denne teknikken for å studere skaleringsproblem i ethvert vev eller organ i sebrafisk. Vi tror med denne teknikken forskere kan takle skalering problemer i en rekke systemer som har vært uberørt før. Vi har allerede gjort viktige funn i skalering av somite og nevralrør mønster.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Storskala Sebrafisk Embryonic Hjerte Dissection for Transkripsjonell Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Bruk av Teton system for å studere molekylære mekanismer av Sebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocytter spesifikke Ablation i Sebrafisk å studere Galledrevet Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generering av Parabiotic Sebrafisk embryoer ved Kirurgisk Fusion of Utvikling Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture of Murine embryonale metatarsals: en fysiologisk modell av endochondral Forbening

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av transgene genuttrykk i Individuell Netthinnestamfedre i kimære Sebrafisk embryoer å studere Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metode for å karakterisere Embryogenesis i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metoden å studere utviklingen av embryonale kylling vev

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Voksen sebrafisk skade modeller for å studere virkningene av prednisolon i å regenerere benvev

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...