Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

O trabalho foi apoiado pelo programa PRESTO da Agência de ciência e tecnologia do Japão (JPMJPR11AA) e um subsídio nacional de institutos de saúde (R01GM107733).

Todos os procedimentos relacionados aos peixes foram realizados com a aprovação da Comissão de cuidados e uso de animais institucionais (IACUC) na Harvard Medical School.
1. preparação da ferramenta e do reagente
<ol><li>
Faça um loop de arame para cortar embriões
	<ol>
<li>Tomar 20 cm de fio de aço inoxidável que é rígida e não corrosivo com um diâmetro de 40 μm. Loop o fio através de vidro capilar (1,0 mm diâmetro exterior, 0,5 mm diâmetro...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

Historicamente, entre os animais vertebrados, a redução do tamanho tem sido realizada principalmente com embriões de anfíbios, dividindo os embriões ao longo do eixo animal-vegetal em uma fase de blástula12. No entanto, existem principalmente duas diferenças entre os embriões de rã e de zebrafish quando Bisect embriões. Primeiro, no estágio em que os embriões de zebrafish se tornam tolerantes à dividindo (fase blástula), o organizador está localizado em ...

Os cientistas têm sabido por muito tempo que os embriões têm uma habilidade notável de dar forma a proporções constantes do corpo embora o tamanho do embrião possa variar extremamente circunstâncias naturais e experimentais1,2,3. Apesar de décadas de estudos teóricos e experimentais, essa robustez à variação de tamanho, denominada escamação, e seus mecanismos subjacentes permanecem desconhecidos em muitos tecidos e órgãos. Para captar diretamente a dinâmica do sistema em desenvolvimento, estabeleceu-se uma técnica de redução de tamanho simples e reprodutível em zebrafish4, que tem a grande vantagem em imagens ao vivo in vivo5.
Zebrafish serviu como um animal modelo vertebrado para estudar várias disciplinas da biologia, incluindo a biologia do desenvolvimento. Em particular, o zebrafish é ideal para a imagem latente vivo6 de in vivo porque 1) o desenvolvimento pode prosseguir normalmente fora da mãe e do escudo de ovo, e 2) os embriões são transparentes. Além disso, os embriões podem resistir a alguma temperatura e flutuações ambientais, o que permite que eles sejam estudados em condições laboratoriais. Além da perturbação da expressão gênica convencional pela injeção de morfolino emRNA7,8, avanços recentes na tecnologia crispr/Cas9 tornaram a genética reversa em zebrafish altamente eficiente9. Além disso, muitas técnicas clássicas em embriologia, como transplante celular ou cirurgia tecidual, podem seraplicadas 4,10,11.
As técnicas de redução de tamanho foram originalmente desenvolvidas em anfíbios e outros animais não vertebrados12. Por exemplo, no Xenopus laevis, outro modelo popular de animais vertebrados, a bisection ao longo do eixo animal-vegetal na fase blástula pode produzir embriões com redução de tamanho12,13. Entretanto, em nossas mãos esta aproximação de uma etapa conduz aos embriões dorsalizados ou ventralized no zebrafish, presumivelmente porque os determinantes dorsais são distribuídos desigual e um não pode saber sua localização da morfologia dos embriões. Aqui nós demonstramos uma técnica de corte de duas etapas alternativa para o zebrafish que produz embriões normalmente tornando-se mas menores. Com esta técnica, as pilhas são removidas primeiramente do pólo animal, uma região das pilhas ingênuas que faltam na atividade do organizador. Para equilibrar a quantidade de gemas e células, que é importante para a Epibolia e posterior morfogênese, gema é então removida. Aqui, detalhamos este protocolo e fornecemos dois exemplos de invariância de tamanho na formação de padrões; formação somita e padronização do tubo neural ventral. Combinado com a imagem latente quantitativa, nós utilizamos a técnica da redução do tamanho para examinar como os tamanhos dos somitos e do tubo neural são afetados em embriões reduzidos tamanho.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

No processo de desenvolvimento, os embriões exibem uma habilidade notável de combinar seu teste padrão do corpo a seu tamanho de corpo; sua proporção corporal é mantida mesmo em embriões que são maiores ou menores, dentro de certos limites. Embora este fenômeno de escamação tenha atraído a atenção por mais de um século, a compreensão dos mecanismos subjacentes tem sido limitada, devido em parte à falta de descrição quantitativa da dinâmica do desenvolvimento em embriões de tamanhos variados. Para superar esta limitação, nós desenvolvemos uma técnica nova para reduzir cirùrgica o tamanho de embriões do zebrafish, que têm grandes vantagens para a imagem latente vivo in vivo. Nós demonstramos que após a remoção equilibrada das pilhas e da gema no estágio da blástula em etapas separadas, os embriões podem rapidamente recuperar-se as circunstâncias direitas e tornar-se em embriões menores mas de outra maneira normais. Desde que esta técnica não exige o equipamento especial, é facilmente adaptável, e pode ser usada para estudar uma escala larga de problemas de escamação, incluindo o robustez do patterning mediado morfogênico.

A redução do volume de yolk é importante para a morfologia normal Como descrito recentemente em Almuedo-Castillo et al.17, a redução do tamanho dos embriões pode ser alcançada sem reduzir o volume de gema. Para comparação com e sem redução do volume de gemas, realizamos tanto o corte em duas etapas (tanto blástula quanto gema) e o corte somente de blástula (Figura 2 e filme suplementar 1). Embriões picados em duas eta...

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Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

Aqui, nós descrevemos um método para reduzir o tamanho de embriões do zebrafish sem interromper processos desenvolventes normais. Esta técnica permite o estudo da escala do teste padrão e do robustez desenvolvente de encontro à mudança do tamanho.

Redução cirúrgica do tamanho do zebrafish para o estudo da escala padrão embrionária

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Embora o dimensionamento seja um dos atributos universais e fundamentais dos sistemas de desenvolvimento, os mecanismos subjacentes não têm sido compreendidos em muitos órgãos e tecidos. A técnica de redução de tamanho do zebrafish apresentada neste vídeo avançará sua compreensão dos mecanismos subjacentes aos processos dinâmicos de dimensionamento. As vantagens de trabalhar com zebrafish são que é fácil realizar imagens vivas, genética e análise quantitativa.Nossa técnica também é muito simples e fácil de aplicar sem qualquer equipamento especializado ou treinamento intensivo. A saúde dos embriões é a chave para o sucesso com essa técnica. Use peixes jovens como pais e tenha cuidado para minimizar os danos removendo os acordes.E também brincar com o tamanho da ferida na gema, e quantas células são removidas. Como os embriões que usamos são muito jovens e frágeis, eles precisam ser manuseados com muito cuidado na transferência e corte. Ao mesmo tempo, precisa ser rápido para que o procedimento possa ser feito na janela de tempo certa de desenvolvimento.A demonstração visual pode dar uma boa noção de como produzir embriões menores de forma eficaz. Para fazer um laço de arame para cortar embriões, alimente um fio de aço inoxidável rígido e não corrosivo de 20 centímetros através de um capilar de vidro, fazendo uma pequena alça de um milímetro de comprimento no topo. Coloque uma pequena gota de esmalte claro na ponta do capilar de classe, entre o capilar e o laço de arame para mantê-lo no lugar, certificando-se de não colocar nenhum esmalte na porção do laço, pois pode danificar os embriões.E depois deixe secar. Use fita de laboratório para anexar o capilar de vidro com o laço em um pauzinho de madeira, deixando cerca de dois centímetros e meio do capilar de vidro que se estende além do pauzinho para que a parte do pauzinho da ferramenta não mergulhe na água mais tarde. Em uma placa de Petri de vidro de 100 milímetros com uma espátula de plástico, espalhe aproximadamente 0,5 mililitros de celulose de 2%de metila perto do centro da parte inferior fina e uniformemente até uma espessura de aproximadamente 0,5 milímetros.Despeje aproximadamente 30 mililitros da solução de um terço ringer para o lado do prato, e deixe-o se espalhar para o resto do prato e cobrir a celulose de metila. Coloque embriões anteriormente descorados na célula 256 para um estágio de célula K em celulose de 2% de metila, certificando-se de que os embriões estão orientados para o lado. Para cortar blastula, use o laço de arame para cortar perto do polo animal, perpendicular ao eixo vegetal animal e cortar aproximadamente 30 a 40% das células blastoderm.Em seguida, bata suavemente nas extremidades para ajudar as células restantes a ficar para trás. Para a gema, use o fio montado para fazer uma pequena ferida perto do polo vegetal cortando a membrana do ovo, o que fará com que a gema escorrer por alguns minutos, e depois curar. Quando a gema parar de escorrer, use uma pipeta para mover o embrião para fora da celulose de metila no mesmo prato para recuperação.Repita a blastula e a gema cortando para todos os embriões e deixe o prato intacto por 30 minutos enquanto os embriões se recuperam. Em seguida, use uma pipeta de vidro para transferir os embriões para o prato de vidro de 35 milímetros previamente preparado contendo a solução de Ringer de um terço fresco e colocá-los em uma incubadora de 28,5 graus Celsius para permitir a recuperação completa antes de continuar com a imagem. Depois de realizar dois cortes de duas etapas com blastula e gema, os embriões mostraram morfologia global aparentemente normal em todos os estágios de desenvolvimento em comparação com os embriões de controle, além da diferença de tamanho.Por outro lado, embriões picados somente por blastula mostraram uma morfologia peculiar, especialmente em estágios anteriores. Durante a epiboly, os embriões tinham uma aparência constrito e recuada. No estágio somite seguinte, as estruturas de linha média foram encontradas achatadas em muitos níveis axiais.Em estágios posteriores, as estruturas corporais adjacentes à gema, como o cérebro médio e traseiro, ainda apresentavam uma forma relativamente achatada, possivelmente devido ao aumento da tensão da gema relativamente maior. A imagem do lapso de tempo da formação de somite mostrou que, tanto no controle quanto nos embriões picados, os tamanhos de somites que foram formados em estágios posteriores foram menores em comparação com os de estágios anteriores. Além disso, ao longo dos estágios de formação de somite, os embriões picados tinham somitas menores do que os embriões de controle.Quando a técnica de corte de duas etapas foi realizada em embriões injetados por membrana mCherry, a imagem de suas medulas espinhais em 20 horas após a fertilização mostrou redução nas alturas dos tubos neurais devido à redução de tamanho. Dois passos de corte é muito importante para obter embriões menores, mas de outra forma normais com alta eficiência. É importante lembrar de não cortar a gema enquanto corta as células da blastula.Para a gema, faça uma pequena ferida sobre ela para o conteúdo escorrer. E a membrana da gema vai curar naturalmente no buffer adequado. Como os embriões picados podem ser recuperados rapidamente, qualquer método ou análise pode ser aplicado a embriões normais pode ser realizado seguindo o método de redução de tamanho.A simplicidade e versatilidade dessa técnica é muito poderosa, pois qualquer um poderia introduzir essa técnica para estudar o problema de dimensionamento em qualquer tecido ou órgão em zebrafish. Acreditamos que com essa técnica os pesquisadores podem enfrentar problemas de dimensionamento em uma variedade de sistemas que já foram intocados antes. Já fizemos descobertas importantes no dimensionamento da fuligem e da padronização do tubo neural.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Biologia do Desenvolvimento

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultura de murino embrionárias Metatarsos: Um modelo fisiológico de Endocondral ossificação

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...