Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

El trabajo fue apoyado por el programa PRESTO de la Agencia de ciencia y tecnología de Japón (JPMJPR11AA) y una subvención de los institutos nacionales de salud (R01GM107733).

Todos los procedimientos relacionados con el pescado se llevaron a cabo con la aprobación del Comité institucional de atención y uso de animales (IACUC) en la escuela de medicina de Harvard.
1. preparación de herramientas y reactivos
<ol><li>
Haga un lazo de alambre para picar los embriones
	<ol>
<li>Tomar 20 cm de alambre de acero inoxidable rígido y no corrosivo con un diámetro de 40 μm. Conecte el alambre a través del capilar de vidrio (diámetro ...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

Históricamente, entre los animales vertebrados, la reducción de tamaño se ha realizado principalmente utilizando embriones de anfibios, mediante la bisección de los embriones a lo largo del eje animal-vegetal en una etapa de blástula12. Sin embargo, existen principalmente dos diferencias entre los embriones de rana y pez cebra cuando biseccionamos embriones. En primer lugar, en la etapa en que los embriones de pez cebra se vuelven tolerantes de bisección (blástu...

Los científicos han sabido desde hace tiempo que los embriones tienen una capacidad notable para formar proporciones corporales constantes, aunque el tamaño del embrión puede variar grandemente tanto en condiciones naturales como experimentales1,2,3. A pesar de décadas de estudios teóricos y experimentales, esta robustez a la variación de tamaño, denominada escalado, y sus mecanismos subyacentes siguen siendo desconocidos en muchos tejidos y órganos. Con el fin de captar directamente la dinámica del sistema en desarrollo, establecimos una técnica de reducción de tamaño reproducible y simple en el pez cebra4, que tiene la gran ventaja de la imagen en vivo in vivo5.
El pez cebra ha servido como un animal vertebrado modelo para estudiar múltiples disciplinas de la biología, incluyendo la biología del desarrollo. En particular, el pez cebra es ideal para imágenes en vivo in vivo6 porque 1) el desarrollo puede proceder normalmente fuera de la madre y la cáscara de huevo, y 2) los embriones son transparentes. Además, los embriones pueden soportar algunas fluctuaciones de temperatura y ambientales, lo que les permite ser estudiados en condiciones de laboratorio. También, además de la perturbación convencional de la expresión génica por morfolinos y mRNA injection7,8, los avances recientes en la tecnología CRISPR/Cas9 han hecho que la genética inversa en el pez cebra altamente eficiente9. Además, muchas técnicas clásicas en la embriología, como el trasplante de células o la cirugía de tejidos se pueden aplicar4,10,11.
Las técnicas de reducción de tamaño se desarrollaron originalmente en anfibios y otros animales no vertebrados12. Por ejemplo, en Xenopus laevis, otro modelo animal de vertebrado popular, la bisección a lo largo del eje animal-vegetal en blástula Stage puede producir embriones reducidos de tamaño12,13. Sin embargo, en nuestras manos este enfoque de un solo paso da lugar a embriones dorsalizados o ventralizados en el pez cebra, presumiblemente porque los determinantes dorsales se distribuyen de manera desigual y uno no puede conocer su localización de la morfología de los embriones. Aquí demostramos una técnica alternativa de troceo de dos pasos para el pez cebra que produce embriones normalmente en desarrollo pero más pequeños. Con esta técnica, las células se eliminan por primera vez del polo animal, una región de células ingenuas que carecen de actividad organizadora. Para equilibrar la cantidad de yemas y células, que es importante para la morfogénesis epibolia y posterior, la yema se retira. Aquí, detallamos este protocolo y proporcionamos dos ejemplos de invarianza de tamaño en la formación de patrones; formación de somita y patrón de tubo neural ventral. En combinación con la imagen cuantitativa, utilizamos la técnica de reducción de tamaño para examinar el modo en que los tamaños de las somitas y el tubo neural se ven afectados por el tamaño de los embriones reducidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

En el proceso de desarrollo, los embriones exhiben una notable capacidad para igualar su patrón corporal con su tamaño corporal; su proporción corporal se mantiene incluso en embriones que son más grandes o más pequeños, dentro de ciertos límites. Aunque este fenómeno de escala ha atraído la atención durante más de un siglo, la comprensión de los mecanismos subyacentes ha sido limitada, debido en parte a la falta de una descripción cuantitativa de la dinámica del desarrollo en embriones de tamaños variados. Para superar esta limitación, desarrollamos una nueva técnica para reducir quirúrgicamente el tamaño de los embriones de pez cebra, que tienen grandes ventajas para la imagen en vivo in vivo. Demostramos que después de la eliminación equilibrada de las células y la yema en la fase blástula en pasos separados, los embriones pueden recuperarse rápidamente bajo las condiciones adecuadas y convertirse en embriones más pequeños pero de otro modo normales. Dado que esta técnica no requiere equipo especial, es fácilmente adaptable y se puede utilizar para estudiar una amplia gama de problemas de escalado, incluida la robustez de los patrones mediada por morfogeno.

La reducción del volumen de Yolk es importante para la morfología normal Como se ha descrito recientemente en Almuedo-Castillo et al.17, la reducción del tamaño de los embriones puede lograrse sin reducir el volumen de la yema. Para comparar con y sin la reducción del volumen de la yema, realizamos tanto el picado de dos pasos (tanto blástula como yema) y el picado de blástula (figura 2 y película complementaria 1). Los emb...

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Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

Aquí describimos un método para reducir el tamaño de los embriones de pez cebra sin interrumpir los procesos normales de desarrollo. Esta técnica permite el estudio de la escala del patrón y la robustez del desarrollo contra el cambio de tamaño.

Reducción de tamaño quirúrgico del pez cebra para el estudio de la escala de patrón embrionario

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Aunque la escala es uno de los atributos universales y fundamentales de los sistemas de desarrollo, los mecanismos subyacentes no se han entendido en muchos órganos y tejidos. La técnica de reducción de tamaño del pez cebra presentada en este vídeo hará avanzar su comprensión de los mecanismos subyacentes a los procesos de escalado dinámico. Las ventajas de trabajar con peces cebra son que es fácil realizar imágenes en vivo, genética y análisis cuantitativo.Nuestra técnica también es muy simple y fácil de aplicar sin ningún equipo especializado o entrenamiento intensivo. La salud de los embriones es la clave para el éxito con esta técnica. Utilice peces jóvenes como padres y tenga cuidado de minimizar el daño mediante la eliminación de las coros.Y también jugar en el tamaño de la herida en la yema, y cuántas células se eliminan. Como los embriones que utilizamos son muy jóvenes y frágiles, deben manipularse con mucho cuidado al transferir y cortar. Al mismo tiempo, debe ser rápido para que el procedimiento se pueda realizar en el período de tiempo adecuado para el desarrollo.La demostración visual puede dar una buena idea de cómo producir embriones más pequeños de manera efectiva. Para hacer un lazo de alambre para el corte de embriones, alimentar 20 centímetros de largo de alambre de acero inoxidable rígido y no corrosivo a través de un capilar de vidrio, haciendo un pequeño bucle de un milímetro de largo en la parte superior. Coloque una pequeña gota de esmalte de uñas transparente en la punta del capilar de la clase, entre el capilar y el lazo de alambre para mantenerlo en su lugar, asegurándose de no obtener ningún esmalte de uñas en la porción del lazo, ya que puede dañar los embriones.Y luego déjalo secar. Utilice cinta de laboratorio para fijar el capilar de vidrio con el lazo en un palillo de madera, dejando alrededor de dos centímetros y medio del capilar de vidrio que se extiende más allá del palillo para que la parte del palillo de la herramienta no se sumerja en el agua más tarde. En un plato Petri de vidrio de 100 milímetros con una espátula de plástico, esparce aproximadamente 0,5 mililitros de 2% de celulosa de metilo cerca del centro de la parte inferior de forma fina y uniforme hasta un grosor de aproximadamente 0,5 milímetros.Vierta aproximadamente 30 mililitros de una tercera solución de Ringer al lado del plato, y permita que se extienda sobre el resto del plato y cubra la celulosa metilo. Coloque embriones previamente des-coreionados en la etapa de 256 células a una etapa de la célula K en 2%celulosa de metilo, asegurándose de que los embriones estén orientados a su lado. Para cortar la blastula, utilice el lazo de alambre para cortar cerca del poste del animal, perpendicular al eje vegetal animal y cortar aproximadamente 30 a 40% de las células de blastodermo.Luego toque suavemente los extremos juntos para ayudar a que las células restantes se peguen hacia atrás. Para la yema, utilice el alambre montado para hacer una pequeña herida cerca del poste vegetal mediante la mordedura de la membrana del huevo, lo que hará que la yema se restete durante unos minutos, y luego sane. Cuando la yema deje de rezumar, usa una pipeta para mover el embrión fuera de la celulosa metilo en el mismo plato para su recuperación.Repita la blastula y el corte de yema para todos los embriones, y luego deje el plato sin perturbar durante 30 minutos mientras los embriones se recuperan. A continuación, utilice una pipeta de vidrio para transferir los embriones al plato de vidrio de 35 milímetros previamente preparado que contiene la solución fresca de un tercio de Ringer y colóquelos en una incubadora de 28,5 grados Celsius para permitir una recuperación completa antes de continuar con la toma de imágenes. Después de realizar un corte de dos pasos con blastula y yema, los embriones mostraron una morfología general aparentemente normal a lo largo de las etapas del desarrollo en comparación con los embriones de control, aparte de la diferencia de tamaño.Por otro lado, los embriones picados sólo por blastula mostraron una morfología peculiar, especialmente en etapas anteriores. Durante la epiboly, los embriones tenían una apariencia constreñida e indentada. En la siguiente etapa de somita, se encontró que las estructuras de línea media se aplanaban a muchos niveles axiales.En etapas posteriores, las estructuras del cuerpo adyacentes a la yema, como el cerebro medio y el trasero todavía mostraban una forma relativamente aplanada, posiblemente debido al aumento de la tensión de la yema relativamente más grande. Las imágenes de lapso de tiempo de la formación de somita mostraron que tanto en embriones de control como picados, los tamaños de somitas que se formaron en etapas posteriores eran más pequeños en comparación con los de etapas anteriores. Además, a lo largo de las etapas de formación de somitas, los embriones picados tenían somitas más pequeñas que las de los embriones de control.Cuando se realizó la técnica de corte de dos pasos en embriones inyectados con mCherry de membrana, la toma de imágenes de sus médulas espinales a las 20 horas después de la fertilización mostró una reducción en las alturas del tubo neural debido a la reducción del tamaño. El corte de dos pasos es muy importante para obtener embriones más pequeños pero normales con alta eficiencia. Es importante recordar no cortar la yema mientras corta las células de la blastula.Para la yema, haz una pequeña herida en ella para que el contenido se restete. Y la membrana de la yema sanará naturalmente en el tampón adecuado. Debido a que los embriones picados se pueden recuperar rápidamente, cualquier método o análisis se puede aplicar a embriones normales se puede realizar siguiendo el método de reducción de tamaño.La simplicidad y versatilidad de esta técnica es muy potente ya que cualquiera podría introducir esta técnica para estudiar el problema de escalado en cualquier tejido u órgano en el pez cebra. Creemos que con esta técnica los investigadores pueden abordar los problemas de escalado en una variedad de sistemas que han sido intactos antes. Ya hemos hecho descubrimientos importantes en la escala de la somita y el patrón del tubo neural.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultura de murinos embrionarias Metatarsianos: Un modelo fisiológico de osificación endocondral

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...