Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Arbetet stöddes av PRESTO-programmet för Japans vetenskaps-och teknik byrå (JPMJPR11AA) och ett nationellt institut för hälso bidrag (R01GM107733).

Alla fiskrelaterade förfaranden genomfördes med godkännande av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC) vid Harvard Medical School.
1. förberedelse av verktyg och reagens
<ol><li>
Gör en tråd slinga för att hacka embryon
	<ol>
<li>Ta 20 cm rost fritt stål tråd som är styv och icke-frätande med en diameter på 40 μm. Slinga tråden genom i glas kapillär (1,0 mm ytterdiameter, 0,5 mm innerdiameter, ingen glöd tråden),...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

Historiskt har, bland ryggradsdjur, storleks reduktion huvudsakligen utförts med hjälp av amfibiska embryon, genom att de embryon som finns längs den animaliska vegetala axeln har använts på ett blastula Stadium12. Men det finns främst två skillnader mellan groda och zebra fisk embryon när vi Tudela embryon. Först, vid det skede då zebra fisk embryon blir toleranta av bisecting (blastula skede), är arrangören ligger i ett begränsat område av blastula marg...

Forskarna har länge känt till att embryon har en anmärknings värd förmåga att bilda konstanta kropps proportioner även om embryots storlek kan variera kraftigt både under naturliga och experimentella förhållanden1,2,3. Trots årtionden av teoretiska och experimentella studier är denna robusthet för storleks variation, kallad skalning, och dess bakomliggande mekanismer fortfarande okänd i många vävnader och organ. För att direkt fånga dynamiken i utvecklings systemet, etablerade vi en reproducerbar och enkel storlek reducerings teknik i zebra fiskar4, som har den stora fördelen i in vivo Live Imaging5.
Zebrafish har fungerat som en modell ryggradsdjur att studera flera discipliner av biologi, inklusive utvecklings bio Logi. I synnerhet är zebra fiskar idealisk för in vivo Live Imaging6 eftersom 1) utveckling kan fortsätta normalt utanför mamman och ägget skalet, och 2) embryona är transparenta. Dessutom kan embryona motstå vissa temperatur-och miljö variationer, vilket gör det möjligt att studera dem under laboratorie förhållanden. Dessutom, förutom konventionella gen uttryck störning av morfolino och mRNA injektion7,8, senaste framstegen i crispr/Cas9 Technology har gjort omvänd genetik i zebra fiskar mycket effektiv9. Dessutom kan många klassiska tekniker i embryologi, såsom cell transplantation eller vävnads kirurgi appliceras4,10,11.
Storleks reducerings tekniker utvecklades ursprungligen i groddjur och andra icke-ryggradsdjur12. Till exempel, i Xenopus laevis, en annan populär ryggradsdjur modell, bisektion längs djur-Vegetal axel på blastula Stage kan producera storlek-reducerade embryon12,13. Men i våra händer detta ett steg tillvägagångs sätt resulterar i dorsalized eller ventralized embryon i zebra fisk, förmodligen eftersom rygg determinanter fördelas ojämnt och man kan inte veta deras lokalisering från morfologi av embryon. Här demonstrerar vi en alternativ tvåstegs hacknings teknik för zebra fiskar som producerar normalt utvecklade men mindre embryon. Med denna teknik tas cellerna först bort från djur staven, en region av naiva celler som saknar organisatörsaktivitet. För att balansera mängden äggula och celler, vilket är viktigt för epiboly och efterföljande morfogenes, är äggula sedan bort. Här, vi detalj detta protokoll och ge två exempel på storlek inavvikelse i mönster bildning; somite formation och ventrala neuralrör mönster. Kombinerat med kvantitativ avbildning, utnyttjade vi storleks reducerings tekniken för att undersöka hur storleken på somiter och neuralrör påverkas i storlek reducerade embryon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

I utvecklings processen, embryon uppvisar en anmärknings värd förmåga att matcha deras kropps mönster till sin kropps storlek; deras kropps andel bibehålls även i embryon som är större eller mindre, inom vissa gränser. Även om detta fenomen av skalning har uppmärksam Mats i över ett århundrade, att förstå de bakomliggande mekanismerna har begränsats, på grund av en brist på kvantitativ beskrivning av utvecklingsdynamik i embryon av varierande storlek. För att övervinna denna begränsning, vi utvecklat en ny teknik för att kirurgiskt minska storleken på zebra fiskar embryon, som har stora fördelar för in vivo Live Imaging. Vi visar att efter bal anse rad borttagning av celler och äggula på blastula scenen i separata steg, embryon kan snabbt återhämta sig under rätt betingelser och utvecklas till mindre men annars normala embryon. Eftersom denna teknik inte kräver särskild utrustning, är det lätt anpassningsbar, och kan användas för att studera ett brett spektrum av skalnings problem, inklusive robusthet av morfogen medierad mönstrande.

Volym reduktion av äggula är viktig för normal morfologi Som nyligen beskrivits i Almuedo-Castillo et al.17, storlek minskning av embryon kan uppnås utan att minska äggula volym. Att jämföra med och utan äggula volym reduktion, utförde vi både två-stegs hackning (både blastula och äggula) och blastula-bara hugga (figur 2 och kompletterande film 1). Två steg hackade embryon visade till synes normala övergripande morfo...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

Här beskriver vi en metod för att minska storleken på zebra fiskar embryon utan att störa normala utvecklings processer. Denna teknik gör det möjligt att studera mönster skalning och utveckling robusthet mot storleks ändring.

Kirurgisk storleks reduktion av zebra fisk för studiet av embryonala mönster skalning

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Även om skalning är en av de universella och grundläggande attributen för utvecklingssystem, har de underliggande mekanismerna inte förståtts i många organ och vävnader. Storleksminskningstekniken av zebrafisk som presenteras i den här videon kommer att främja din förståelse av mekanismer som ligger bakom dynamiska skalningsprocesser. Fördelar med att arbeta med zebrafisk är att det är lätt att utföra live avbildning, genetik, och kvantitativ analys.Vår teknik är också mycket enkel och lätt att tillämpa utan någon specialiserad utrustning eller intensiv träning. Embryonas hälsa är nyckeln till framgång med denna teknik. Använd ung fisk som föräldrar och var försiktig för att minimera skadan genom att ta bort chorions.Och även leka i storleken på såret på äggulan, och hur många celler tas bort. Eftersom de embryon vi använder är mycket unga och ömtåliga måste de hanteras mycket noggrant vid överföring och hackning. Samtidigt måste det vara snabbt så att förfarandet kan göras i rätt tid fönster utveckling.Visuell demonstration kan ge en god känsla för hur man producerar mindre embryon effektivt. För att göra en trådslinga för embryohuggning, mata 20 centimeter lång styv och icke-korrosiv rostfri ståltråd genom en glas kapillär, vilket gör en liten, en millimeter lång slinga överst. Placera en liten droppe klart nagellack på toppen av klassens kapillär, mellan kapillären och trådslingan för att hålla den på plats, se till att inte få något nagellack på slingan delen, eftersom det kan skada embryon.Och låt den då torka. Använd lab tejp för att fästa glaset kapillär med slingan på en trä chopstick, lämnar cirka två och en halv centimeter av glaset kapillär sträcker sig bortom chopstick så att chopstick delen av verktyget inte doppa i vattnet senare. I en 100 millimeters glas Petriskål med en plastspatel, sprids cirka 0,5 milliliter av 2%metylcellulosa nära mitten av botten tunt och jämnt till en tjocklek av cirka 0,5 millimeter.Häll ungefär 30 milliliter av en tredjedel Ringers lösning på sidan av skålen, och låt den spridas på resten av skålen och täck metylcellulosa. Placera tidigare de-chorionated embryon på 256 cell till en K cell skede på 2%metylcellulosa, se till att embryona är orienterade på sin sida. För att hugga blastula, använd trådslingan för att skära nära djurpolen, vinkelrätt mot djurets vegetal axel och hugga av cirka 30 till 40%av blastoderm celler.Sedan försiktigt knacka ändarna tillsammans för att hjälpa de återstående cellerna hålla tillbaka. För äggula, använd den monterade tråden för att göra ett litet sår nära vegetal polen genom att sno äggmembranet, vilket kommer att orsaka äggulan att sippra ut i några minuter, och sedan läka. När äggulan slutar sippra ut, använd en pipett för att flytta embryot utanför metylcellulosan i samma skål för återhämtning.Upprepa blastula och gulor hugga för alla embryon, och sedan lämna skålen ostört i 30 minuter medan embryona återhämta sig. Använd sedan en glaspipett för att överföra embryona till den tidigare beredda 35 millimeters glasfat som innehåller färska en tredjedel Ringers lösning och placera dem i en 28,5 grader Celsius inkubator för att möjliggöra fullständig återhämtning innan du fortsätter med avbildning. Efter att ha utfört två steg hugga med blastula och äggula, embryon visade till synes normala övergripande morfologi i hela utvecklingsstadier jämfört med kontroll embryon, annat än storlek skillnad.Å andra sidan visade blastula-bara hackade embryon en märklig morfologi, särskilt i tidigare skeden. Under epiboly hade embryona en trängd och indragen utseende. Vid följande somite skede konstaterades mittlinjen strukturer vara tillplattad på många axial nivåer.I senare skeden visade kroppsstrukturerna intill äggulan, såsom mitten och hindbrain fortfarande en relativt tillplattad form, möjligen på grund av ökad spänning från den relativt större äggulan. Time lapse imaging av somite bildandet visade att i både kontroll och hackade embryon, var storleken på somites som bildades i senare skeden mindre jämfört med de från tidigare stadier. Också, under hela somitbildning stadier, hackade embryon hade mindre somiter än de i kontroll embryon.När de två steg hugga tekniken utfördes på membran mCherry injiceras embryon, bildframställning av deras ryggmärg vid 20 timmar efter befruktning visade minskning av neurala rör höjder på grund av att storleken minskning. Två steg hugga är mycket viktigt att få mindre men annars normala embryon med hög effektivitet. Det är viktigt att komma ihåg att inte hacka äggulan medan du hugger av celler från blastula.För äggula, gör en liten sår på den för innehållet att sippra ut. Och äggulan membranet kommer att läka upp naturligt i rätt buffert. Eftersom de hackade embryona kan återvinnas snabbt kan alla metoder eller analyser appliceras på normala embryon utföras efter storleksreduceringsmetoden.Enkelheten och mångsidigheten i denna teknik är mycket kraftfull som vem som helst skulle kunna införa denna teknik för att studera skalning problem i någon vävnad eller organ i zebrafisk. Vi tror att forskare med denna teknik kan ta itu med skalningsproblem i en mängd olika system som har varit orörda tidigare. Vi har redan gjort viktiga upptäckter i skalning av somite och neuralrörsmönster.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Storskalig Zebrafish Embryonala Hjärta Dissection för Transkriptionell Analys

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Användning av Teton system att studera molekylära mekanismer Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyte specifika Ablation i Zebrafish att studera gallan driven leverregenerering

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generation Parabiotic Zebrafish embryon genom kirurgisk Fusion utveckla Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Odling av Murina embryonala fotbenen: En fysiologisk modell av endokondral benbildning

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metod för att karaktärisera embryogenes i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metod att studera utvecklingen av embryonala kyckling vävnader

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Adult zebrafiskar skada modeller för att studera effekterna av prednisolon i regenererande benvävnad

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...