Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Çalışma, Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (JPMJPR11AA) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (R01GM107733) PRESTO programı tarafından destekleniyordu.

Balık ile ilgili tüm prosedürler Harvard Tıp fakültesinde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıAVUC) onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. alet ve reaktif hazırlama
<ol><li>
Embriyo kesmek için bir tel döngü olun
	<ol>
<li>40 μm çapı ile sert ve korozif olmayan 20 cm 'lik paslanmaz çelik tel alın. Kabloyu cam kapiller (1,0 mm dış çapı, 0,5 mm iç çapı, hiçbir filament), üst kısmında küçük bir döngü yapma (döng...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

Tarihsel olarak, omurgalı hayvanlar arasında, Boyut azaltma genellikle bir Blastula aşamasında hayvan-bitkisel eksen boyunca embriyolar bisecting tarafından, amfitiyomer embriyo kullanılarak yapılmıştır12. Ancak, biz embriyolar şehri ikiye bölüyor zaman kurbağa ve zebra balığı embriyo arasında ağırlıklı olarak iki fark vardır. İlk olarak, zebra balığı embriyoları bisi (Blastula aşaması) toleranslı olduğunda sahnede, organizatör Blastula...

Bilim adamları uzun embriyo boyutu büyük ölçüde hem doğal ve deneysel koşullar altında değişebilir rağmen embriyoların sürekli vücut oranlarını oluşturmak için olağanüstü bir yeteneği var bilinen1,2,3. Onlarca yıl süren teorik ve deneysel çalışmalara rağmen, boyutsal varyasyona bu sağlamlık, ölçeklenme ve altta yatan mekanizmalar birçok doku ve organda bilinmiyor. Gelişmekte olan sistemin dinamiklerini doğrudan yakalamak için, zebra balığı4' te, in vivo canlı görüntüleme5' te büyük bir avantaja sahip olan tekrarlanabilir ve basit bir boyut azaltma tekniği kurduk.
Zebrafish, gelişim biyolojisi de dahil olmak üzere birden fazla biyoloji disiplininin çalışması için bir model vertebrat hayvanı olarak görev yapmıştır. Özellikle, zebra balığı in vivo canlı görüntüleme için idealdir6 çünkü 1) geliştirme normal anne ve yumurta kabuğu dışında devam edebilir, ve 2) embriyo saydamdır. Buna ek olarak, embriyolar bazı sıcaklık ve çevresel dalgalanmalara dayanabilir, bu da laboratuar koşullarında incelenmesini sağlar. Ayrıca, morpholino ve mRNA enjeksiyon7,8, Crispr/Cas9 teknolojisindeki son gelişmeler tarafından konvansiyonel gen ifadesi pertürasyon ek olarak yüksek verimli zebra balığı ters genetik yaptı9. Ayrıca, Embriyoloji birçok klasik teknikleri, hücre transplantasyonu veya doku cerrahisi gibi uygulanabilir4,10,11.
Boyut azaltma teknikleri ilk olarak amfitbiya ve diğer omurga dışı hayvanlar12' de geliştirilmiştir. Örneğin, Xenopus laevis, başka bir popüler omurgası hayvan modeli, blastula aşamasında hayvan-bitkisel eksen boyunca şekilde bölünmüş boyutu düşük embriyo üretebilir12,13. Ancak, bizim elimizde bu tek adımlı yaklaşım zebrafish içinde dorsalized veya ventriselleştirilmiş embriyolar, muhtemelen dorsal belirleyicileri düzensiz dağıtılır ve bir embriyolar morfolojisi kendi yerelleştirme bilmiyorum çünkü. Burada, normalde gelişmekte olan ama daha küçük embriyolar üreten zebra balığı için alternatif iki adımlı bir kesme tekniği gösterilmektedir. Bu teknik ile, hücreler ilk hayvan direği, organizatördeki aktivite eksikliği naif hücrelerin bir bölge kaldırılır. Epiboly ve sonraki morfojenler için önemli olan sarısı ve hücrelerin miktarını dengelemek için, sarısı daha sonra kaldırılır. Burada, bu protokolü ayrıntılarıyla ve desen oluşumunda boyut invaryans iki örnek sağlamak; Somit oluşumu ve ventral nöral tüp deseni. Nicel görüntüleme ile birlikte, Boyut azaltma tekniği, Somitlerin ve nöral tüp boyutlarının azaltılmış embriyolar boyutu nasıl etkilendiğini incelemek için kullandık.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

Gelişimsel süreçte, embriyolar vücut boyutlarına karşı vücut desenlerini eşleştirmek için dikkat çekici bir yetenek sergiler; vücut orantısı, belirli sınırlar içinde daha büyük veya daha küçük olan embriyolarda bile korunur. Ölçekleme bu fenomen bir yüzyıl boyunca dikkat çekti rağmen, temel mekanizmaları anlamak, çeşitli boyutlarda embriyo gelişimsel dinamiklerin nicel açıklaması eksikliği nedeniyle sınırlı olmuştur. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, in vivo canlı görüntüleme için büyük avantajlara sahip olan zebra balığı embriyolarının boyutunu cerrahi olarak azaltmak için yeni bir teknik geliştirdik. Biz ayrı adımlarla Blastula aşamasında hücrelerin ve sarısı dengeli kaldırılması sonra, embriyo hızlı bir şekilde doğru koşullar altında kurtarabilirsiniz ve daha küçük ama başka normal embriyolar içine geliştirmek olduğunu göstermektedir. Bu teknik özel ekipman gerektirmeyen bu yana, kolayca uyarlanabilir ve morphogen aracılı desen sağlamlık da dahil olmak üzere, ölçekleme sorunları geniş bir yelpazede çalışmak için kullanılabilir.

Sarısı hacim azaltma normal morfoloji için önemlidir Son zamanlarda Almuedo-Castillo ve al.17' de açıklandığı gibi, embriyoların boyutu azaltılması, sarısı hacmini azaltmadan elde edilebilir. Sarısı hacim azaltma ile karşılaştırmak için, hem iki adımlı kesme (hem Blastula hem de sarısı) ve Blastula sadece doğrama (Şekil 2 ve ek film 1) gerçekleştirdik. İki adımlı doğranmış embriyo, gelişimsel aş...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

Burada, biz normal gelişimsel süreçleri bozmadan zebra balığı embriyo boyutunu azaltmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, boyut değişikliklere karşı desen ölçekleme ve gelişimsel sağlamlık etüdünü sağlar.

Embriyonik desen ölçekleme çalışma için zebrafish cerrahi boyutu azaltma

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Ölçekleme gelişim sistemlerinin evrensel ve temel özelliklerinden biri olmasına rağmen, altta yatan mekanizmalar birçok organ ve dokuda anlaşılamamıştır. Bu videoda sunulan zebra balığının boyut küçültme tekniği, dinamik ölçekleme süreçlerinin altında yatan mekanizmaları anlamanızı sağlayacaktır. Zebra balıkları ile çalışmanın avantajları canlı görüntüleme, genetik ve kantitatif analiz yapmak kolay olmasıdır.Tekniğimiz de çok basit ve herhangi bir özel ekipman veya yoğun eğitim olmadan uygulamak kolaydır. Embriyoların sağlığı bu teknikle başarının anahtarıdır. Anne olarak genç balık kullanın ve chorions kaldırarak hasarı en aza indirmek için dikkatli olun.Ve ayrıca sarısı üzerindeki yaranın boyutunda oynayın, ve kaç hücre çıkarılır. Kullandığımız embriyolar çok genç ve kırılgan olduğundan, transfer ve doğrama yaparken çok dikkatli bir şekilde ele almalısınız. Aynı zamanda, prosedür geliştirme doğru zaman penceresinde yapılabilir, böylece hızlı olması gerekir.Görsel gösteri nasıl etkili küçük embriyolar üretmek için iyi bir fikir verebilir. Embriyo doğrama için bir tel döngü yapmak için, bir cam kılcal damar ile 20 santimetre uzunluğunda sert ve aşındırıcı olmayan paslanmaz çelik tel beslemek, üst kısmında küçük, bir milimetre uzunluğunda döngü yapma. Sınıf kılcal damar ucuüzerine açık oje küçük bir damlacık yerleştirin, kılcal ve tel döngü arasında yerinde tutmak için, döngü kısmına herhangi bir oje almak için emin olun, bu embriyolar zarar verebilir gibi.Sonra da kurusun. Cam kılcal damarı tahta bir çubuk üzerine takmak için laboratuvar bandı kullanın, böylece aletin çubuk parçası daha sonra suya daldırma değil, çubuk ötesine uzanan cam kılcal yaklaşık iki buçuk santimetre bırakarak. Plastik bir spatula ile 100 milimetrelik cam Petri çanak, yaklaşık 0.5% metil selüloz% 2 metil selüloz yaklaşık 0.5 mililitre alt merkezi yakınında ince ve eşit olarak yaklaşık 0,5 milimetre kalınlığında yayıldı.Yemeğin yan tarafına üçte bir Ringer çözeltisi yaklaşık 30 mililitre dökün ve yemeğin geri kalanına yayMak ve metil selüloz kapağı sağlar. Daha önce de-chorionated embriyolar yerleştirin 256 hücre bir K hücre evresine 2% metil selüloz üzerinde, emin embriyolar kendi tarafına yönelik olduğundan emin olun. Blastula doğramak için, hayvan direğine dik hayvan direğine yakın kesmek ve blastoderm hücrelerinin yaklaşık% 30-40 kesmek için tel döngü kullanın.Ardından, kalan hücrelerin geri kalmasına yardımcı olmak için uçları hafifçe birbirine dokunun. Sarısı için, yumurta zarı nicking tarafından vegetal kutup yakınında küçük bir yara yapmak için monte tel kullanın, hangi sarısı birkaç dakika için dışarı sızmak neden olur, ve sonra iyileşmek. Sarısı dışarı sızma durduğunda, iyileşme için aynı çanak metil selüloz dışında embriyo taşımak için bir pipet kullanın.Tüm embriyolar için blastula ve sarısı doğrama tekrarlayın ve embriyolar iyileşirken 30 dakika boyunca çanak rahatsız edilmeden bırakın. Daha sonra, embriyoları daha önce hazırlanmış 35 milimetrelik cam çanağı taze üçte bir Ringer çözeltisi içeren cam çanağı aktarmak için cam bir pipet kullanın ve görüntülemeye devam etmeden önce tam iyileşme sağlamak için 28,5 derece lik bir kantinde yerleştirin. Blastula ve sarısı ile iki adım doğrama yaptıktan sonra, embriyolar boyut farkı dışında, kontrol embriyoları ile karşılaştırıldığında gelişim aşamalarında görünüşte normal genel morfoloji gösterdi.Öte yandan, blastula sadece doğranmış embriyolar tuhaf bir morfoloji gösterdi, özellikle erken aşamalarında. Epiboly sırasında, embriyolar dar ve girintili bir görünüme sahipti. Aşağıdaki somite evresinde orta hat yapılarının birçok eksenel düzeyde düzleştirilmiş olduğu bulunmuştur.Daha sonraki aşamalarda, sarısı bitişik vücut yapıları, orta ve arka beyin gibi hala nispeten düzleştirilmiş bir şekil gösterdi, muhtemelen nispeten daha büyük sarısı artan gerginlik nedeniyle. Somit oluşumunun zaman atlamalı görüntülemesi, hem kontrol hem de doğranmış embriyolarda, daha sonraki evrelerde oluşan somitlerin boyutlarının önceki aşamalara göre daha küçük olduğunu göstermiştir. Ayrıca, somit oluşum aşamaları boyunca, doğranmış embriyolar kontrol embriyoları olanlara göre daha küçük somites vardı.Membran mCherry enjekte edilen embriyolarda iki adım doğrama tekniği yapıldığında, omuriliklerinin döllenme sonrası 20 saat sonra görüntülenmesi, boyut küçültme nedeniyle nöral tüp yüksekliklerinde azalma göstermiştir. İki adım doğrama çok yüksek verimlilik ile küçük ama aksi takdirde normal embriyolar elde etmek önemlidir. Blastuladan hücreleri keserken sarısını doğramamayı unutmamak önemlidir.Sarısı için, içeriği dışarı sızmak için üzerinde küçük bir yara yapmak. Ve sarısı membran uygun tampon doğal olarak iyileşir. Doğranmış embriyolar hızlı bir şekilde kurtarılabildiği için, normal embriyolara herhangi bir yöntem veya analiz uygulanabilir.Bu tekniğin sadeliği ve çok yönlülüğü çok güçlüdür, çünkü herkes zebrabalığındaki herhangi bir doku veya organdaki ölçekleme problemini incelemek için bu tekniği tanıtabilir. Bu teknikle araştırmacıların daha önce el değmemiş çeşitli sistemlerde ölçekleme sorunlarını çözebileceğine inanıyoruz. Biz zaten somit ve nöral tüp desenölçekleme önemli keşifler yaptık.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik balığı Embriyolar Üretimi

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Fare Embriyonik metatarsallara Kültürü: endokondral Kemikleşmenin bir Fizyolojik Modeli

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...