Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

يتم تمويل العمل في مختبرنا من خلال برنامج اكتشاف مجلس الموارد الطبيعية والبحوث الهندسية الكندية (NSERC)، والصندوق الكندي للابتكار جون ر. إيفانز زعيم، وجامعة الملكة. يتم دعم KS وIS من خلال منح دراسية للخريجين في أونتاريو جنبا إلى جنب والمنح الدراسية للخريجين في كندا NSERC لطلاب الماجستير (CGS-M).

1. الكشف عن انفجار ROS في أقراص أوراق أرابيدوبسي بعد استثارة المناعة
<ol><li>نمو المصنع وصيانته.<ol>
<li>لمزامنة الإنبات، يتم تقسيم بذور أرابيدوبوبس إلى الدرجة المتوسطة عن طريق تعليق حوالي 50 بذور في 1 مل من أجار معقم بنسبة 0.1% [ث/v] وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية (بدون ضوء) لمدة 3-4 أيام.<b...

تصف هذه الورقة طريقتين لـ "الاستجابات المناعية التي يتم تشغيلها بالنمط" في "أرابيدوبسي"،وتقدم نُهجاً كمية لتقييم الناتج المناعي دون استخدام معدات متخصصة. في تركيبة، يمكن استخدام ROS وSGI التي يتم تشغيلها نمط لتقييم الاستجابات المبكرة والمتأخرة لتصور الميكروبات، على التوالي.
<p class="jove_...

لإدراك وحماية ضد مسببات الأمراض، تطورت النباتات مستقبلات التعرف على نمط الغشاء المرتبطة (PRRs) التي تكشف عن الجزيئات الميكروبية المحفوظة خارج الخلية المعروفة باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات (MAMPs)1. ربط MAMPs إلى PRRs cognate الخاص بهم يبدأ البروتين kinase بوساطة إشارات المناعة مما أدى إلى مقاومة الأمراض واسعة الطيف2. واحدة من الاستجابات الأولى بعد تفعيل PRR هو الفوسفور وتنشيط غشاء البلازما المتكاملة انفجار الجهاز التنفسي OXIDASE التجانس (RBOH) البروتينات التي تحفز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي خارج الخلية (ROS)3 , 4.ROS تلعب دورا هاما في إنشاء مقاومة المرض، والعمل على حد سواء كرسل الثانوية لنشر إشارات المناعة وكذلك العوامل المضادة للميكروبات المباشرة5. ووصفت الملاحظة الأولى لانفجار الأكسدة المناعة باستخدام درنات البطاطا من السيرة الذاتية. وقد تم تقييم إنتاج ROS في العديد من الأنواع النباتية باستخدام أقراص ورقة7، والخلايا تعليق الثقافات8، وprotoplasts6. وصف هنا هو طريقة بسيطة لـ "إنتاج روس" الذي يُشغّل بالنمط في أقراص أوراق من أرابيدوبس ثاليانا (أرابيدوبسي).
استجابة لتصور MAMP، والبروتينات RBOH المنشطة تحفز إنتاج الجذور superoxide (O2-)، جذور الهيدروكسيل (•OH)، والأكسجين singlet (1 O2)التي يتم تحويلها إلى بيروكسيد الهيدروجين (H2O 2)في الفضاء خارج الخلية9. H2O2 يمكن قياسها كميا ً بواسطة اللوميلومينسين القائم على الإنارة في وجود البيروكسيداز الفجل عامل المؤكسدة (HRP)10. HRP أكسدة H2O2 توليد أيون هيدروكسيد (OH-) وغاز الأكسجين (O2)التي تتفاعل مع luminol لإنتاج وسيطة غير مستقرة التي تطلق فوتون من الضوء10. ويمكن قياس انبعاث الفوتون كمياً كوحدات ضوئية نسبية (RLUs) باستخدام قارئ لوحة صغيرة أو صور قادرة على الكشف عن الإنارة، التي أصبحت قطعاً قياسية من المعدات في معظم المختبرات الجزيئية. من خلال قياس الضوء الناتج على مدى فترة 40-60 دقيقة، يمكن الكشف عن انفجار الأكسدة عابرة في وقت مبكر 2-5 دقائق بعد العلاج المنتقد، وبلغت ذروتها في 10-20 دقيقة، والعودة إلى مستويات القاعدية بعد ~ 60 دقيقة11. يمكن استخدام الضوء التراكمي المنتج على مدى هذا الوقت بالطبع كمقياس للقوة المناعية المقابلة لتنشيط البروتينات RBOH12. مريح، هذا الاختبار لا يتطلب معدات متخصصة أو إعداد عينة مرهقة.
بلغت ذروتها بعد وقت قصير من الكشف MAMP، ويعتبر انفجار الأكسدةاستجابة المناعة في وقت مبكر، جنبا إلى جنب مع تفعيل MAPK وإنتاج الإيثيلين 5. وتشمل الاستجابات المناعية في وقت لاحق إعادة برمجة النسخ، وإغلاق stomatal، وترسب الكالوز2،5. التعرض لفترات طويلة لMAMPs ينشط باستمرار إشارات المناعة بنشاط مكلفة مما أدى إلى تثبيط نمو النبات، مما يدل على المفاضلة بين التنمية والحصانة13. يستخدم على نطاق واسع تثبيط نمو الشتلات التي تسببها نمط (SGI) لتقييم الناتج المناعي في Arabidopsis وكان جزءا لا يتجزأ من تحديد العديد من المكونات الرئيسية للإشارات المناعية بما في ذلك PRRs14،15 ،16. لذلك، تقدم هذه الورقة بالإضافة إلى ذلك بحثاً عن SGI التي يتم تشغيلها على النمط في أرابيدوبسي،حيث يتم زراعة الشتلات في لوحات متعددة الآبار تحتوي على وسائل إعلام قياسية أو وسائل إعلام مُستكملة بمُرّخ مناعي لمدة 8-12 يومًا ثم تزن باستخدام مقياس تحليلي.
ولبيان كيفية استخدام اختباري ROS وSGI لرصد الإشارات التي يتم التوسط فيها بوساطة PRR، تم اختيار ثلاثة أنماط جينية تمثل نواتج مناعية مختلفة: (1) انضمام نوع عربيدوبسي البري كولومبيا (Col-0)، (2) bak1-5 السلبي المهيمن متحولة فيها متعددة الوظائف PRR المشارك مستقبلات BRASSINOSTEROID غير حساسة 1-المرتبطة KINASE 1 (BAK1) غير وظيفية في إشارات المناعة17،18،و (3) cpk28-1 متحولة متنحية، والتي تفتقر إلى البروتين التنظيمي الذي يعتمد على الكالسيوم KINASE 28 (CPK28) ويعرض الاستجابات المناعية المرتفعة19،20. يتم تقديم الاختبارات ROS وSGI استجابة لepitope الببتيد elf18 المنتجة صناعيا من عامل استطالة البكتيرية تو (EF-Tu)، المعترف بها في Arabidopsis من قبل مستقبلات EF-Tu PRR (EFR)15. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات مع المحفزات المناعية الأخرى مثل بروتين الحركة البكتيرية فلانيلين14 أو البروتينات النباتية الذاتية (AtPeps)16، ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن استجابة النبات تختلف اعتمادا على 21. ويمكن استخدام الاختبارات التي أجرتها ROS وSGI معاً من أجل التقييم السريع والكمي للاستجابات المبكرة والمتأخرة التي يتم الاستجابة بوساطة PRR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

وقد تطورت النباتات نظام المناعة قوية لإدراك مسببات الأمراض والحماية من المرض. تصف هذه الورقة اختبارين يمكن استخدامهما لقياس قوة التنشيط المناعي في أرابيدوبسي ثاليانا بعد العلاج بجزيئات الإثارة. المقدمة أولاً هي طريقة لالتقاط الاندفاع التأكسدي السريع والديناميكي، والتي يمكن رصدها باستخدام الفحص القائم على الإنارة. الثاني هو طريقة تصف كيفية قياس تثبيط المناعة الناجمة عن نمو الشتلات. هذه البروتوكولات سريعة وموثوق بها، لا تتطلب التدريب المتخصص أو المعدات، وتستخدم على نطاق واسع لفهم الأساس الوراثي للمناعة النباتية.

متحولة cpk28-119،25 وbak1-517،تم استخدام18 النباتات لإظهار النتائج المتوقعة للأنماط الجينية مع استجابات المناعة العالية والمنخفضة، على التوالي، في انفجار الأكسدة وSGI الاختبارات نسبة إلى عنصر تحكم خلفية م...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي

تصف هذه الورقة طريقتين لتحديد الاستجابات الدفاعية في أرابيدوبسي ثاليانا بعد التعرض للمناضد المناعية: انفجار الأكسدة العابرة، وتثبيط نمو الشتلات.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

يمكن استخدام هذه المقايسات لتقييم ومقارنة النواتج المناعية للنمط الجيني النباتي المختلف. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها سريعة وموثوقة، واستخدام معدات المختبرات المشتركة. بالنسبة لمقايسة تثبيط النمو ، يجب زرع الشتلات من نفس الحجم والعمر وتجفيفها بالكامل قبل وزنها للحد من الاختلاف.في أربعة إلى خمسة أسابيع بعد الإنبات، واستخدام لكمة خزعة حادة من أربعة ملليمتر لإزالة قرص ورقة واحدة لكل نبات Arabidopsis، وتجنب midvein والحرص على الحد من الجرح. جمع الأقراص في آبار فردية من لوحة مضيئة 96-well غير المستخدمة التي تحتوي على 100 ميكرولترات من المياه المقطرة المزدوجة في البئر، الجانب adaxial حتى، لمنع desiccation. إذا تقييم المحفزات متعددة، وإزالة قرص ورقة ثانية من نفس الورقة لكل علاج الإثارة، وتغطية لوحة مع غطاء للسماح لأقراص ورقة لاسترداد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.في صباح اليوم التالي، تعيين المعلمات القارئ microplate إلى 1، 000 ميلي ثانية وقت التكامل في فترات لمدة دقيقتين على مدى فترة 40 إلى 60 دقيقة لالتقاط انفجار الأكسدة الديناميكية. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لاستبدال المياه في كل بئر بـ 100 ميكرولترات من محلول التفاعل الطازج، بما في ذلك التحكم، ولا تفاعل مُثير لكل نوع جيني لتقييم مستويات أنواع الأكسجين رد الفعل القاعدي في غياب الإثارة. ثم، وقياس فورا انبعاث الضوء لجميع الأطوال الموجية في الطيف المرئي على قارئ microplate.في أربعة أيام بعد الإنبات، تحميل كل بئر من لوحة 48-جيدا مع 500 ميكرولترات من المتوسط MS تستكمل مع تخفيف الببتيد ينزبيب. بعد ذلك ، استخدم ملقطًا معقمة لزرع 6 إلى 8 شتلات من نفس الحجم والعمر والنمط الجيني لكل تخفيف الببتيد ، مع الحرص على عدم وجود ضرر على الشتلات أو الكسر في الجذر وأن الجذر مغمور في الوسط. عندما تم مطلي جميع الشتلات، ختم لوحات مع الشريط Micropore، ووضع النباتات في ظل ظروف قياسية لمدة يوم قصير لمدة ثمانية إلى 12 يوما.لتحديد تثبيط النمو في المئة، التقاط صورة لتسجيل بصريا تثبيط النمو قبل إزالة بعناية الشتلات من كل بئر. ثم، الداب الجذور على منشفة ورقية لتجف، وتزن كل شتلة على مقياس تحليلي. في هذه التجربة التمثيلية، أظهرت النباتات المتحولة ذات الإشارات المناعية المفرطة النشاط انفجارًا مؤكسدًا أعلى ومتوسطًا مقارنة بالنباتات العربية من النوع البري، في حين أن النباتات المتحولة ذات الإشارات المناعية الضعيفة أظهرت انفجارًا مؤكسدًا مخفضًا عند تركيزات تتراوح بين 10 و1000 نانومولر.ويمكن أيضا تمييز الاختلافات المتوقعة في تثبيط نمو الشتلات بين جميع الأنماط الجينية التي نمت في تركيزات الببتيد النانومولر 100 و 000 1 نانومولر. عندما نمت في 1000 نانومولر ببتيد تخفيف، كانت المسوخ مع إشارات المناعة مفرطة النشاط أصغر بشكل ملحوظ من النباتات من النوع البري التي تزرع في ظل نفس الظروف، في حين أن المسوخ مع ضعف إشارة المناعة عرض تثبيط ضعيف للنمو نسبة إلى النباتات من النوع البري. توفر هذه الطرق أدلة على الاستجابات المناعية المبكرة والمتأخرة.ويمكن استخدام العديد من التقنيات الأخرى، بما في ذلك مقايسات كيناز MAP، والتعبير الجيني الناجم عن مسببات الأمراض، وم مقايسات العدوى، لتحديد هذه المسارات. وقد تم تعديل هذه التقنيات لاستخدامها في الشاشات الكبيرة، التي نجحت في تحديد البروتينات مستقبلات الممرض والعديد من المكونات الأخرى إشارة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em&gt; الكلاميديا</em&gt; فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana-الزائفة syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

فحوصات لمعدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

رصد الاستعمار البكتيري والصيانة على جذور الثاليانية العربية في نظام مائي عائم

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

الخياطة في فيفو الاختبارات الخلوية لدراسة المناعي في الأورام الخاصةCD8 + T الاستجابات الخلية

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

تحديد كفاءة المثبط الكيميائي ضد نمو توكسوبلازما غوندي داخل الخلايا باستخدام قياس النمو القائم على لوسيفيراز

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...