Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Arbejde i vores laboratorium er finansieret gennem Natural Resources og Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery program, det canadiske fundament for innovation John R. Evans Leaders fund, og Queen's University. KS og IS er understøttet af tandem Ontario Graduate stipendier og NSERC Canada Graduate stipendier til master's Students (CGS-M).

1. påvisning af ros burst i Arabidopsis blade skiver efter immun udløsning
<ol><li>Plantevækst og vedligeholdelse.<ol>
<li>For at synkronisere spiring, stratificere Arabidopsis frø ved at suspendere ca 50 frø i 1 mL steril 0,1% agar [w/v] og opbevares ved 4 °c (ingen lys) for 3-4 dage. Bemærk: stratificere en vildtype baggrundskontrol (f. eks. Col-0) og genotyper med høje og lave immun udgange (for eksempel cpk28-1 og bak1-5 ) for at fungere som interne kontroller.</li>
		...

Dette papir beskriver to metoder til bestemmelse mønster-udløst immunrespons i Arabidopsis, der tilbyder kvantitative tilgange til evaluering af immun produktionen uden brug af specialiseret udstyr. I kombination, mønster-udløst ros og SGI kan bruges til at vurdere tidlige og sene svar på mikrobe perception, hhv.
Den største begrænsning af den oxidativ burst-analyse er variabilitet. Af grunde, der ikke er helt forstået, absolutte RLUs ofte afviger med en størrelsesorden melle...

For at opfatte og forsvare sig mod patogener har planter udviklet membranbundne mønster genkendelses receptorer (PRRs), som detekterer tolererer mikrobielle molekyler uden for cellen, der er kendt som Microbe-associerede molekylære mønstre (MAMPs)1. Binding af MAMPs til deres cognate PRRs initierer protein kinase-medieret immun signalering resulterer i bredspektret sygdomsresistens2. En af de tidligste svar efter PRR-aktivering er fosforylering og aktivering af Integral plasma membran RESPIRATORISKE BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) proteiner, der katalyserer produktionen af ekstracellulære reaktive oxygenarter (ROS)3 , 4. ros spiller en vigtig rolle i at etablere sygdomsresistens, der virker både som sekundære budbringere til at udbrede immun signalering samt direkte antimikrobielle stoffer5. Den første observation af en immun-fremkaldt oxidativ burst blev beskrevet ved hjælp af kartoffelknolde af CV. Rishiri efter Phytophthora infestans inokulering6. ROS produktion er blevet evalueret i flere plantearter ved hjælp af blade skiver7, cellesuspension kulturer8, og protoplasts6. Beskrevet her er en simpel metode til bestemmelse mønster-udløst ros produktion i blade skiver Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Som et svar på MAMP perception katalyserer aktiverede rboh-proteiner produktionen af superoxid radikaler (O2-), hydroxylradikaler (• Oh) og singlet oxygen (1O2), der omdannes til hydrogenperoxid (H2o 2) i det ekstracellulære rum9. H2O2 kan kvantificeres ved luminol-baseret chemiluminescens i nærværelse af det oxidationsmiddel peberrod PEROXIDASE (HRP)10. HRP oxiderer H2O2 genererer en hydroxid ion (Oh−) og oxygen gas (O2), som reagerer med i til at producere en ustabil mellemprodukt, der frigiver en photon af lys10. Foton emission kan kvantificeres som relative lysenheder (RLUs) ved hjælp af en mikropladen læser eller Imager stand til at detektere luminescens, som er blevet standard stykker af udstyr i de fleste molekylære laboratorier. Ved at måle lyset produceret over en 40-60-minutters interval, en forbigående oxidativ burst kan påvises så tidligt som 2-5 minutter efter elicitor behandling, toppede på 10-20 minutter, og vender tilbage til basal niveauer efter ~ 60 minutter11. Det kumulative lys, der produceres over dette tidsforløb, kan anvendes som et mål for immun styrken, svarende til aktivering af RBOH-proteiner12. Bekvemt, denne analyse kræver ikke specialiseret udstyr eller besværlige prøveforberedelse.
Toppede kort efter MAMP detektion, den oxidativ burst betragtes som en tidlig immunrespons, sammen med MAPK aktivering og ethylenproduktion5. Senere immunrespons omfatter transkriptional omprogrammering, tyde lukning, og callose deposition2,5. Langvarig udsættelse for MAMPs konstant aktiverer energisk-bekostelig immun signalering resulterer i hæmning af plantevækst, der indikerer en trade-off mellem udvikling og immunitet13. Mønster udløst væksthæmning (SGI) anvendes i vid udstrækning til at vurdere immun produktionen i Arabidopsis og har været en integreret del af identifikationen af flere nøglekomponenter i immun signalering, herunder PRRS14,15 ,16. Derfor præsenterer dette papir desuden en analyse for mønster udløst SGI i Arabidopsis, hvorved frøplanter dyrkes i multi-brønd plader, der indeholder standard medier eller medier suppleret med en immun elicitor i 8-12 dage og derefter vejes ved hjælp af en analytisk skala.
For at demonstrere, hvordan ROS og SGI-assays kan anvendes til at overvåge PRR-medieret signalering, blev tre genotyper, der repræsenterer varierende immun output, valgt: (1) Wild type Arabidopsis tiltrædelsen Columbia (Col-0), (2) den dominerende-negative bak1-5 mutant, hvor den multi-funktionelle PRR Co-receptor brassinosteroid ufølsom 1-associeret kinase 1 (BAK1) er ikke-funktionel i immun signalering17,18og (3) den recessiv cpk28-1 mutant, som mangler den regulatoriske protein calcium-afhængig protein kinase 28 (CPK28) og viser forhøjet immun-udløste respons19,20. ROS og SGI assays er præsenteret som reaktion på en syntetisk produceret elf18 peptid epitop af bakteriel forlængelse faktor Tu (EF-Tu), anerkendt i Arabidopsis af PRR EF-Tu receptor (EFR)15. Disse protokoller kan anvendes med andre immun elicitorer såsom bakteriel motilitet protein flagellin14 eller endogene plante Elicitor proteiner (AtPeps)16, dog skal det bemærkes, at anlæggets reaktionsevne varierer afhængigt af elicitor21. I fællesskab kan ROS og SGI-assays anvendes til hurtig og kvantitativ vurdering af tidlige og sene PRR-medierede responser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Planter har udviklet sig et robust immunsystem til at opfatte patogener og beskytte mod sygdom. Dette papir beskriver to assays, der kan bruges til at måle styrken af immun aktivering i Arabidopsis thaliana efter behandling med elicitor molekyler. Præsenteret først er en metode til at opfange den hurtigt induceret og dynamisk oxidativ burst, som kan overvåges ved hjælp af en luminol-baseret analyse. Præsenteret anden er en metode, der beskriver, hvordan man måler immun-induceret hæmning af frøning vækst. Disse protokoller er hurtige og pålidelige, kræver ikke specialiseret uddannelse eller udstyr, og er almindeligt anvendt til at forstå det genetiske grundlag for plante immunitet.

Mutant cpk28-119,25 og bak1-517,18 planter blev brugt til at påvise forventede udfald for genotyper med henholdsvis høj og lav immunrespons, i oxidativ Burst og SGI analyser i forhold til en Wild-type baggrundskontrol (Col-0). For at vurdere dosisafhængige effekter blev der anvendt en 10-fold peptidfortyndingsserie (1-1000 nM) af elf18. Som forventet h...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Mønster-udløst oxidativ Burst og Seedling væksthæmning assays i Arabidopsis thaliana

Dette papir beskriver to metoder til at kvantificere forsvars respons i Arabidopsis thaliana efter udsættelse for immun elicitorer: den forbigående oxidativ burst, og hæmning af frøning vækst.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Disse analyser kan bruges til at vurdere og sammenligne immunoutput af forskellige plantegenotyper. Den største fordel ved disse teknikker er, at de er hurtige, pålidelige og bruger fælles laboratorieudstyr. For væksthæmningsanalysen skal frøplanter af samme størrelse og alder transplanteres og renses helt, før de vejes for at begrænse variationen.På fire til fem uger efter spiring, bruge en skarp fire-millimeter biopsi punch til at fjerne en bladskive pr Arabidopsis plante, undgå midvein og være omhyggelig med at begrænse såret. Opsaml skiverne i individuelle brønde af en ubrugt 96-brønds luminometerplade, der indeholder 100 mikroliter dobbeltdestilleret vand pr. brønd, adaxial side op, for at forhindre udiskring. Hvis du vurderer flere elicitorer, skal du fjerne en anden bladskive fra det samme blad for hver elicitorbehandling og dække pladen med låget, så bladskiverne kan komme sig natten over ved stuetemperatur.Næste morgen skal du indstille mikropladelæserparametrene til en integrationstid på 1.000 millisekunder i to minutters intervaller over en periode på 40 til 60 minutter for at fange den dynamiske oxidative burst. Dernæst skal du bruge en multi-kanal pipette til at erstatte vandet i hver brønd med 100 mikroliter af frisklavet reaktionsopløsning, herunder en kontrol, ingen elicitor reaktion for hver genotype til at vurdere de basale reaktion ilt arter niveauer i mangel af elicitation. Derefter skal du straks måle lysemissionen for alle bølgelængderne i det synlige spektrum på mikropladelæseren.Efter fire dage efter spiring indlæses hver brønd af en 48-brøndplade med 500 mikroliter MS-medium suppleret med en fortynding af elicitorpeptid. Dernæst skal du bruge sterile kraftbefædre til omhyggeligt transplantation seks til otte planter af samme størrelse, alder og genotype til hver peptid fortynding, idet du sørge for, at der ikke er nogen skade på sætteplante eller brud på roden, og at roden er nedsænket i medium. Når alle frøplanterne er blevet belagt, forsegles pladerne med Micropore tape, og planterne sættes under normale kortdagsforhold i otte til 12 dage.For at bestemme procentvæksthæmning, tage et foto til visuelt registrere væksthæmning før omhyggeligt at fjerne planter fra hver brønd. Derefter dab rødderne på en køkkenrulle til tørre, og vejer hver kimplante på en analytisk skala. I dette repræsentative eksperiment viste mutantplanter med hyperaktiv immunsignalering en højere kumulativ og gennemsnitlig oxidativ eksplosion sammenlignet med vildtype-arabidopsisplanter, mens mutantplanter med nedsat immunsignalering viste en reduceret oxidativ eksplosion ved koncentrationer mellem 10 og 1.000 nanomolar.Forventede forskelle i sætteplantevæksthæmning kunne også skelnes mellem alle de genotyper, der dyrkes i 100 og 1. Når de blev dyrket i 1.000 nanomolar peptidfortynding, var mutanterne med hyperaktiv immunsignaler markant mindre end vilde planter, der blev dyrket under de samme betingelser, mens mutanter med nedsat immunsignalering udviste en svag hæmning af væksten i forhold til vilde planter. Disse metoder giver beviser for tidlige og sene immunrespons.Flere andre teknikker, herunder MAP kinase assays, patogen-induceret genekspression, og infektion assays, kan bruges til at afgrænse disse veje. Disse teknikker er blevet ændret til brug i store skærme, som med succes har identificeret patogenreceptorproteiner og flere andre signalkomponenter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantificering af den Respiratory burstrespons som en indikator for medfødte immunforsvar Sundhed i zebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Brug fluorescerende proteiner til at visualisere og kvantificere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vækst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik og oxidativ Burst: Protokoller til isolering og Evaluering af humane leukocytter og blodplader

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bakteriel Leaf Infiltration Assay til Fin karakterisering af Plant Defense Responses ved hjælp af<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Måling granulocyt og monocyt Fagocytose og Oxidativ Burst Aktivitet i humant blod

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Screening Assays for at karakterisere romanen endotel regulerende myndigheder involveret i inflammatorisk reaktion

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Assays til specifikke vækstrate og celle-bindende evne af Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Overvågning bakteriel kolonisering og vedligeholdelse på Arabidopsis thaliana rødder i en flydende hydroponiske system

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Skræddersy in vivo cytotoksiske assays til at studere immun dominans i tumor specifikke CD8+ T- celle respons

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Bestemmelse af kemisk inhibitor effektivitet mod intracellulære Toxoplasma Gondii vækst ved hjælp af en Luciferase-baseret vækst assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...