Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Het werk in ons lab wordt gefinancierd door de Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, de Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader ' Fund en Queen's University. KS en wordt ondersteund door tandem Ontario Graduate beurzen en NSERC Canada Graduate beurzen voor master's Students (CGS-M).

1. detectie van ROS burst in Arabidopsis Leaf discs na immuun elicitatie
<ol><li>Plantengroei en-onderhoud.<ol>
<li>Voor het synchroniseren van de kiemkracht, van Arabidopsis zaden door ongeveer 50 zaden op te schorten in 1 ml steriele 0,1% agar [w/v] en op te slaan bij 4 °c (geen licht) gedurende 3-4 dagen. Opmerking: Stratify een wild type achtergrond besturingselement (bijvoorbeeld, Col-0) en genotypen met hoge en lage immuunoutputs (bijvoorbeeld cpk28-1 en bak1-5, respectieve...

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het aszeggen van patroon-geactiveerde immuunresponsen in Arabidopsis, het aanbieden van kwantitatieve benaderingen voor het evalueren van immune output zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. In combinatie, patroon-geactiveerde ROS en SGI kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van vroege en late reacties op microbe perceptie, respectievelijk.
De belangrijkste beperking van de oxidatieve burst-assay is variabiliteit. Om redenen ...

Om te waarnemen en te verdedigen tegen pathogenen, planten hebben geëvolueerd membraan-gebonden patroon erkenning receptoren (PRRs) dat geconmaald microbiële moleculen buiten de cel bekend als microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs)1detecteren. De binding van mamps aan hun verwant PRRS initieert eiwit kinase-gemedieerde immuun signalering resulterend in breedspectrum ziekte resistentie2. Een van de vroegste reacties na activering van PRR is de fosforylering en activering van integraal plasma membraan respiratoire BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) eiwitten die de productie van extracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) katalyseren3 , 4. Ros spelen een belangrijke rol bij het vaststellen van de ziekte resistentie, fungeert als secundaire boodschappers te propageren immuun signalering evenals directe antimicrobiële middelen5. De eerste observatie van een immuun-opgewekt oxidatieve uitbarsting werd beschreven met behulp van aardappelknollen van CV. Rishiri na Phytophthora infestans inoculatie6. ROS productie is geëvalueerd in verschillende plantensoorten met behulp van Leaf discs7, cel suspensie culturen8, en protoplasten6. Hier beschreven is een eenvoudige methode voor het aszeggen van patroon-geactiveerde ROS productie in blad schijven van Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Als reactie op MAMP-waarneming katalyseert de geactiveerde rboh-eiwitten de productie van superoxide-radicalen (O2-), hydroxylradicalen (• Oh) en singlet-zuurstof (1O2) die worden omgezet in waterstofperoxide (H2O 2) in de extracellulaire ruimte9. H2O2 kan worden gekwantificeerd met chemiluminescentie op basis van Luminol in aanwezigheid van de oxiderende agent mierikswortelperoxidase (HRP)10. HRP oxiseert H2O2 en genereert een HYDROXIDE-Ion (Oh−) en zuurstof gas (O2) dat reageert met Luminol om een instabiel intermediair te produceren dat een foon van licht10vrijgeeft. De emissie van photon kan worden gekwantificeerd als relatieve licht eenheden (RLUs) met behulp van een microplaat lezer of Imager die luminescentie detecteert, die standaard uitrustingsstukken zijn geworden in de meeste moleculaire laboratoria. Door het meten van het licht dat wordt geproduceerd over een interval van 40-60 minuten, kan een voorbijgaande oxidatieve uitbarsting al 2-5 minuten na de behandeling van de elicitor worden gedetecteerd, een piek van 10-20 minuten en terugkeren naar de basale niveaus na ~ 60 minuten11. Het cumulatieve licht dat over deze tijdsduur wordt geproduceerd, kan worden gebruikt als een maatstaf voor de immuunsterkte die overeenkomt met de activering van RBOH-eiwitten12. Handig is deze bepaling niet vereist gespecialiseerde apparatuur of omslachtige monstervoorbereiding.
Peaking kort na MAMP detectie, de oxidatieve uitbarsting wordt beschouwd als een vroege immuunrespons, samen met MAPK activering en ethyleenproductie5. Latere immuunresponsen omvatten transcriptionele herprogrammering, stomatale afsluiting en callose afzetting2,5. Langdurige blootstelling aan MAMPs activeert voortdurend energetisch-kostbare immuunsigna lering, resulterend in remming van de plantengroei, indicatief voor een trade-off tussen ontwikkeling en immuniteit13. Patroon-geactiveerde zaailing groeiremming (SGI) wordt veel gebruikt om de immuunoutput in Arabidopsis te beoordelen en is integraal onderdeel geweest van de identificatie van verschillende belangrijke componenten van immuunsigna lering, waaronder PRRS14,15 ,16. Daarom presenteert dit papier ook een test voor het patroon getriggerd SGI in Arabidopsis, waarbij zaailingen worden geteeld in multi-well platen met standaard media of media aangevuld met een immuunloïde gedurende 8-12 dagen en vervolgens gewogen met behulp van een analytische schaal.
Om aan te tonen hoe Ros en SGI assays kunnen worden gebruikt om PRR-gemedieerde signalering te bewaken, zijn drie genotypen gekozen die verschillende immuunoutputs vertegenwoordigen: (1) het wild type Arabidopsis toetredings Columbia (Col-0), (2) de dominante-negatieve bak1-5 Mutant waarin de multi-functionele PRR co-receptor brassinosteroid ongevoelig 1-geassocieerde KINASE 1 (BAK1) is niet-functioneel in immuun signalering17,18, en (3) het recessieve cpk28-1 Mutant, die mist de regulerend eiwit calcium-afhankelijke proteïne KINASE 28 (CPK28) en vertoont verhoogde immuungeactiveerde responsen19,20. Ros en SGI assays worden gepresenteerd in reactie op een synthetisch geproduceerde elf18 peptide epitoop van bacteriële rek factor TU (EF-TU), erkend in Arabidopsis door de PRR EF-TU receptor (EFR)15. Deze protocollen kunnen worden gebruikt met andere immuun uitlokken, zoals de bacteriële motiliteit proteïne flagellin14 of endogene plant lokaas eiwitten (AtPeps)16, echter, opgemerkt moet worden dat de reactie van de plant verschilt afhankelijk van de elicitor21. Samen kunnen ROS en SGI assays worden gebruikt voor de snelle en kwantitatieve beoordeling van vroegtijdige en late PRR-gemedieerde reacties.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Planten hebben een robuust immuunsysteem ontwikkeld om pathogenen te zien en te beschermen tegen ziekte. Dit artikel beschrijft twee testen die kunnen worden gebruikt voor het meten van de sterkte van de immuunactivering in Arabidopsis thaliana na behandeling met elicitor moleculen. Gepresenteerd eerst is een methode voor het vastleggen van de snel geïnduceerde en dynamische oxidatieve burst, die kan worden bewaakt met behulp van een Luminol gebaseerde assay. De tweede is een methode die beschrijft hoe de door immuungeïnduceerde remming van zaailing te meten. Deze protocollen zijn snel en betrouwbaar, vereisen geen gespecialiseerde training of apparatuur, en worden op grote schaal gebruikt om de genetische basis van de immuniteit van de plant te begrijpen.

Mutant cpk28-119,25 en bak1-517,18 planten werden gebruikt om de verwachte resultaten voor genotypen met hoge en lage immuunresponsen aan te tonen, respectievelijk in oxidatieve burst en SGI assays ten opzichte van een wild-type achtergrond besturingselement (Col-0). Om de dosisafhankelijke effecten te beoordelen, werd een 10-voudige peptide verdunningsre...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Deze testen kunnen worden gebruikt om immuunproducties van verschillende plantengenotypes te beoordelen en te vergelijken. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze snel, betrouwbaar en gebruik maken van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Voor de groeiremmingstest moeten zaailingen van dezelfde grootte en leeftijd worden getransplanteerd en volledig droog worden geblurd alvorens te wegen om variatie te beperken.Gebruik na vier tot vijf weken na de ontkieming een scherpe biopsiepunch van vier millimeter om één bladschijf per Arabidopsis-plant te verwijderen, de midveïne te vermijden en voorzichtig te zijn om het wond te beperken. Verzamel de schijven in individuele putten van een ongebruikte 96-well luminometerplaat met 100 microliters dubbel gedestilleerd water per put, adaxiale zijde omhoog, om uitdroging te voorkomen. Bij de beoordeling van meerdere ontlokkenden, verwijder een tweede blad schijf uit hetzelfde blad voor elke elicitor behandeling, en bedek de plaat met het deksel om de bladschijven te herstellen 's nachts bij kamertemperatuur.De volgende ochtend stelt u de microplatelezerparameters in op een integratietijd van 1,000 milliseconden in intervallen van twee minuten over een periode van 40 tot 60 minuten om de dynamische oxidatieve uitbarsting vast te leggen. Gebruik vervolgens een multi-channel pipet om het water in elke put te vervangen door 100 microliters van vers bereide reactieoplossing, inclusief een controle, geen elicitorreactie voor elk genotype om de basale reactie zuurstofsoorten niveaus te beoordelen in afwezigheid van elicitatie. Meet vervolgens onmiddellijk de lichtemissie voor alle golflengten in het zichtbare spectrum op de microplatelezer.Laad na vier dagen na de ontkieming elke put van een 48-putplaat met 500 microliter ms-medium aangevuld met een verdunning van elicitor peptide. Gebruik vervolgens steriele tangen om zes tot acht zaailingen van dezelfde grootte, leeftijd en genotype zorgvuldig te transplanteren aan elke peptideverdunning, waarbij u ervoor zorgt dat er geen schade is aan de zaailing of breuk aan de wortel en dat de wortel onder water wordt gezet in medium. Wanneer alle zaailingen zijn verguld, verzegel de platen met Micropore tape en plaats de planten gedurende acht tot twaalf dagen onder standaard korte dagen.Om de procentuele groeiremming te bepalen, neem een foto om de groeiremming visueel vast te leggen voordat u de zaailingen zorgvuldig uit elke put verwijdert. Dep vervolgens de wortels op een papieren handdoek om te drogen en weeg elke zaailing op een analytische schaal. In dit representatieve experiment toonden gemuteerde planten met hyperactieve immuunsignalering een hogere cumulatieve en gemiddelde oxidatieve uitbarsting aan in vergelijking met arabische idopsisplanten van het wilde type, terwijl gemuteerde planten met een verminderde immuunsignalering een verminderde oxidatieve uitbarsting vertoonden bij concentraties tussen 10 en 1.000 nanomolar.Verwachte verschillen in zaailing groeiremming kan ook worden onderscheiden tussen alle genotypen geteeld in 100 en 1, 000 nanomolar elicitair peptide concentraties. Wanneer geteeld in de 1,000 nanomolar peptide verdunning, de mutanten met hyperactieve immuunsignalering waren aanzienlijk kleiner dan wilde planten geteeld onder dezelfde omstandigheden, terwijl de mutanten met verminderde immuun signalering vertoonde een zwakke remming van de groei ten opzichte van wilde planten. Deze methoden leveren bewijs voor vroege en late immuunreacties.Verschillende andere technieken, waaronder MAP kinase tests, pathogen-geïnduceerde genexpressie, en infectie testen, kan worden gebruikt om deze trajecten af te bakenen. Deze technieken zijn aangepast voor gebruik in grootschalige schermen, die met succes pathogene receptor eiwitten en verschillende andere signalering componenten hebben geïdentificeerd.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kwantificering van de Respiratory Burst Response als een indicator van het aangeboren immuunsysteem Gezondheid in zebravis

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole groeidynamiek in levende cellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve Burst activiteit in menselijk bloed

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Screening tests karakteriseren roman Endothelial toezichthouders die betrokken zijn bij de ontstekingsreactie

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Tests voor de specifieke groeisnelheid en cel-bindend vermogen van Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring van bacteriële kolonisatie en onderhoud op Arabidopsis thaliana wortels in een drijvend Hydroponisch systeem

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Bepaling van de chemische remmer efficiëntie tegen intracellulaire Toxoplasma Gondii Groei met behulp van een Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...