Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Les travaux de notre laboratoire sont financés par le Programme de découverte du Conseil canadien de recherches sur les ressources naturelles et le génie (CRSNG), le Fonds du chef de la Fondation canadienne pour l'innovation John R. Evans et l'Université Queen's. KS et IS sont appuyés par des bourses d'études supérieures de l'Ontario et des bourses d'études supérieures du CRSN Canada pour les étudiants à la maîtrise (CGS-M).

1. Détection de l'éclatement de ROS dans les disques de feuilles d'Arabidopsis suivant l'obtention immunitaire
<ol><li>Croissance et entretien des usines.<ol>
<li>Pour synchroniser la germination, stratifier les graines d'Arabidopsis en suspendant environ 50 graines dans 1 ml d'agar stérile de 0,1 % [w/v] et les stocker à 4 oC (pas de lumière) pendant 3 à 4 jours. REMARQUE : Stratisfier un contrôle de fond de type sauvage (par exemple, Col-0) et des génotypes à rendement immunitaire élev?...

Cet article décrit deux méthodes pour assainer les réponses immunitaires déclenchées par modèle dans Arabidopsis, offrant des approches quantitatives à l'évaluation de la production immunitaire sans l'utilisation d'équipement spécialisé. En combinaison, le ROS et le SGI déclenchés par des motifs peuvent être utilisés pour évaluer les réponses précoces et tardives à la perception des microbes, respectivement.
La principale limitation de l'effort oxydatif est la varia...

Pour percevoir et se défendre contre les agents pathogènes, les plantes ont évolué récepteurs de reconnaissance des modèles liés à la membrane (PRR) qui détectent les molécules microbiennes conservées en dehors de la cellule connue sous le nom de modèles moléculaires microbe-associés (MAMPs)1. La liaison des MMP à leurs PrR cognate initie la signalisation immunitaire médiée par la kinase protéique, ce qui entraîne une résistance aux maladies à large spectre2. L'une des premières réponses après l'activation de PRR est la phosphorylation et l'activation des protéines hydropètes DE membrane plasmatique intégrale RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) qui catalysent la production d'espèces d'oxygène réactif extracellulaires (ROS)3 , 4. ROS jouent un rôle important dans l'établissement de la résistance aux maladies, agissant à la fois comme messagers secondaires pour propager la signalisation immunitaire ainsi que les agents antimicrobiens directs5. La première observation d'une rafale oxydative immunisée a été décrite utilisant des tubercules depomme de terre de cv. Rishiri suivant l'inoculation d'infestans de Phytophthora 6. La production de ROS a été évaluéedans plusieurs espèces végétales utilisant des disques de feuille 7, cultures de suspension cellulaire8,et protoplastes6. Décrit ici est une méthode simple pour assainer la production de ROS déclenchée par des motifs dans les disques de feuilles d'Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
En réponse à la perception de MAMP, les protéines RBOH activées catalysent la production de radicaux de superoxyde (O2-), les radicaux hydroxyles (OH), et l'oxygène de singlet (1O2) qui sont convertis en peroxyde d'hydrogène (H2O 2) dans l'espace extracellulaire9. H2O2 peut être quantifié par chemiluminescence à base de luminol en présence de l'agent oxydant raifort peroxidase (HRP)10. HRP oxyde H2O2 générant un ion hydroxyde (OH)et un gaz d'oxygène (O2) qui réagissent avec le luminol pour produire un intermédiaire instable qui libère un photon de lumière10. L'émission de photons peut être quantifiée en tant qu'unités lumineuses relatives (RLUs) à l'aide d'un lecteur de microplaques ou d'un imageur capable de détecter la luminescence, qui sont devenues des pièces d'équipement standard dans la plupart des laboratoires moléculaires. En mesurant la lumière produite sur un intervalle de 40-60 minutes, une rafale oxydative transitoire peut être détectée dès 2-5 minutes après le traitement de l'incitation, avec un pic de 10-20 minutes, et revenir à des niveaux basaux après 60 minutes11. La lumière cumulative produite au cours de ce cours de temps peut être utilisé comme une mesure de la force immunitaire correspondant à l'activation des protéines RBOH12. Pratiquement, cet essai ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de préparation d'échantillons encombrants.
Le pic peu de temps après la détection de MAMP, l'éclatement oxydatif estconsidéré une réponse immunitaire tôt, avec l'activation de MAPK et la production d'éthylène 5. Les réponses immunitaires postérieures incluent la reprogrammation transcriptionnelle, la fermeture stomatal, et le dépôt de callose2,5. L'exposition prolongée aux MAMP active continuellement la signalisation immunitaire énergétiquement coûteuse entraînant l'inhibition de la croissance des plantes, ce qui indique un compromis entre le développement et l'immunité13. L'inhibition de la croissance des semis déclenchéepar par les motifs (SGI) est largement utilisée pour évaluer la production immunitaire dans l'Arabidopsis et a fait partie intégrante de l'identification de plusieurs composants clés de la signalisation immunitaire, y compris les PrR14,15 ,16. Par conséquent, cet article présente en outre un analyse pour le SGI déclenché par le modèle dans Arabidopsis, par lequel les semis sont cultivés dans des plaques multi-bien contenant des médias standard ou des médias complétés par un stimulant immunitaire pendant 8-12 jours, puis pesé à l'aide d'une échelle analytique.
Pour démontrer comment les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour surveiller la signalisation par le PRR, trois génotypes qui représentent des extrants immunitaires variables ont été choisis : (1) le type sauvage Arabidopsis accession Columbia (Col-0), (2) le bak1-5 dominant-négatif mutant dans lequel le multi-fonctionnel PRR co-récepteur BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) est non fonctionnel dans la signalisation immunitaire17,18, et (3) le mutant récessif cpk28-1, qui n'a pas le protéine régulatrice CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) et affiche des réponses immunitaires accrues19,20. Les essais ROS et SGI sont présentés en réponse à un épitope de peptide d'elfe synthétiquement produit18 du facteur bactérien d'allongement Tu (EF-Tu), reconnu en Arabidopsis par le PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Ces protocoles peuvent être utilisés avec d'autres stimulants immunitaires tels que la flagelline de protéine de motilité bactérienne14 ou les protéines endogènes d'incitation de plante (AtPeps)16,cependant, il convient de noter que la réactivité de plante diffère selon le l'obtenir21. Ensemble, les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour l'évaluation rapide et quantitative des réponses précoces et tardives de PRR-négociées.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Les plantes ont développé un système immunitaire robuste pour percevoir les agents pathogènes et se protéger contre les maladies. Cet article décrit deux essais qui peuvent être employés pour mesurer la force de l'activation immunisée dans Arabidopsis thaliana suivant le traitement avec des molécules d'éveil. Présenté en premier est une méthode pour capturer l'éclatement oxydatif rapidement induit et dynamique, qui peut être surveillé à l'aide d'un analyse à base de luminol. La deuxième est une méthode décrivant comment mesurer l'inhibition induite par le système immunitaire de la croissance des semis. Ces protocoles sont rapides et fiables, ne nécessitent pas de formation ou d'équipement spécialisé, et sont largement utilisés pour comprendre la base génétique de l'immunité végétale.

Mutant cpk28-119,25 et bak1-517,18 plantes ont été utilisées pour démontrer les résultats attendus pour les génotypes avec des réponses immunitaires élevées et faibles, respectivement, en rafale oxydative et SGI tests par rapport à un contrôle de fond de type sauvage (Col-0). Pour évaluer les effets dépendants de la dose, une série de diluti...

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Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Cet article décrit deux méthodes pour quantifier des réponses de défense dans Arabidopsis thaliana suivant l'exposition aux eliciteurs immunisés : l'éclatement oxydant transitoire, et l'inhibition de la croissance de plant.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Ces analyses peuvent être utilisées pour évaluer et comparer les extrants immunitaires de différents génotypes végétaux. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles sont rapides, fiables et utilisent des équipements de laboratoire communs. Pour l’essai d’inhibition de croissance, les semis de la même taille et âge devraient être transplantés et complètement effacés secs avant de peser pour limiter la variation.À quatre à cinq semaines après la germination, utilisez un poinçon pointu de biopsie de quatre millimètres pour enlever un disque de feuille par plante d’Arabidopsis, évitant la midvein et prenant soin de limiter la blessure. Recueillir les disques dans des puits individuels d’une plaque de luminomètre inutilisée de 96 puits contenant 100 microlitres d’eau double distillée par puits, côté adaxial vers le haut, pour éviter la dessication. Si vous évaluez plusieurs facteurs d’obtention, retirez un deuxième disque de feuille de la même feuille pour chaque traitement d’elicitor, et couvrez la plaque avec le couvercle pour permettre aux disques de feuille de récupérer pendant la nuit à température ambiante.Le lendemain matin, définissez les paramètres du lecteur de microplaques à un temps d’intégration de 1 000 millisecondes en intervalles de deux minutes sur une période de 40 à 60 minutes pour capturer l’éclatement oxydatif dynamique. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour remplacer l’eau de chaque puits par 100 microlitres de solution de réaction fraîchement préparée, y compris un contrôle, aucune réaction de elicitor pour chaque génotype pour évaluer les niveaux basaux d’espèces d’oxygène de réaction en l’absence d’obtention. Ensuite, mesurez immédiatement l’émission de lumière pour toutes les longueurs d’onde dans le spectre visible sur le lecteur de microplaque.À quatre jours après la germination, chargez chaque puits d’une plaque de 48 puits avec 500 microlitres de moyenne de SP complétés par une dilution du peptide de elicitor. Ensuite, utilisez des forceps stériles pour transplanter soigneusement six à huit semis de la même taille, âge et génotype à chaque dilution peptidique, en prenant soin qu’il n’y a aucun dommage au semis ou à la rupture de la racine et que la racine est immergée dans le milieu. Lorsque tous les semis ont été plaqués, sceller les plaques avec du ruban Micropore et placer les plantes dans des conditions standard de courte journée pendant huit à 12 jours.Pour déterminer l’inhibition de croissance en pourcentage, prenez une photo pour enregistrer visuellement l’inhibition de la croissance avant d’enlever soigneusement les semis de chaque puits. Ensuite, tamponnez les racines sur une serviette en papier pour sécher, et pesez chaque semis sur une échelle analytique. Dans cette expérience représentative, les plantes mutantes avec la signalisation immunisée hyperactive ont démontré un éclat oxydant cumulatif et moyen plus élevé comparé aux usines d’Arabidopsis sauvage-type, alors que les usines mutantes avec la signalisation immunisée altérée ont montré un éclat oxydant réduit aux concentrations entre 10 et 1.000 nanomolar.Les différences attendues dans l’inhibition de la croissance des semis pourraient également être discernées entre tous les génotypes cultivés dans 100 et 1000 concentrations nanomolaires de peptide de elicitor. Lorsqu’ils sont cultivés dans la dilution peptidique de 1000 nanomolaires, les mutants ayant une signalisation immunitaire hyperactive étaient nettement plus petits que les plantes de type sauvage cultivées dans les mêmes conditions, tandis que les mutants ayant une signalisation immunitaire altérée présentaient une faible inhibition de la croissance par rapport aux plantes de type sauvage. Ces méthodes fournissent des preuves de réponses immunitaires précoces et tardives.Plusieurs autres techniques, y compris les analyses de kinase MAP, l’expression des gènes induits par les pathogènes et les analyses d’infection, peuvent être utilisées pour délimifier ces voies. Ces techniques ont été modifiées pour être utilisées dans des écrans à grande échelle, qui ont permis d’identifier avec succès les protéines des récepteurs pathogènes et plusieurs autres composants de signalisation.

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