Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Die Arbeit in unserem Labor wird durch das Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, die Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader es Fund und die Queen es University finanziert. KS und IS werden durch Tandem Ontario Graduate Scholarships und NSERC Canada Graduate Scholarships für Master-Studenten (CGS-M) unterstützt.

1. Erkennung von ROS-Burst in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunentlösung
<ol><li>Pflanzenwachstum und -wartung.<ol>
<li>Um die Keimung zu synchronisieren, schichten Sie Arabidopsis Samen, indem Sie etwa 50 Samen in 1 ml sterilem 0,1% Agar [w/v] aussetzen und 3-4 Tage bei 4 °C (kein Licht) lagern. ANMERKUNG: Stratify eine Wildtyp-Hintergrundsteuerung (z. B. Col-0) und Genotypen mit hohen und niedrigen Immunausgängen (z. B. cpk28-1 bzw. bak1-5), um als interne Kontrollen zu di...

Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Beurteilung von mustergesteuerten Immunantworten in Arabidopsis, die quantitative Ansätze zur Bewertung der Immunleistung ohne den Einsatz spezieller Geräte anbieten. In Kombination können mustergesteuerte ROS und SGI verwendet werden, um frühe bzw. späte Reaktionen auf die Mikrobenwahrnehmung zu bewerten.
Die Hauptbeschränkung des oxidativen Burst-Assays ist die Variabilität. Aus Gründen, die nicht vollständig verstanden werden, unt...

Um Krankheitserreger wahrzunehmen und zu verteidigen, haben Pflanzen membrangebundene Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) entwickelt, die konservierte mikrobielle Moleküle außerhalb der Zelle detektieren, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster (MAMPs) bekannt sind1. Die Bindung von MAMPs an ihre kognaatierten PRRs initiiert proteinkinasevermittelte Immunsignalisierung, was zu einer Breitspektrum-Krankheitsresistenz2führt. Eine der frühesten Reaktionen nach der PRR-Aktivierung ist die Phosphorylierung und Aktivierung von integralen Plasmamembran-RESPIRATORY-BURST-OXIDASE-HOMOLOG(RBOH)-Proteinen, die die Produktion extrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) katalysieren 3 , 4. ROS spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung von Krankheitsresistenz, sowohl als sekundäre Botenstoffe zur Verbreitung von Immunsignalisierung als auch als direkte antimikrobielle Wirkstoffe5. Die erste Beobachtung eines immunentlösten oxidativen Bursts wurde mit Kartoffelknollen von cv. Rishiri nach Phytophthora infestans Inokulation6beschrieben. Die ROS-Produktion wurde in mehreren Pflanzenarten mit Blattscheiben7, Zellsuspensionskulturen8und Protoplasten6. Beschrieben hier ist eine einfache Methode für die Assaying Muster-ausgelöste ROS-Produktion in Blattscheiben von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Als Reaktion auf die MAMP-Wahrnehmung katalysieren aktivierte RBOH-Proteine die Produktion von Superoxid-Radikalen (O2-), Hydroxylradikalen (•OH) und Singlet-Sauerstoff (1O2 ), die in Wasserstoffperoxid umgewandelt werden (H2 O 2) im extrazellulären Raum9. H2O2 kann durch Luminol-basierte Chemilumineszenz in Gegenwart des Oxidationsmittels Meerrettichperoxidase (HRP)10quantifiziert werden. HRP oxidiertH2O2 und erzeugt ein Hydroxid-Ion (OH) und Sauerstoffgas (O2 ), die mit Luminol reagieren, um ein instabiles Zwischenprodukt zu erzeugen, das ein Photon von Licht10freisetzt. Photonenemission kann als relative Lichteinheiten (RLUs) mit einem Mikroplattenleser oder Imager quantifiziert werden, der in der Lage ist, Lumineszenz zu erkennen, die in den meisten molekularen Laboratorien zu Standardgeräten geworden sind. Durch die Messung des Lichts, das über ein 40-60-Minuten-Intervall erzeugt wird, kann ein transienter oxidativer Ausbruch bereits 2-5 Minuten nach der Behandlung des Entauslöserers erkannt werden, der bei 10-20 Minuten seinen Höhepunkt erreicht und nach 60 Minuten11auf basale Werte zurückkehrt. Das kumulative Licht, das in diesem Zeitverlauf erzeugt wird, kann als Maß für die Immunstärke verwendet werden, das der Aktivierung von RBOH-Proteinen12entspricht. Praktischerweise erfordert dieser Test keine spezielle Ausrüstung oder umständliche Probenvorbereitung.
Kurz nach dem MAMP-Nachweis gilt der oxidative Ausbruch als frühe Immunantwort, zusammen mit der MAPK-Aktivierung und der Ethylenproduktion5. Spätere Immunantworten sind Transkriptionsreprogrammierung, stomataler Verschluss und Calloseablagerung2,5. Eine längere Exposition gegenüber MAMPs aktiviert kontinuierlich energetisch-kostenintensive Immunsignale, was zur Hemmung des Pflanzenwachstums führt, was auf einen Kompromiss zwischen Entwicklung und Immunität13hindeutet. Musterausgelöste Sättlingswachstumshemmung (SGI) wird häufig zur Beurteilung der Immunleistung bei Arabidopsis verwendet und war integraler Bestandteil der Identifizierung mehrerer Schlüsselkomponenten der Immunsignalisierung, einschließlich PRRs14,15 ,16. Daher präsentiert dieses Papier zusätzlich einen Test für musterausgelöste SGI in Arabidopsis, wobei Sämlinge in Multi-Well-Platten angebaut werden, die Standardmedien oder Medien enthalten, die 8-12 Tage lang mit einem Immunenteliciter ergänzt und dann gewogen werden. mit einer analytischen Skala.
Um zu demonstrieren, wie ROS- und SGI-Assays zur Überwachung der PRR-vermittelten Signalisierung verwendet werden können, wurden drei Genotypen ausgewählt, die unterschiedliche Immunausgänge darstellen: (1) der wilde Typ Arabidopsis Beitritt Columbia (Col-0), (2) der dominant-negative Bak1-5 Mutant, bei dem der multifunktionale PRR-Co-Rezeptor BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) bei der Immunsignalisierung17,18und (3) dem rezessiven cpk28-1 Mutanten, dem die CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) und zeigt erhöhte immunausgelöste Reaktionen19,20. ROS- und SGI-Assays werden als Reaktion auf ein synthetisch hergestelltes elf18-Peptid-Epitop des bakteriellen Dehnungsfaktors Tu (EF-Tu) vorgestellt, das in Arabidopsis vom PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15anerkannt wird. Diese Protokolle können mit anderen Immunentfernern wie dem bakteriellen Motilitätsprotein Flagellin14 oder endogenen Pflanzenelicitor-Proteinen (AtPeps)16verwendet werden, es sollte jedoch beachtet werden, dass die Reaktionsfähigkeit der Pflanzen je nach Elicitor21. Zusammen können ROS- und SGI-Assays für die schnelle und quantitative Bewertung früher und später PRR-vermittelter Reaktionen verwendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Pflanzen haben ein robustes Immunsystem entwickelt, um Krankheitserreger wahrzunehmen und vor Krankheiten zu schützen. Dieses Papier beschreibt zwei Assays, die verwendet werden können, um die Stärke der Immunaktivierung in Arabidopsis thaliana nach der Behandlung mit Elicitor-Molekülen zu messen. Präsentiert zuerst ist eine Methode zur Erfassung der schnell induzierten und dynamischen oxidativen Burst, die mit einem Luminol-basierten Assay überwacht werden kann. Präsentiert zweite ist eine Methode, die beschreibt, wie immuninduzierte Hemmung des Sämlingswachstums zu messen. Diese Protokolle sind schnell und zuverlässig, erfordern keine spezielle Ausbildung oder Ausrüstung und sind weit verbreitet, um die genetische Grundlage der Pflanzenimmunität zu verstehen.

Mutant cpk28-119,25 und bak1-517,18 Pflanzen wurden verwendet, um erwartete Ergebnisse für Genotypen mit hohen und niedrigen Immunantworten zu demonstrieren, bzw. in oxidativen Burst und SGI Tests relativ zu einem Wildtyp-Hintergrundsteuerelement (Col-0). Zur Beurteilung dosisabhängiger Wirkungen wurde eine 10-fache Peptidverdünnungsreihe (1-1.000 nM) ...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana nach der Exposition gegenüber Immunentfernern: der vorübergehende oxidative Ausbruch und die Hemmung des Sämlingwachstums.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Diese Assays können verwendet werden, um Immunleistungen verschiedener Pflanzengenotypen zu bewerten und zu vergleichen. Der Hauptvorteil dieser Techniken ist, dass sie schnell, zuverlässig sind und gängige Laborgeräte verwenden. Für den Wachstumshemmungstest sollten Sämlinge gleicher Größe und Alter transplantiert und vor dem Wiegen vollständig ausgeschmiert werden, um die Variation zu begrenzen.Nach vier bis fünf Wochen nach der Keimung, verwenden Sie einen scharfen Vier-Millimeter-Biopsie-Punch, um eine Blattscheibe pro Arabidopsis Pflanze zu entfernen, den Mittelvenen zu vermeiden und vorsichtig zu sein, die Verwundung zu begrenzen. Sammeln Sie die Scheiben in einzelne Brunnen einer ungenutzten 96-Well-Luminometer-Platte mit 100 Mikroliter doppeldestilliertem Wasser pro Brunnen, adaxiale Seite nach oben, um austrocknung zu verhindern. Wenn Sie mehrere Entferner bewerten, entfernen Sie für jede Elicitor-Behandlung eine zweite Blattscheibe aus demselben Blatt und bedecken Sie die Platte mit dem Deckel, damit sich die Blattscheiben über Nacht bei Raumtemperatur erholen können.Am nächsten Morgen stellen Sie die Mikroplattenleserparameter in Zwei-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 40 bis 60 Minuten auf eine Integrationszeit von 1.000 Millisekunden ein, um den dynamischen oxidativen Ausbruch zu erfassen. Als nächstes verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um das Wasser in jedem Brunnen durch 100 Mikroliter frisch vorbereiteter Reaktionslösung zu ersetzen, einschließlich einer Kontrolle, keine Entsendereaktion für jeden Genotyp, um den Gehalt an Basalreaktionssauerstoffspezies in Ermangelung von Auslösung zu bewerten. Messen Sie dann sofort die Lichtemission für alle Wellenlängen im sichtbaren Spektrum auf dem Mikroplattenleser.An vier Tagen nach der Keimung, laden Sie jeden Brunnen einer 48-Well-Platte mit 500 Mikroliter MS Medium mit einer Verdünnung von Elicitor Peptid ergänzt. Als nächstes verwenden Sie sterile Zangen, um sorgfältig sechs bis acht Sämlinge der gleichen Größe, des gleichen Alters und des gleichen Genotyps in jede Peptidverdünnung zu transplantieren, wobei darauf zu achten ist, dass der Sämling oder Bruch der Wurzel nicht beschädigt wird und dass die Wurzel in medium getaucht wird. Wenn alle Sämlinge plattiert sind, versiegeln Sie die Platten mit Micropore-Band und stellen Sie die Pflanzen acht bis zwölf Tage lang unter Standard-Kurztagsbedingungen.Um die prozentuale Wachstumshemmung zu bestimmen, nehmen Sie ein Foto auf, um die Wachstumshemmung visuell aufzuzeichnen, bevor Sie die Sämlinge vorsichtig aus jedem Brunnen entfernen. Dann die Wurzeln auf einem Papiertuch zum Trocknen abwerfen und jeden Sämling auf analytischer Skala wiegen. In diesem repräsentativen Experiment zeigten mutierte Pflanzen mit hyperaktiver Immunsignalisierung einen höheren kumulativen und durchschnittlichen oxidativen Ausbruch im Vergleich zu Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen, während mutierte Pflanzen mit eingeschränkter Immunsignalisierung einen reduzierten oxidativen Ausbruch in Konzentrationen zwischen 10 und 1 000 Nanomolar zeigten.Erwartete Unterschiede in der Setzlingswachstumshemmung konnten auch zwischen allen Genotypen erkennbar sein, die in 100 und 1.000 nanomolaren Auslaugenden Peptidkonzentrationen angebaut werden. Bei der Verdünnung von 1 000 nanomolaren Peptidverdünnungen waren die Mutanten mit hyperaktiver Immunsignalisierung deutlich kleiner als Wildpflanzen, die unter den gleichen Bedingungen angebaut wurden, während die Mutanten mit eingeschränkter Immunsignalisierung eine schwache Wachstumshemmung im Vergleich zu Wildpflanzen zeigten. Diese Methoden liefern Hinweise auf frühe und späte Immunreaktionen.Mehrere andere Techniken, einschließlich MAP-Kinase-Assays, pathogen-induzierte Genexpression und Infektionstests, können verwendet werden, um diese Wege abzuleiten. Diese Techniken wurden für den Einsatz in Großbildschirmen modifiziert, die erfolgreich Pathogenrezeptorproteine und mehrere andere Signalkomponenten identifiziert haben.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Screening-Assays zur Charakterisierung neuartiger endothelialer Regulators der entzündlichen Reaktion beteiligt

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Assays für die spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Überwachung der bakteriellen Kolonisation und Erhaltung von Arabidopsis thaliana Roots in einem schwimmenden Hydroponischen System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Bestimmung der chemischen Inhibitor-Effizienz gegen intrazelluläre toxoplasma Gondii Wachstum mit einem Luziferase-basierten Wachstumstest

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...