Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

העבודה במעבדה שלנו ממומנת באמצעות המועצה הטבעית של משאבי מחקר והנדסה של קנדה (NSERC) תוכנית דיסקברי, הקרן הקנדית לחדשנות ג'ון R. אוונס קרן מנהיג, ואוניברסיטת המלכה. KS והוא נתמך על ידי מלגות דו-מושביים אונטריו ובוגר NSERC קנדה מלגות לסטודנטים של מאסטר (CGS-M).

1. זיהוי פרץ של רוס בדיסקי העלה Arabidopsis בעקבות ההעצמה החיסונית
<ol><li>גידול ואחזקה של צמחים.<ol>
<li>כדי לסנכרן את הנביטה , הזרעים האראבאכופזיס באמצעות השעיית כ 50 זרעים ב 1 מ ל סטרילי 0.1% אגר [w/v] ולאחסן ב 4 ° צ' (ללא אור) עבור 3-4 ימים. הערה: Stratify שליטה ברקע סוג פראי (לדוגמה, Col-0) ו-גנוטיפים עם פל...

נייר זה מתאר שתי שיטות לגבי התגובה החיסונית המופעל דפוס ב Arabidopsis, המציע גישות כמותיים להערכת התפוקה החיסונית ללא שימוש בציוד מיוחד. בשילוב, מופעלת תבנית ROS ו SGI ניתן להשתמש כדי להעריך את התגובות מוקדם ומאוחר לתפיסת חיידק, בהתאמה.
המגבלה העיקרית של שיטת פרץ חמצוני היא שינ?...

כדי לתפוס ולהגן מפני פתוגנים, הצמחים התפתחו ממברנה מאוגד הזיהוי דפוסים קולטנים (PRRs) המאתרות מולקולות מיקרוביאלית שימור מחוץ לתא המכונה תבניות מולקולריות הקשורות חיידק (MAMPs)1. הכריכה של mamps כדי קנצוני שלהם prrs יוזם חלבון קינאז-בתיווך איתות החיסונית וכתוצאה מכך עמידות מחלת ספקטרום רחב2. אחת התשובות המוקדם ביותר בעקבות הפעלת PRR הוא זרחון והפעלה של ממברנה בלתי נפרד פלזמה פרץ הומואוקסידאז log (RBOH) חלבונים אשר מזרז את הייצור של מינים חמצן תגובתי לחילוץ (ROS)3 , 4. ROS לשחק תפקיד חשוב בהקמת התנגדות למחלות, משחק הן כמו שליחים משניים להפיץ איתות החיסונית, כמו גם סוכנים מיקרוביאלית ישיר5. התצפית הראשונה של פרץ חמצוני מחוסן מפני החיסון המתואר באמצעות פקעות תפוחי אדמה של קורות חיים. רישירי אחרי Phytophthora ... הפקה ROS כבר הוערך מינים צמחים מספר שימוש בדיסקי העלה7, הבולם התרבויות התאים8, ו protoplasts6. המתואר כאן היא שיטה פשוטה עבור הפקת דפוס-הפקה של רוס מופעל דיסקים של העלים של arabidopsis thaliana (arabidopsis).
כתגובה לתפיסה mamp, מופעל חלבונים rboh לזרז את הייצור של רדיקלים סופראוקסיד (O2-), רדיקלים הידרוקסיל (• או), ו סינגתן חמצן (1o2) המומרים חמצן מימן (H2o 2) בחלל החילוץ9. H2O2 ניתן לכמת על-ידי הלומירול מבוססי כימובסנס בנוכחות של הסוכן האוקסיגון חזרת peroxidase (hrp)10. HRP מחמצן2o2 יצירת יון הידרוקסיד (הו-או) וגז חמצן (O2) אשר מגיבים עם הלומירול כדי לייצר ביניים לא יציבה המשחרר פוטון של אור10. פליטת פוטון ניתן לכמת כיחידות אור יחסית (rlus) באמצעות קורא מיקרופלייט או צמידה מסוגל לזהות לומינסנציה, אשר הפכו להיות חלקים סטנדרטיים של ציוד במעבדות המולקולרית ביותר. על ידי מדידת האור המיוצר על פני מרווח 40-60 דקות, פרץ חמצוני חולף ניתן לזהות כבר מוקדם ככל 2-5 דקות לאחר הטיפול הפקה, לשיא ב 10-20 דקות, וחזרה לרמות בסיס אחרי ~ 60 דקות11. האור המצטבר שהופק במהלך הזמן הזה יכול לשמש כמדד של כוח החיסון המתאים להפעלת חלבונים RBOH12. באופן נוח, שיטת הפעולה אינה דורשת ציוד מיוחד או הכנה לדוגמה מסורבלת.
לשיא זמן קצר לאחר זיהוי MAMP, פרץ חמצוני נחשב תגובה חיסונית מוקדמת, יחד עם הפעלה MAMP וייצור אתילן5. מאוחר יותר תגובות החיסון כוללות תכנות משנה, הסגר שיניים, ולהוריד את התצהיר2,5. חשיפה ממושכת למחברי הפרלמנט מפעילה באופן שוטף את האיתות החיסוני אנרגטית-יקר הנובע מעיכוב צמיחת הצמח, הרומז על סחר בין פיתוח לחסינות13. תבנית-המופעל שתיל הצמיחה עיכוב (sgi) משמש רבות כדי להעריך את הפלט החיסונית ב arabidopsis והיה אינטגרלי לזיהוי של מספר רכיבים מרכזיים של איתות החיסון כולל prrs14,15 ,בן 16 לכן, הנייר הזה בנוסף מציג את התשובה עבור מדגם מופעל SGI ב Arabidopsis, לפיו שתילים גדלים בצלחות רב-היטב המכילים מדיה רגילה או מדיה בתוספת מעורר החיסון עבור 8-12 ימים ולאחר מכן שקלת תוך שימוש בקנה מידה אנליטי.
כדי להדגים כיצד ROS ו sgi בחני ניתן להשתמש כדי לפקח על prr בתיווך איתות, שלושה גנוטיפים המייצגים פלטי החיסונית משתנים נבחרו: (1) סוג פראי arabidopsis ההצטרפות קולומביה (Col-0), (2) הדומיננטי-שלילי bak1-5 מוטציה שבה רב תפקודי prr שיתוף קולטן brassinosteroid 1-הקשורים קינאז 1 (BAK1) הוא שאינו פונקציונלי איתות החיסונית17,18, ו (3) המוטציה cpk28-1 , אשר חסרה את ה קינאז חלבון משועבד לחלבונים בחלבון (CPK28) ומציג תגובות מוגברת למערכת החיסונית19,20. ROS ו sgi בחני מוצגים בתגובה מלאכותית המיוצר elf18 פפטיד אפירופה של התארכות בקטריאלי פקטור Tu (EF-tu), מזוהה arabidopsis על ידי הקולטן prr EF-tu (efr)15. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש עם elicitors החיסונית אחרים כגון כותל חלבון בקטריאלי לתנועתיות14 או אנדוגני הצמח מקבל חלבונים (atpeps)16, עם זאת, יש לציין כי תגובתיות הצמח שונה בהתאם ל . מעורר21 יחד, ROS ו sgi בחני יכול לשמש הערכה מהירה וכמותית של תגובות prr מוקדם ומאוחר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

צמחים התפתחו מערכת חיסונית חזקה לתפוס פתוגנים ולהגן מפני מחלה. נייר זה מתאר שתי מטרות שניתן להשתמש בהן כדי למדוד את כוחה של הפעלה חיסונית באריידאופזיס thaliana בעקבות הטיפול עם מולקולות מעורר. מוצג הראשון הוא שיטה ללכידת התפרצות חמצוני במהירות ודינמית, אשר ניתן לפקח באמצעות שיטת הלומירול מבוסס. השני הוא שיטה המתארת כיצד למדוד החיסונית המושרה עיכוב של צמיחת שתיל. פרוטוקולים אלה הם מהירים ואמינים, אינם דורשים הכשרה או ציוד מיוחדים, והם משמשים רבות כדי להבין את הבסיס הגנטי של חסינות הצמח.

מוטציה cpk28-119,25 ו bak1-517,18 צמחים שימשו כדי להפגין תוצאות צפויות עבור גנוטיפים עם תגובות החיסון גבוה ונמוך, בהתאמה, בפרץ חמצוני ו sgi בחני יחסית לבקרת רקע פראי (Col-0). כדי להעריך אפקטים תלויי-מינון, השתמשו ב...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

נייר זה מתאר שתי שיטות לכמת את התגובות ההגנה באריידאופזיס thaliana בעקבות החשיפה elicitors החיסונית: פרץ חמצוני חולף, ואת עיכוב צמיחת שתיל.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

בדיקות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך ולהשוות תפוקות החיסון של גנוטיפים צמחיים שונים. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שהם מהירים, אמינים, ולהשתמש בציוד מעבדה משותף. עבור עיכוב הצמיחה להגיד, שתילים באותו גודל וגיל צריך להיות מושתל לחלוטין כתם יבש לפני השקילה כדי להגביל את הווריאציה.לאחר נביטה של ארבעה עד חמישה שבועות, השתמש באגרוף ביופסיה חד של ארבעה מילימטרים כדי להסיר דיסק עלה אחד לכל צמח Arabidopsis, הימנעות midvein נזהר להגביל את הפציעה. לאסוף את הדיסקים לתוך בארות בודדות של צלחת לומינומטר 96-well שאינם שימוש המכיל 100 microliters של מים מזוקקים כפולים לתוך באר, צד adaxial למעלה, כדי למנוע ייעוד. אם מעריכים מספר מעוררים, מסירים דיסק עלה שני מאותו עלה עבור כל טיפול מעורר, ומכסים את הצלחת במכסה כדי לאפשר לדיסקים העלים להתאושש בן לילה בטמפרטורת החדר.למחרת בבוקר, הגדר את הפרמטרים של קורא המיקרופלסטיק לזמן אינטגרציה של 1,000 אלפיות שניה במרווחים של שתי דקות לאורך תקופה של 40 עד 60 דקות כדי ללכוד את פרץ החמצון הדינמי. לאחר מכן, השתמש פיפטה רב ערוצית להחליף את המים בכל באר עם 100 microliters של פתרון תגובה מוכן טרי, כולל שליטה, אין תגובה מעוררת עבור כל גנוטיפ כדי להעריך את רמות מיני חמצן התגובה הבסיסית בהיעדר עוררות. לאחר מכן, מיד למדוד את פליטת האור עבור כל אורכי הגל בספקטרום הנראה על קורא מיקרופלסטיק.בארבעה ימים לאחר הנביטה, לטעון כל באר של צלחת 48 באר עם 500 microliters של מדיום MS בתוספת דילול של פפטיד elicitor. לאחר מכן, השתמש במטלפים סטריליים כדי להשתיל בזהירות שישה עד שמונה שתילים באותו גודל, גיל וגנוטיפ לכל דילול פפטיד, תוך טיפול שום נזק השתיל או שבירה לשורש, כי השורש שקוע בינוני. כאשר כל השתילים כבר מצופים, לאטום את הצלחות עם סרט Micropore, ולמקם את הצמחים בתנאים סטנדרטיים של יום קצר במשך שמונה עד 12 ימים.כדי לקבוע את עיכוב הצמיחה באחוזים, צלם תמונה כדי לתעד חזותית את עיכוב הגדילה לפני שתסיר בזהירות את השתילים מכל באר. לאחר מכן, לטבול את השורשים על מגבת נייר להתייבש, ולשקול כל שתיל בקנה מידה אנליטי. בניסוי מייצג זה, צמחים מוטנטים עם איתות חיסוני היפראקטיבי הדגימו פרץ חמצוני מצטבר וממוצע גבוה יותר בהשוואה לצמחים ערבידופסיים מסוג בר, ואילו צמחים מוטנטים עם איתות חיסוני לקוי הציגו פרץ חמצוני מופחת בריכוזים שבין 10 ל -1,000 ננומולרים.ניתן להבחין גם בהבדלים הצפויים בעיכוב צמיחת השתילים בין כל הגנוטיפים הגדלים ב-100 וב-1,000 ריכוזי פפטיד ננו-מולאריים. כאשר גדל 1, 000 דילול פפטיד nanomolar, המוטנטים עם איתות חיסוני היפראקטיבי היו קטנים משמעותית מאשר צמחים מסוג בר גדל באותם תנאים, בעוד המוטנטים עם איתות חיסוני לקוי הציג עיכוב חלש של צמיחה יחסית לצמחים מסוג בר. שיטות אלה מספקות ראיות לתגובות חיסוניות מוקדמות ומאוחרות.מספר טכניקות אחרות, כולל מסיכי MAP kinase, ביטוי גנים הנגרמים על ידי פתוגן, ו assays זיהום, ניתן להשתמש כדי לתוות מסלולים אלה. טכניקות אלה שונו לשימוש במסכים בקנה מידה גדול, אשר זיהו בהצלחה חלבונים קולטן פתוגן וכמה רכיבי איתות אחרים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

קביעת יעילות מעכבי כימית נגד הצמיחה טוקסופלזמה Gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...