Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Il lavoro nel nostro laboratorio è finanziato attraverso il Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, la Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader's Fund e la Queen's University. KS e IS sono supportati da borse di studio tandem Ontario Graduate e borse di studio NSERC Canada Graduate per studenti di master (CGS-M).

1. Rilevamento di esplosione ROS nei dischi foglia di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria
<ol><li>Crescita e manutenzione dell'impianto.<ol>
<li>Per sincronizzare la germinazione, stratificare i semi di Arabidopsis sospendendo circa 50 semi in 1 mL di sterile 0,1% agar [w/v] e conservare a 4 gradi (senza luce) per 3-4 giorni. NOTA: Stratificare un controllo dello sfondo di tipo selvaggio (ad esempio, Col-0) e genotipi con uscite immunitarie alte e basse (ad esempio, cpk28-1 e b...

Questo documento descrive due metodi per andire le risposte immunitarie innescate in modello in Arabidopsis, offrendo approcci quantitativi alla valutazione della produzione immunitaria senza l'uso di apparecchiature specializzate. In combinazione, ROS e SGI attivati in modello possono essere utilizzati per valutare le risposte tempestive e tardive alla percezione dei microbi, rispettivamente.
La principale limitazione del saggio ossidativo burst è la variabilità. Per motivi che non...

Per percepire e difendersi dagli agenti patogeni, le piante hanno sviluppato recettori di riconoscimento dei modelli legati alla membrana (PRR) che rilevano molecole microbiche conservate al di fuori della cellula note come modelli molecolari associati ai microbi (MAMP)1. Il legame dei MAMP ai loro MR cognati avvia la segnalazione immunitaria mediata dalla chinasi proteica, con conseguente resistenza alle malattie ad ampio spettro2. Una delle prime risposte dopo l'attivazione del PRR è la fosforolalazione e l'attivazione delle proteine respiratorie RESPIRATORI OXIDASE HOMOLOG (RBOH) che catalizzano la produzione di specie extracellulari reattive dell'ossigeno (ROS)3 , 4. Il ROS svolge un ruolo importante nello stabilire la resistenza alle malattie, agendo sia come messaggeri secondari per propagare la segnalazione immunitaria sia come agenti antimicrobici diretti5. La prima osservazione di un'esplosione ossidativa immuno-elitata è stata descritta usando tuberi di patate di cv. Rishiri dopo Phytophthora infestans inoculazione6. La produzione di ROS è stata valutata in diverse specie vegetali utilizzando dischi foglia7, colture di sospensioni cellulari8e protoplasts6. Descritto qui è un metodo semplice per andire la produzione ROS innescata da pattern nei dischi foglia dell'Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
In risposta alla percezione del MAMP, le proteine RBOH attivate catalizzano la produzione di radicali di superossido (O2-), radicali idrossili (OH) e ossigeno singlet (1O2) che vengono convertiti in perossido di idrogeno (H2O 2) nello spazio extracellulare9. H2O2 può essere quantificato dalla chemiluminescenza a base di luminolo in presenza dell'agente ossidante perossidase (HRP)10. HRP ossida H2O2 generando uno ione idrossido (OH)e gas di ossigeno (O2) che reagiscono con il luminol per produrre un intermedio instabile che rilascia un fotone di luce10. L'emissione di fotoni può essere quantificata come unità di luce relativa (RLU) utilizzando un lettore di microplacino o un imager in grado di rilevare la luminescenza, che sono diventati pezzi standard di attrezzature nella maggior parte dei laboratori molecolari. Misurando la luce prodotta in un intervallo di 40-60 minuti, un'esplosione ossidativa transitoria può essere rilevata già 2-5 minuti dopo il trattamento dell'elicitor, raggiungendo il picco di 10-20 minuti e tornando a livelli basali dopo 60 minuti11. La luce cumulativa prodotta in questo ciclo temporale può essere utilizzata come misura della forza immunitaria corrispondente all'attivazione delle proteine RBOH12. Convenientemente, questo saggio non richiede attrezzature specializzate o preparazione ingombrante del campione.
Raggiungendo il picco poco dopo il rilevamento MAMP, il scoppio ossidativo è considerato una risposta immunitaria precoce, insieme all'attivazione MAPK e alla produzione di etilene5. Le successive risposte immunitarie includono la riprogrammazione trascrizionale, la chiusura stomatale e la deposizione callosa2,5. L'esposizione prolungata ai MAMP attiva continuamente la segnalazione immunitaria energeticamente costosa con conseguente inibizione della crescita delle piante, indicativa di un compromesso tra sviluppo e immunità13. L'inibizione della crescita delle piantine innescata a pattern (SGI) è ampiamente utilizzata per valutare la produzione immunitaria in Arabidopsis ed è stata parte integrante dell'identificazione di diversi componenti chiave della segnalazione immunitaria, tra cui i PRR14,15 ,16. Pertanto, questo documento presenta inoltre un saggio per la SGI innescata a motivi geometrici in Arabidopsis, in base al quale le piantine vengono coltivate in piastre multi-bene contenenti supporti standard o multimediali integrati con un elicitor immunitario per 8-12 giorni e poi pesati utilizzando una scala analitica.
Per dimostrare come i test ROS e SGI possono essere utilizzati per monitorare la segnalazione mediata da PRR, sono stati scelti tre genotipi che rappresentano output immunitarie variabili: (1) il tipo selvaggio Arabidopsis accession Columbia (Col-0), (2) il bak1-5 dominante-negativo in cui il co-recettore multifunzionale PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) non è funzionale nella segnalazione immunitaria17,18e (3) il mutante cpk28-1 recessivo, che manca proteine regolatorie CALCIUM-dipendente PROTEIN A LIVELLO DI KINASE 28 (CPK28) e visualizza risposte potenziate19,20. I saggi ROS e SGI sono presentati in risposta a un epitopo peptide elf18 prodotto sinteticamente del fattore di allungamento batterico Tu (EF-Tu), riconosciuto in Arabidopsis dal PRR EF-Tu RECETTOR (EFR)15. Questi protocolli possono essere utilizzati con altri elicitori immunitari come la flagellina14 della proteina di motilità batterica o le proteine endogene dell'elicitora vegetale (AtPeps)16, tuttavia, va notato che la reattività delle piante differisce a seconda elicitor21. Insieme, i saggi ROS e SGI possono essere utilizzati per la valutazione rapida e quantitativa delle risposte mediate da PRR precoce e tardiva.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Le piante hanno sviluppato un robusto sistema immunitario per percepire gli agenti patogeni e proteggere dalle malattie. Questo documento descrive due saggi che possono essere utilizzati per misurare la forza dell'attivazione immunitaria in Arabidopsis thaliana dopo il trattamento con molecole di elicitor. Presentato per primo è un metodo per catturare la raffica ossidativa rapida e dinamica, che può essere monitorata utilizzando un saggio basato sul luminol. Il secondo è presentato come misurare l'inibizione indotta immunoindotta della crescita delle piantine. Questi protocolli sono veloci e affidabili, non richiedono formazione o attrezzature specializzate e sono ampiamente utilizzati per comprendere la base genetica dell'immunità delle piante.

Mutant cpk28-119,25 e bak1-517,18 piante sono state utilizzate per dimostrare i risultati attesi per i genotipi con risposte immunitarie alte e basse, rispettivamente, in burst ossidativo e SGI saggi relativi a un controllo di sfondo di tipo selvaggio (Col-0). Per valutare gli effetti dipendenti dalla dose, è stata utilizzata una serie di diluizione pept...

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Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Modellazione-Triggered Ossidative Burst e Seedling Growth Assays in Arabidopsis thaliana

Questo documento descrive due metodi per quantificare le risposte della difesa nell'Arabidopsis thaliana in seguito all'esposizione agli elicitori immunitari: il scoppio ossidativo transitorio e l'inibizione della crescita delle piantine.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Questi test possono essere utilizzati per valutare e confrontare le uscite immunitarie di diversi genotipi vegetali. Il vantaggio principale di queste tecniche è che sono rapide, affidabili e utilizzano attrezzature di laboratorio comuni. Per il test di inibizione della crescita, le piantine della stessa dimensione ed età devono essere trapiantate e completamente asciugate prima di pesare per limitare la variazione.A quattro o cinque settimane dopo la germinazione, utilizzare un forte punzone di biopsia da quattro millimetri per rimuovere un disco fogliare per pianta di Arabidopsis, evitando il midvein e facendo attenzione a limitare le ferite. Raccogliere i dischi in singoli pozzi di una piastra luminometrica inutilizzata da 96 pozzi contenente 100 microlitri di acqua doppia distillata per pozzo, lato adassiale verso l'alto, per evitare l'essiccazione. Se si valutano più elicitori, rimuovere un secondo disco fogliare dalla stessa foglia per ogni trattamento di elicitor e coprire la piastra con il coperchio per consentire ai dischi fogliari di recuperare durante la notte a temperatura ambiente.La mattina seguente, impostare i parametri del lettore di micropiatte su un tempo di integrazione di 1.000 millisecondi in intervalli di due minuti in un periodo di 40-60 minuti per catturare l'esplosione ossidativa dinamica. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per sostituire l'acqua in ogni pozzo con 100 microlitri di soluzione di reazione preparata al momento, incluso un controllo, nessuna reazione di elicitor per ogni genotipo per valutare i livelli delle specie di ossigeno di reazione basale in assenza di eccitazione. Quindi, misurare immediatamente l'emissione luminosa per tutte le lunghezze d'onda nello spettro visibile sul lettore di micropiatte.A quattro giorni dalla post-germinazione, caricare ogni pozzo di una piastra da 48 porri con 500 microlitri di mezzo MS integrati con una diluizione di peptide elicitore. Successivamente, utilizzare forcep sterili per trapiantare con cura da sei a otto piantine della stessa dimensione, età e genotipo in ogni diluizione peptidica, facendo attenzione che non ci siano danni alla piantina o alla rottura alla radice e che la radice sia sommersa nel mezzo. Quando tutte le piantine sono state placcate, sigillare le piastre con nastro Micropore e posizionare le piante in condizioni standard di breve giorno per otto-12 giorni.Per determinare l'inibizione della crescita percentuale, scatta una foto per registrare visivamente l'inibizione della crescita prima di rimuovere attentamente le piantine da ogni pozzo. Quindi, tamponare le radici su un tovagliolo di carta per asciugare e pesare ogni piantina su una scala analitica. In questo esperimento rappresentativo, le piante mutanti con segnalazione immunitaria iperattiva hanno dimostrato un'esplosione ossidativa cumulativa e media più elevata rispetto alle piante arabidopsis di tipo selvatico, mentre le piante mutanti con segnalazione immunitaria compromessa hanno mostrato un'esplosione ossidativa ridotta a concentrazioni tra 10 e 1.000 nanomolari.Le differenze previste nell'inibizione della crescita delle piantine potrebbero anche essere individuate tra tutti i genotipi coltivati in concentrazioni peptidiche di elicitor nanomolare 100 e 1.000 nanomolari. Quando sono cresciuti nella diluizione peptidica nanomolare 1.000, i mutanti con segnalazione immunitaria iperattiva erano marcatamente più piccoli delle piante di tipo selvatico coltivate nelle stesse condizioni, mentre i mutanti con segnalazione immunitaria compromessa mostravano una debole inibizione della crescita rispetto alle piante di tipo selvatico. Questi metodi forniscono prove di risposte immunitarie precoci e tardive.Molte altre tecniche, tra cui i test MAP chinasi, l'espressione genica indotta da agenti patogeni e i test di infezione, possono essere utilizzate per delineare queste vie. Queste tecniche sono state modificate per l'uso in schermi su larga scala, che hanno identificato con successo proteine del recettore patogeno e molti altri componenti di segnalazione.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetica e il burst ossidativo: Protocolli per l&#39;isolamento e la valutazione dei leucociti umani e piastrine

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

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Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patosistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

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