Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

私たちの研究室での仕事は、カナダの天然資源工学研究評議会(NSERC)ディスカバリープログラム、カナダイノベーション財団ジョンR.エバンスリーダーズファンド、クイーンズ大学を通じて資金提供されています。KSとISは、マスター学生のためのオンタリオ州大学院奨学金とNSERCカナダ大学院奨学金(CGS-M)によってサポートされています。

1. 免疫引き出し後のアラビドプシス葉ディスクにおけるROSバーストの検出
<ol><li>植物の成長とメンテナンス。<ol>
<li>発芽を同期させるには、無菌0.1%寒天[w/v]の1mLで約50種を懸濁し、3〜4日間4°C(光なし)に保存してアラビドプシス種子を層化します。 注: 野生型のバックグラウンド コントロール (Col-0 など) と、免疫出力が高く低い遺伝子型(cpk28-1とbak1-5など) を内?...

本論文では、アラビドプシスにおけるパターン誘発免疫応答をアッセイする2つの方法について述べ、特殊な装置を使用せずに免疫出力を評価する定量的アプローチを提供する。組み合わせで、パターントリガROSとSGIは、それぞれ微生物知覚に対する早期および後期の応答を評価するために使用することができる。
酸化バーストアッセイの主な制限は変動性です。?...

病原体を知覚し防御するために、植物は微生物関連分子パターン(MAMP)1として知られている細胞外の保存された微生物分子を検出する膜結合パターン認識受容体(PRR)を進化させました。彼らの認知PRRへのMAMPの結合は、広いスペクトル疾患耐性2をもたらすタンパク質キナーゼ媒介免疫シグナル伝達を開始する。PRR活性化後の最も初期の応答の1つは、細胞外活性酸素種(ROS)の産生を触媒する一体型血漿膜呼吸バーストオキシダーゼホモログ(RBOH)タンパク質のリン酸化と活性化である3,4.ROSは、疾患耐性を確立する上で重要な役割を果たし、免疫シグナル伝達を伝播する二次メッセンジャーとして作用するとともに、直接抗菌剤5.免疫誘発性酸化バーストの最初の観察は、フィトフソラインフェタン接種6に続くcv.リシリのジャガイモ塊茎を用いて説明した。ROS産生は、葉ディスク7、細胞懸濁培養物8、およびプロトプラス6を用いていくつかの植物種で評価されている。ここで説明する、アラビドプシス・タリアナ(アラビドプシス)の葉ディスクでパターントリガROS産生をアッセイするための簡単な方法である。
MAMP知覚に対する応答として、活性RBOHタンパク質は、過酸化水素(H2 O)に変換されるスーパーオキシドラジカル(O2-)、ヒドロキシルラジカル(•OH)、およびシングルト酸素(1O2)の産生を触媒する。2)細胞外空間9中。H2O2は、酸化剤ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)10の存在下でルミノール系ケミルミネッセンスにより定量することができる。 HRPは、光10の光子を放出する不安定な中間体を生成するためにルミノールと反応する水酸化イオン(OH−)および酸素ガス(O2)を生成するH2O2を酸化する。 光子の放出は、ほとんどの分子実験室で標準的な装置となっている発光を検出することができるマイクロプレートリーダーまたはイメージャーを使用して相対光単位(LLU)として定量することができる。40〜60分間隔で生成された光を測定することにより、一過性酸化バーストは、エリキシーター処理後2〜5分後に早くも検出することができ、10〜20分でピークに達し、〜60分後に基底レベルに戻る。この時間コースで生成された累積光は、RBOHタンパク質12の活性化に対応する免疫強度の尺度として使用することができる。便利なことに、このアッセイは、特殊な機器や面倒なサンプル調製を必要としません。
MAMP検出直後にピークを迎え、酸化バーストはMAPK活性化およびエチレン産生5と共に早期免疫応答と考えられる。その後の免疫応答には、転写リプログラミング、腹腔閉鎖、およびカロース堆積2、5が含まれる。MSPへの長期暴露は、エネルギー的に高価な免疫シグナル伝達を継続的に活性化し、植物の成長の阻害をもたらし、開発と免疫13との間のトレードオフを示す。パターン誘発苗増殖抑制(SGI)は、アラビドプシスにおける免疫出力を評価するために広く使用され、PRR14、15を含む免疫シグナル伝達のいくつかの主要成分の同定に不可欠であった、16.したがって、本論文はさらに、アラビドプシスにおけるパターントリガSGIのアッセイを提示し、それによって苗は、標準的な媒体または免疫エリケータを8〜12日間補充したマルチウェルプレートで成長し、その後計量した。分析スケールを使用します。
ROSおよびSGIアッセイを使用してPRR媒介シグナリングを監視する方法を実証するために、様々な免疫出力を表す3つの遺伝子型が選択されました:(1)野生型アラビドプシス加盟コロンビア(Col-0)、(2)優勢陰性bak1-5 多機能PRR共受容体BRASSINOSTEROID無感受性1-関連キナーゼ1(BAK1)が免疫シグナル伝達17、18、および(3)劣性cpk28-1変異体において非機能である変異体は、調節タンパク質カルシウム依存性タンパク質キナーゼ28(CPK28)および高められた免疫誘発応答19,20を表示する。ROSおよびSGIアッセイは、細菌伸長因子Tu(EF-Tu)の合成産生elf18ペプチドエピトープに応答して提示され、PRR EF-Tu受容体(EFR)15によってアラビドプシスで認識される。これらのプロトコルは、細菌運動性タンパク質フラゲリン14または内因性植物エリシエータタンパク質(AtPeps)16などの他の免疫エリケータと共に使用することができるが、植物の応答性は、引き出し器21.ROSおよびSGIアッセイを組み合わせることで、PRR媒介応答の早期および後期の迅速かつ定量的評価に使用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

植物は病原体を知覚し、病気から保護するために堅牢な免疫システムを進化させてきました。本論文では、エリクティター分子による治療後のアラビドプシスタリアナにおける免疫活性化の強度を測定するために使用できる2つのアッセイについて述べた。最初に提示されるのは、急速に誘発され、動的酸化バーストを捕捉する方法であり、これはルミノール系アッセイを用いて監視することができる。第2に提示されるのは、苗増殖の免疫誘発阻害を測定する方法を説明する方法である。これらのプロトコルは、高速かつ信頼性が高く、専門的なトレーニングや機器を必要とせず、植物免疫の遺伝的基礎を理解するために広く使用されています。

変異型cpk28-119、25およびbak1-517、18植物は、それぞれ酸化バーストおよびSGIにおいて、高および低免疫応答を有するゲノタイプの期待される結果を実証するために使用された。野生型のバックグラウンドコントロール(Col-0)に対するアッセイ。用量依存性効果を評価す?...

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Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ

本論文では、免疫エリミターへの曝露後のアラビドプシス・タリアナにおける防御応答を定量化する2つの方法について、一過性酸化バーストと苗増殖の抑制について述べた。

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

これらのアッセイは、異なる植物遺伝子型の免疫出力を評価し、比較するために使用することができる。これらの技術の主な利点は、迅速で信頼性が高く、一般的な実験装置を使用することです。成長阻害アッセイのために、同じ大きさと年齢の苗を移植し、変動を制限するために計量する前に乾燥して完全にブロットする必要があります。発芽後4~5週間で、鋭い4ミリメートルの生検パンチを使用して、シロイヌナズナズナの植物ごとに1枚の葉ディスクを取り除き、中静脈を避け、傷を制限するように注意してください。乾燥を防ぐために、1ウェルあたり100マイクロリットルの二重蒸留水を含む未使用の96ウェルのルミノメータープレートの個々の井戸にディスクを収集し、adaxial側を上にして下さい。複数のイリシターを評価する場合は、各エレシター処理のために同じ葉から2番目の葉ディスクを取り出し、蓋でプレートを覆い、葉ディスクが室温で一晩回復できるようにします。翌朝、マイクロプレートリーダーパラメータを、40~60分の間隔で2分間隔で1,000ミリ秒の統合時間に設定し、動的酸化バーストをキャプチャします。次に、マルチチャネルピペットを使用して、各ウェルの水を、コントロールを含む、各遺伝子型に対する誘発反応を含む100マイクロリットルの新しい反応溶液で交換し、引き出しがない場合の基底反応酸素種レベルを評価する。そして、マイクロプレートリーダー上の可視スペクトルにおける全ての波長の発光を直ちに測定する。発芽後4日間で、500マイクロリットルのMS培地を含む48ウェルプレートの各ウェルを、引き出しペプチドの希釈を添加した。次に、滅菌鉗子を用いて、各ペプチド希釈液に6~8種の苗を慎重に移植し、根に苗や破損に損傷がなく、根が培地に沈んでいるのに注意する。すべての苗をめっきしたら、プレートをマイクロポアテープで密封し、8〜12日間、標準的な短い日の条件の下で植物を置きます。成長阻害率を決定するには、各ウェルから苗を慎重に除去する前に、成長阻害を視覚的に記録するために写真を撮ります。その後、ペーパータオルに根をささげ、分析スケールで各苗の重量を量ります。この代表的な実験では、多動性免疫シグナル伝達を有する変異植物は、野生型のアラビナズナズナズ植物と比較して高い累積および平均酸化バーストを示し、一方、免疫シグナル伝達障害を有する変異植物は10〜1,000ナノモルの間の濃度で減少した酸化バーストを示した。苗の成長阻害の予想される違いは、100と1,000ナノモルエリシターペプチド濃度で成長したすべての遺伝子型の間で識別することもできます。1,000ナノモルペプチド希釈で増殖すると、多動性免疫シグナル伝達を有する変異体は、同じ条件下で成長した野生型植物よりも著しく小さかったが、免疫シグナル伝達障害を有する変異体は野生型植物に対する成長の弱い阻害を示した。これらの方法は、早期および後期の免疫応答の証拠を提供する。MAPキナーゼアッセイ、病原体誘発遺伝子発現、および感染アッセイを含む他のいくつかの技術は、これらの経路を描くために使用することができる。これらの技術は、病原体受容体タンパク質および他のいくつかのシグナル伝達成分を同定することに成功した大規模スクリーンでの使用のために変更されています。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける自然免疫の健康の指標として呼吸バースト応答の定量化

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em&gt;シロイヌナズナシュードモナスシリン</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

比増殖速度とロタウイルスのセル結合の能力のための試金

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

浮遊水耕システムにおけるアラビドプシス・タリアナ根の細菌の植民地化と維持のモニタリング

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

ルシファーゼベース成長アッセイを用いた細胞内トキソプラズマゴンディ成長に対する化学阻害剤の効率の測定

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...