Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
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우리 실험실에서의 작업은 캐나다의 천연 자원 및 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 발견 프로그램, 캐나다 혁신 재단 존 R. 에반스 리더의 기금 및 퀸즈 대학을 통해 지원됩니다. KS와 IS는 온타리오 대학원 장학금과 NSERC 캐나다 대학원 장학금(CGS-M)의 지원을 받습니다.

1. 면역 유도 다음 애기장대 잎 디스크에서 ROS 버스트의 검출
<ol><li>식물 성장 및 유지 보수.<ol>
<li>발아를 동기화하기 위해, 애기장대 씨앗을 멸균 0.1% 한천 의 1 mL에 약 50 개의 씨앗을 일시 중단하고 3-4 일 동안 4 °C (빛 없음)에 보관하십시오. 참고: 야생형 배경 대조군(예를 들어, Col-0)과 높은 및 낮은 면역 출력을 가진 유전형(예: cpk28-1 및 bak1-5)을 계층화하여 내부 대...

이 논문은 애기장대에서패턴 트리거 면역 반응을 분석하는 두 가지 방법을 설명하며, 전문 장비를 사용하지 않고 면역 출력을 평가하는 정량적 접근법을 제공합니다. 조합에서, 패턴 트리거된 ROS 및 SGI는 각각 미생물 지각에 대한 초기 및 후기 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다.
산화 파열 분석법의 주요 제한은 가변성입니다. 완전히 이해되지 않는 이유로 절대 RlUs는...

병원체에 대하여 인식하고 방어하기 위하여는, 식물은 미생물 관련 분자 패턴 (MAMPs)로 알려져 있는 세포 외부보존된 미생물 분자를 검출하는막 결합한 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 진화했습니다 1. 그들의 동족 PR에 MAMPs의 결합은 광범위한 질병 저항성의 결과로 단백질 키나제 매개면역 신호질을 개시합니다 2. PRR 활성화 다음 초기 반응 중 하나는 세포 외 반응성 산소 종 (ROS)의 생산을 촉매 하는 일체형 플라즈마 막 호흡 버스트 OXIDASE HOMOLOG (RBOH) 단백질의 인산화 및 활성화3 , 4.ROS는 면역 신호를 전파하는 보조 메신저뿐만 아니라 직접 항균제로서모두 작용하여 질병 내성을 확립하는 데 중요한 역할을 한다 5. 면역 유도산화 파열의 첫번째 관측은 피토프토라 감염증 접종후리시리의 감자 덩이줄기를 사용하여 기술되었다 6. ROS 생산은 잎 디스크 7, 세포현탁액 배양8,및 프로토 플라스톱 종6을사용하여 여러 식물 종에서 평가되었다. 여기서 설명된 것은 애기장대(애기장대)의 잎 디스크에서 패턴 트리거된ROS 생산을 위한 간단한 방법이다.
MAMP 지각에 대한 반응으로, 활성화된 RBOH 단백질은 과산화수소(H2O)로 변환되는 수퍼옥사이드 라디칼(O2-), 하이드록실 라디칼(•OH) 및 일중염 산소(1 O2)의 생산을 촉매합니다. 2)세포 외공간에서 9. H2O2는 산화제 고추냉이 과산화제(HRP)10의존재 에서 루미놀 계 케미발광에 의해 정량화될 수 있다. HRP는 H2O2를 산화하여 수산화이온(OH−)및 산소 가스(O2)를 발생시키고 루미놀과 반응하여 빛의 광자(10)를 방출하는 불안정한 중간체를 생성한다. 광자 방출은 대부분의 분자 실험실에서 장비의 표준 조각이된 발광을 감지 할 수있는 마이크로 플레이트 리더 또는 이미저를 사용하여 상대 광 단위 (RUS)로 정량화 될 수 있습니다. 40-60분 간격으로 생성된 빛을 측정함으로써, 과도 산화 파열은 유도체 처리 후 2-5분, 10-20분에서 정점에 도달하고, ~60분11후기저 수준으로 되돌아오는 것으로 조기에 검출될 수 있다. 이 시간 동안 생성된 누적 광은 RBOH 단백질(12)의 활성화에상응하는 면역 강도의 척도로서 사용될 수 있다. 편리하게, 이 분석법은 특수 한 장비 또는 성가신 샘플 준비를 필요로하지 않습니다.
MAMP 검출 직후에 피크, 산화 버스트는 MAPK 활성화 및 에틸렌 생산과 함께초기 면역 반응으로 간주됩니다 5. 이후 면역 반응은 전사 재프로그래밍, 구내 폐쇄 및 칼로오스증착 2,5를포함한다. MAMMp에 장기간 노출되면 식물 성장의 억제를 초래하는 에너지 비용이 많이 드는 면역 신호가 지속적으로 활성화되어개발과 면역 13 사이의 절충을 나타냅니다. 패턴 트리거 모종 성장 억제 (SGI)는 널리 애기장대에서 면역 출력을 평가하는 데 사용되며 PRRs14,15를 포함한 면역 신호의 여러 주요 구성 요소의 식별에 필수적이었다 ,16. 따라서, 이 논문은 또한 애기장대에서패턴 트리거 SGI에 대한 분석서를 제시하며, 이에 따라 모종은 8-12일 동안 면역 점구체로 보충된 표준 용지 또는 미디어를 포함하는 다중 웰 플레이트에서 재배된 다음 무게를 측정합니다. 분석 척도를 사용하여
ROS 및 SGI 분석이 PRR 매개 신호를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 입증하기 위해 다양한 면역 출력을 나타내는 세 가지 유전자형이 선택되었습니다: (1) 야생 형 애기장대 수탁콜롬비아 (Col-0), (2) 지배적 인 음성 bak1-5 다기능 PRR 공동 수용체 브라시노스테로이드 무감각 1-관련 키나제 1(BAK1)이 면역 신호에 비기능성 인 돌연변이체17,18,및 (3) 열성 cpk28-1 돌연변이가 결여되어 있는 돌연변이체는 조절 단백질 칼슘 의존 단백질 키나제 28 (CPK28) 및 높게 한 면역 트리거 반응을 표시19,20. ROS 및 SGI 세포는 PRR EF-Tu 수용체(EFR)15에의해 애기장대에서 인식된 세균 신장률 투(EF-Tu)의 합성 생산 된 elf18 펩티드 에피토프에 대한 응답으로 제시된다. 이러한 프로토콜은 세균성 운동성 단백질 인 flagellin14 또는 내인성 식물 유도체 단백질 (AtPeps)16과같은 다른 면역 유도체와 함께 사용할 수 있지만 식물 반응성은 식물 반응성에 따라 다르다는 점에 유의해야합니다. 유도자21. 함께, ROS 및 SGI 분석제는 PRR 중재응답의 신속하고 정량적인 평가를 위해 사용될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

식물은 병원균을 인식하고 질병으로부터 보호하기 위해 강력한 면역 체계를 발전시고 있습니다. 이 논문은 유도체 분자를 사용한 치료 후 애기장대에서 면역 활성화의 강도를 측정하는 데 사용할 수 있는 2개의 검정을 기술합니다. 먼저 제시된 것은 루미놀 계 분석법을 사용하여 모니터링될 수 있는 급속하게 유도되고 동적 산화 버스트를 포착하는 방법이다. 제시된 두 번째는 모종 성장의 면역 유발 억제를 측정하는 방법을 설명하는 방법이다. 이 프로토콜은 빠르고 신뢰할 수 있으며 전문 교육이나 장비가 필요하지 않으며 식물 면역의 유전 적 기초를 이해하는 데 널리 사용됩니다.

돌연변이 cpk28-119,25 및 bak1-517,18 식물은 산화 버스트와 SGI에서 각각 높고 낮은 면역 반응을 가진 유전자형에 대한 예상 결과를 입증하는 데 사용되었습니다. 야생형 배경 대조군(Col-0)을 기준으로 합니다. 투여량 의존적 효과를 평가하기 위해, elf18의 10배 펩타이드 희석 계...

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Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

애기장대에서 패턴 트리거 산화 버스트와 모종 성장 억제 어세

이 논문은 면역 점구체에 노출 된 후 애기장대에서 방어 반응을 정량화하는 두 가지 방법, 즉 일시적인 산화 파열 및 모종 성장 억제에 대해 설명합니다.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

이 약은 다른 식물 유전형의 면역 출력을 평가하고 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 빠르고 신뢰할 수 있으며 일반적인 실험실 장비를 사용한다는 것입니다. 성장 억제 분석의 경우, 동일한 크기와 나이의 묘목을 이식하고 변형을 제한하기 위해 계량하기 전에 건조하게 얼룩져야합니다.발아 후 4~5주 동안 날카로운 4mm 생검 펀치를 사용하여 아라비도시스 식물당 잎 디스크 1개를 제거하고 미드빈을 피하고 상처를 제한하도록 주의하십시오. 건조를 방지하기 위해, 잘, adaxial 측면 최대, 이중 증류수의 100 마이크로 리터를 포함하는 사용되지 않는 96 웰 발광계 플레이트의 개별 우물로 디스크를 수집합니다. 여러 유도인을 평가하는 경우 각 유도체 처리에 대해 동일한 잎에서 두 번째 잎 디스크를 제거하고 뚜껑으로 플레이트를 덮어 잎 디스크가 실온에서 하룻밤 동안 회복될 수 있도록 합니다.다음 아침, 마이크로 플레이트 판독기 매개 변수를 40-60분 동안 2분 간격으로 1, 000밀리초의 통합 시간으로 설정하여 동적 산화 버스트를 캡처합니다. 다음으로, 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 우물의 물을 100 마이크로리터의 새로 준비된 반응 용액으로 대체하며, 각 유전자형에 대한 유도반응, 유도성이 없는 경우 기저 반응 산소 종 수준을 평가할 수 있다. 그런 다음 마이크로 플레이트 판독기의 가시 스펙트럼에서 모든 파장에 대한 광 방출을 즉시 측정합니다.발아 후 4 일 동안, 유도제 펩타이드의 희석으로 보충 MS 배지의 500 마이크로 리터와 48 웰 플레이트의 각 우물을로드합니다. 다음으로, 멸균 집게를 사용하여 동일한 크기의 6~8개의 묘목을 각 펩타이드 희석에 신중하게 이식하고, 뿌리에 모종이나 파손에 손상이 없고 뿌리가 매체에 침수되는 것을 주의한다. 모든 묘목이 도금되면, 마이크로포어 테이프로 접시를 밀봉하고, 8 ~ 12 일 동안 표준 짧은 하루 조건하에서 식물을 배치합니다.백분율 성장 억제를 결정하기 위하여는, 각 우물에서 모종을 주의 깊게 제거하기 전에 시각적으로 성장 억제를 기록하기 위하여 사진을 찍습니다. 그런 다음 종이 타월에 뿌리를 두드려 건조하고 각 모종을 분석 척도로 계량합니다. 이 대표적인 실험에서, 활동적인 면역 신호가 있는 돌연변이 식물은 야생형 아라비도시스 식물에 비해 더 높은 누적 및 평균 산화 파열을 보였으며, 면역 신호가 손상된 돌연변이 식물은 10에서 1, 000 나노몰라 사이의 농도에서 감소된 산화 파열을 나타냈다.모종 성장 억제에 있는 예상된 다름은 또한 100 및 1, 000 나노 몰라 유도기 펩티드 농도에서 성장한 모든 유전자형 사이에서 분별될 수 있었습니다. 1, 000 나노몰라 펩티드 희석에서 재배될 때, 활동적인 면역 신호가 있는 돌연변이는 동일한 조건에서 자란 야생형 식물보다 현저히 작았고, 면역 신호가 손상된 돌연변이체는 야생형 식물에 비해 약한 성장 억제를 나타냈다. 이 방법은 초기와 늦은 면역 반응을 위한 증거를 제공합니다.MAP 키나아제 소사, 병원균 유발 유전자 발현 및 감염 방법을 포함한 여러 가지 다른 기술은 이러한 경로를 묘사하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 병원체 수용체 단백질과 여러 가지 다른 신호 성분을 성공적으로 식별한 대규모 스크린에서 사용하기 위해 수정되었습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

연구

면역학 및 감염병학

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

인간의 혈액에서 측정 과립구와 단핵구 식균 작용 및 산화 버스트 활동

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

특정 성장 속도로 타 바이러스의 세포 바인딩 기능에 대 한 분석

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

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부동 수경 시스템에서 애기장대 뿌리에 세균 식민지화 및 유지 보수 모니터링

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

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종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

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루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 세포내 톡소플라즈마 곤디성장에 대한 화학적 억제제 효율 결정

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...