Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Arbeid i laboratoriet vårt er finansiert gjennom naturressurser og engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery program, den kanadiske stiftelsen for innovasjon John R. Evans Leader ' s Fund, og Queen ' s University. KS og er støttes av tandem Ontario Graduate stipender og NSERC Canada Graduate stipend for Master ' s Students (CGS-M).

1. påvisning av ROS brast i Arabidopsis Leaf plater etter immune elicitation
<ol><li>Plant vekst og vedlikehold.<ol>
<li>For å synkronisere spire, Stratify Arabidopsis frø ved å suspendere ca 50 frø i 1 mL sterilt 0,1% agar [w/v] og lagre ved 4 ° c (ikke lys) for 3-4 dager. Merk: Stratify en vill type bakgrunn kontroll (for eksempel Col-0) og genotyper med høy og lav immun utganger (for eksempel cpk28-1 og bak1-5, henholdsvis) å tjene som interne kontroller.</li>
		<li>Så...

Dette papiret beskriver to metoder for assaying av mønster-utløst immunresponser i Arabidopsis, tilbyr kvantitative tilnærminger til evaluering av immunforsvaret uten bruk av spesialisert utstyr. I kombinasjon, mønster-utløst ROS og SGI kan brukes til å vurdere tidlig og sent svar på mikrobe persepsjon, henholdsvis.
Den store begrensningen av oksidativt burst-analysen er variasjon. Av grunner som ikke er helt forstått, absolutt RLU ofte forskjellig med en størrelsesorden mell...

Å oppfatte og forsvare seg mot patogener, har planter utviklet membran-bundet mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) som oppdager bevarte mikrobielle molekyler utenfor cellen kjent som mikrobe-assosiert molekylær mønstre (MAMPs)1. Bindingen av MAMPs til deres beslektet PRRs initierer protein kinase-mediert immun signalering resulterer i bredspektret sykdom motstand2. En av de tidligste svarene etter PRR aktivering er fosforylering og aktivering av integrert plasma membran RESPIRATORISK BURST OKSIDASE HOMOLOGE (RBOH) proteiner som katalysere produksjonen av ekstracellulære reaktive oksygen arter (ROS)3 , 4. ros spiller en viktig rolle i å etablere sykdomsresistens, opptrer både som sekundær budbringere å spre immun signalering samt direkte antimikrobielle agenter5. Den første observasjon av en immun-elicited oksidativt utbrudd ble beskrevet ved hjelp av potet knoller av CV. Rishiri etter Phytophthora infestans inoculation6. ROS produksjonen har blitt evaluert i flere plantearter ved hjelp av blad plater7, celle suspensjon kulturer8, og protoplasts6. Beskrevet her er en enkel metode for assaying mønster-utløst ROS produksjon i blad plater av Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Som et svar på MAMP persepsjon, aktivert RBOH proteiner katalysere produksjon av superoxide radikaler (O2-), hydroksyl radikaler (• Oh), og singlet oksygen (1O2) som omdannes til hydrogen peroxide (H2o 2) i ekstracellulære plass9. H2O2 kan bli kvantifisert av luminol-baserte kjemiluminescens i nærvær av oksiderende agent pepperrot peroksidase (HRP)10. HRP oksiderer H2O2 GENERERER en natriumhydroksid (Oh−) og oksygen gass (O2) som reagerer med luminol for å produsere en ustabil mellomliggende som frigjør et foton av lys10. Foton utslipp kan være kvantifisert som relative lys enheter (RLU) ved hjelp av en mikroplate leser eller imager i stand til å oppdage luminescence, som har blitt standard stykker av utstyr i de fleste molekylære laboratorier. Ved å måle lyset som produseres over et 40-60-minutters intervall, kan en forbigående oksidativt burst oppdages så tidlig som 2-5 minutter etter elicitor behandling, med topp på 10-20 minutter, og tilbake til basal nivåer etter ~ 60 minutter11. Den kumulative lys produsert over denne tiden kurset kan brukes som et mål på immunforsvaret tilsvarende aktivering av RBOH proteiner12. Beleilig, ikke denne analysen ikke krever spesialisert utstyr eller tungvint prøve forberedelser.
Topp kort tid etter MAMP deteksjon, er oksidativt utbrudd betraktet som en tidlig immunrespons, sammen med MAPK aktivering og etylen produksjon5. Senere uimottakelig responser inkluderer transcriptional omprogrammering, nålene nedleggelse, og callose deponering2,5. Langvarig eksponering for MAMPs kontinuerlig aktiverer energisk-kostbare immun signalering resulterer i Hemming av plantevekst, antyder en trade-off mellom utvikling og immunitet13. Mønster-utløst frøplante veksthemming (SGI) er mye brukt til å vurdere immunforsvaret i Arabidopsis og har vært integrert i identifisering av flere viktige komponenter i immun signalering inkludert PRRs14,15 ,16. Derfor er dette papiret i tillegg presenterer en analyse for mønster-utløst SGI i Arabidopsis, der frøplanter dyrkes i multi-brønn plater som inneholder standard Media eller Media supplert med en immun elicitor for 8-12 dager og deretter veide ved hjelp av en analytisk målestokk.
For å demonstrere hvordan ROS og SGI analyser kan brukes til å overvåke PRR-mediert signalering, tre genotyper som representerer varierende uimottakelig utganger ble valgt: (1) den ville typen Arabidopsis tiltredelse Columbia (Col-0), (2) den dominerende-negative bak1-5 mutant der multi-funksjonell PRR co-reseptor BRASSINOSTEROID ufølsom 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) er ikke-funksjonell i immun signalering17,18, og (3) den resessivt cpk28-1 mutant, som mangler regulatoriske protein kalsium-avhengige protein KINASE 28 (CPK28) og viser økt immun-utløst svar19,20. ROS og SGI analyser er presentert som svar på en syntetisk-produsert elf18 peptid epitope av bakteriell forlengelse Factor Tu (EF-TU), anerkjent i Arabidopsis av PRR EF-Tu RESEPTOR (EFR)15. Disse protokollene kan brukes med andre immune elicitors som bakteriell motilitet protein flagellin14 eller endogene Plant Elicitor proteiner (AtPeps)16, men det bør bemerkes at plante respons varierer avhengig av elicitor21. Sammen kan ROS og SGI analyser brukes for rask og kvantitativ vurdering av tidlig og sent PRR-mediert svar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Planter har utviklet seg et robust immunsystem til å oppfatte patogener og beskytte mot sykdom. Dette papiret beskriver to analyser som kan brukes til å måle styrken av immun aktivering i Arabidopsis thaliana etter behandling med elicitor molekyler. Presentert først er en metode for å fange den raskt indusert og dynamisk oksidativt utbrudd, som kan overvåkes ved hjelp av en luminol-basert analyse. Presentert andre er en metode som beskriver hvordan å måle immun-indusert hemming av frøplante vekst. Disse protokollene er rask og pålitelig, ikke krever spesialisert opplæring eller utstyr, og er mye brukt til å forstå det genetiske grunnlaget for anlegget immunitet.

Mutant cpk28-119,25 og bak1-517,18 planter ble brukt til å demonstrere forventede utfall for genotyper med høye og lave immunresponser, henholdsvis i oksidativt utbrudd og SGI analyser i forhold til en vill-type bakgrunns kontroll (Col-0). For å vurdere dose avhengige effekter, en 10-fold peptid fortynning serie (1-1000 nM) av elf18 ble brukt. Som forv...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Mønster-utløst oksidativt burst og frøplante Veksthemming analyser i Arabidopsis thaliana

Dette papiret beskriver to metoder for kvantifisere forsvar responser i Arabidopsis thaliana etter eksponering for immun elicitors: forbigående oksidativt utbrudd, og hemming av frøplante vekst.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Disse analysene kan brukes til å vurdere og sammenligne immunutganger av forskjellige plantegenotyper. Den største fordelen med disse teknikkene er at de er raske, pålitelige og bruker felles laboratorieutstyr. For veksthemmingsanalysen bør frøplanter av samme størrelse og alder transplanteres og fullstendig blotted tørr før veiing for å begrense variasjonen.Ved fire til fem uker etter spiring, bruk en skarp fire millimeter biopsi punch for å fjerne ett blad plate per Arabidopsis plante, unngå midvein og være forsiktig med å begrense såret. Samle platene i individuelle brønner av en ubrukt 96-brønns luminometerplate som inneholder 100 mikroliter dobbeltdestillert vann per brønn, adaksial side opp, for å hindre utskalking. Hvis du vurderer flere elicitors, fjern en annen bladplate fra samme blad for hver elicitorbehandling, og dekk platen med lokket slik at bladskivene kan gjenopprette over natten ved romtemperatur.Neste morgen setter du mikroplateleserparametrene til en 1000 millisekundintegrasjonstid i to minutters intervaller over en periode på 40 til 60 minutter for å fange opp det dynamiske oksidative utbruddet. Deretter bruker du en flerkanals pipette til å erstatte vannet i hver brønn med 100 mikroliter nylaget reaksjonsløsning, inkludert en kontroll, ingen elicitor reaksjon for hver genotype for å vurdere basal reaksjon oksygen arter nivåer i fravær av elicitation. Deretter måler du umiddelbart lysutslippet for alle bølgelengdene i det synlige spekteret på mikroplateleseren.Ved fire dager etter spiring, last hver brønn av en 48-brønns plate med 500 mikroliter MS medium supplert med en fortynning av elicitor peptid. Deretter bruker du sterile tang til å nøye transplantere seks til åtte frøplanter av samme størrelse, alder og genotype til hver peptidfortynning, og vær forsiktig med at det ikke er noen skade på frøplanten eller bruddet på roten, og at roten er nedsenket i middels. Når alle plantene er belagt, forsegle platene med Micropore tape, og plasser plantene under standard kortdagsforhold i åtte til 12 dager.For å bestemme prosentveksthemmingen, ta et bilde for å visuelt registrere veksthemmingen før du forsiktig fjerner plantene fra hver brønn. Deretter dab røttene på et papirhåndkle for å tørke, og veie hver frøplante på en analytisk skala. I dette representative eksperimentet viste muterte planter med hyperaktiv immunsignalering en høyere kumulativ og gjennomsnittlig oksidativ utbrudd sammenlignet med vill-type Arabidopsis planter, mens muterte planter med nedsatt immunsignal viste en redusert oksidativ utbrudd i konsentrasjoner mellom 10 og 1000 nanomolar.Forventede forskjeller i frøplanteveksthemming kan også skjelnes mellom alle genotypene som dyrkes i 100 og 1000 nanomolar elicitor peptidkonsentrasjoner. Når de dyrkes i 1000 nanomolar peptid fortynning, mutanter med hyperaktiv immunsignalering var markert mindre enn vill-type planter dyrket under samme forhold, mens mutanter med nedsatt immunsignal viste en svak hemming av vekst i forhold til vill-type planter. Disse metodene gir bevis for tidlig og sen immunrespons.Flere andre teknikker, inkludert MAP kinaseanalyser, patogen-indusert genuttrykk og infeksjonsanalyser, kan brukes til å avgrense disse banene. Disse teknikkene har blitt modifisert for bruk i store skjermer, som har identifisert patogenreseptorproteiner og flere andre signalkomponenter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifisering av Respiratory Burst Response som en indikator på medfødte immun Health i sebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Bruke Fluorescent Proteiner å visualisere og kvantifisere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vekst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergi og Oksidativt Burst: Protokoller for isolering og evaluering av humane leukocytter og blodplater

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bakteriell Leaf Infiltrasjon analysen for Fine Karakterisering av Plant forsvar svar bruker<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudo syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Måling granulocytt og Monocyte Fagocytose og Oksidativt Burst Aktiviteten i Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Screening analyser betegner romanen Endothelial regulatorer involvert i inflammatorisk respons

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Analyser for spesifikk vekstrate og celle-bindende evne til Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Overvåking bakteriell kolonisering og vedlikehold på Arabidopsis thaliana røtter i en flytende hydroponic system

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Skreddersy in vivo cytotoksisitet analyser for å studere Immunodominance i tumor spesifikke CD8+ T celle svar

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Bestemmelse av kjemisk inhibitoreffektivitet mot intracellulær toxoplasma Gondii-vekst ved hjelp av en Luciferase-basert vekstanalyse

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...