Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

O trabalho em nosso laboratório é financiado através do programa de descoberta de recursos naturais e engenharia de pesquisa do Canadá (NSERC), a Fundação Canadense para a inovação John R. Evans Leader ' s Fund, e da Queen ' s University. KS e é são apoiados por tandem Ontario bolsas de pós-graduação e NSERC Canadá bolsas de pós-graduação para estudantes de mestrado (CGS-M).

1. detecção de ROS estourou em discos de folhas de Arabidopsis após Elicitação imunológica
<ol><li>Crescimento e manutenção de plantas.<ol>
<li>Para sincronizar a germinação, estratifique as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 ml de agar estéril 0,1% [w/v] e armazene a 4 ° c (sem luz) por 3-4 dias. Nota: estratifique um controle de fundo de tipo selvagem (por exemplo, Col-0) e genótipos com saídas imunes altas e baixas (por exemplo, cpk28-1 e ...

Este trabalho descreve dois métodos para a avaliação de respostas imunes desencadeadas por padrão em Arabidopsis, oferecendo abordagens quantitativas para avaliar a produção imune sem o uso de equipamentos especializados. Em combinação, ROS e SGI acionados por padrão podem ser usados para avaliar respostas precoces e tardias à percepção de micródios, respectivamente.
A maior limitação do ensaio de explosão oxidativa é a variabilidade. Por razões que não são complet...

Para perceber e se defender contra patógenos, as plantas evoluíram com receptores de reconhecimento de padrões ligados à membrana (PRRs) que detectam moléculas microbianas conservadas fora da célula conhecida como padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs)1. A ligação de mamps a seus PRRS cognato inicia a sinalização imune quinase-negociada proteína tendo por resultado a resistência de doença do largo-espectro2. Uma das primeiras respostas após a ativação do PRR é a fosforilação e a ativação de proteínas integrais de membrana plasmática respiratória BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalisam a produção de espécies reativas de oxigênio extracelular (ROS)3 , 4. Ros desempenham um papel importante no estabelecimento de resistência à doença, atuando tanto como mensageiros secundários para propagar a sinalização imune, bem como agentes antimicrobianos diretos5. A primeira observação de um surto oxidativo imune-eliciado foi descrita usando tubérculos de batata de CV. Rishiri após a inoculação de Phytophthora infestans 6. A produção de Eros foi avaliada em diversas espécies vegetais utilizando discos foliares7, culturas de suspensão celular8e protoplastos6. Descrito aqui é um método simples para a produção de ROS desencadeados por padrão em discos foliares de Arabidopsis Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Como resposta à percepção MAMP, as proteínas ativadas de RbOH catalisam a produção de radicais de superóxido (o2-), radicais hidroxilo (• Oh) e oxigênio singlet (1o2) que são convertidos em peróxido de hidrogênio (H2o 2) no espaço extracelular9. H2o2 pode ser quantificado por quimioluminescência à base de luminol na presença do agente oxidante peroxidase de rábano (HRP)10. HRP oxida H2O2 gerando um íon hidróxido (Oh−) e gás de oxigênio (O2) que reagem com luminol para produzir um intermediário instável que libera um fóton de luz10. A emissão de fótons pode ser quantificada como unidades de luz relativa (RLUs) usando um leitor de microplacas ou Imager capaz de detectar luminescência, que se tornaram peças padrão de equipamentos na maioria dos laboratórios moleculares. Medindo a luz produzida sobre um intervalo de 40-60 minutos, um estouro oxidativo transiente pode ser detectado tão cedo quanto 2-5 minutos após o tratamento do elicitores, atingindo o pico em 10-20 minutos, e retornando aos níveis básicos após ~ 60 minutos11. A luz cumulativa produzida sobre este curso do tempo pode ser usada como uma medida da força imune que corresponde à ativação de proteínas de RBOH12. Convenientemente, este ensaio não exige o equipamento especializado ou a preparação incômoda da amostra.
Pico logo após a detecção da MAMP, a explosão oxidativa é considerada uma resposta imune precoce, juntamente com a ativação do MAPK e a produção de etileno5. As respostas imunes posteriores incluem reprogramação transcricional, fechamento estomático e deposição de calose2,5. A exposição prolongada aos MAMPs ativa continuamente a sinalização imune energeticamente dispendiosa, resultando na inibição do crescimento vegetal, indicativo de um trade-off entre o desenvolvimento e a imunidade13. A inibição do crescimento de plântulas desencadeada por padrão (SGI) é amplamente utilizada para avaliar a produção imune em Arabidopsis e tem sido parte integrante da identificação de vários componentes-chave da sinalização imune, incluindo PRRS 14,15 ,16. Conseqüentemente, este papel apresenta adicionalmente um ensaio para o SGI Pattern-desencadeado em Arabidopsis, por meio de que as plântulas são crescidas em placas do multi-poço que contêm meios ou meios padrão suplementados com um elicitores imune por 8-12 dias e pesaram então utilizando uma escala analítica.
Para demonstrar como os ensaios ROS e SGI podem ser usados para monitorar a sinalização mediada por PRR, três genótipos que representam diferentes saídas imunes foram escolhidos: (1) o tipo selvagem de adesão de Arabidopsis Columbia (Col-0), (2) o dominante-negativo bak1-5 mutante em que o coreceptor multi-funcional de PRR brassinosteroid insensivel 1-associado quinase 1 (BAK1) é não-funcional na sinalização imune17,18, e (3) o mutante cpk28-1 recessive, que não possui o proteínas reguladoras proteína quinase dependente de cálcio 28 (CPK28) e monitores intensificados respostas imunes-desencadeadas19,20. Os ensaios ROS e SGI são apresentados em resposta a um epítopo de peptídeo elf18 produzido sinteticamente de fator de alongamento bacteriano tu (EF-tu), reconhecido em Arabidopsis pelo receptor PRR EF-tu (EFR)15. Estes protocolos podem ser usados com outros indutores imunes tais como a proteína da motilidade bacteriana flagelina14 ou proteínas endógenas do elicitor da planta (atpeps)16, entretanto, deve-se notar que a responsividade da planta difere dependendo do elicitores21. Juntos, os ensaios ROS e SGI podem ser utilizados para a avaliação rápida e quantitativa das respostas mediadas pelo PRR precoce e tardia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

As plantas evoluíram um sistema imunológico robusto para perceber patógenos e proteger contra a doença. Este papel descreve dois ensaios que podem ser usados para medir a força da ativação imune no Arabidopsis thaliana de Arabidopsis que segue o tratamento com moléculas do elicitores. Apresentado em primeiro lugar é um método para capturar o estouro oxidativo rápido-induzido e dinâmico, que pode ser monitorado usando um ensaio luminol-baseado. O segundo apresentado é um método que descreve como medir a inibição imune-induzida do crescimento de plântulas. Estes protocolos são rápidos e de confiança, não exigem o treinamento ou o equipamento especializado, e são amplamente utilizados compreender a base genética da imunidade da planta.

Mutantes cpk28-119,25 e bak1-517,18 plantas foram utilizadas para demonstrar os desfechos esperados para genótipos com respostas imunes altas e baixas, respectivamente, em burst oxidativo e SGI ensaios em relação a um controle de fundo de tipo selvagem (Col-0). Para avaliar os efeitos dose-dependentes, uma série de diluição do peptide 10-fold (1-100...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Este trabalho descreve dois métodos para quantificar as respostas de defesa em Arabidopsis Arabidopsis thaliana após a exposição aos elicitors imunes: o estouro oxidativo transiente, e a inibição do crescimento de plântulas.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Estes ensaios podem ser usados para avaliar e comparar saídas imunológicas de diferentes genótipos vegetais. A principal vantagem dessas técnicas é que elas são rápidas, confiáveis e usam equipamentos de laboratório comuns. Para o ensaio de inibição do crescimento, as mudas do mesmo tamanho e idade devem ser transplantadas e totalmente borradas secas antes de pesar para limitar a variação.Em quatro a cinco semanas após a germinação, use um soco de biópsia de quatro milímetros para remover um disco de folha por planta arabidopse, evitando a midveina e tomando cuidado para limitar a ferida. Colete os discos em poços individuais de uma placa luminômetro nãoutilada contendo 100 microliters de água duplamente destilada por poço, lado adaxial para cima, para evitar a dessecação. Se avaliar vários elicitors, remova um segundo disco de folha da mesma folha para cada tratamento elicitor e cubra a placa com a tampa para permitir que os discos da folha se recuperem durante a noite à temperatura ambiente.Na manhã seguinte, defina os parâmetros do leitor de microplapes para um tempo de integração de 1.000 milissegundos em intervalos de dois minutos durante um período de 40 a 60 minutos para capturar a explosão oxidativa dinâmica. Em seguida, use uma pipeta multicanal para substituir a água em cada poço por 100 microliters de solução de reação recém-preparada, incluindo um controle, nenhuma reação elicitor para cada genótipo para avaliar os níveis de espécies de oxigênio de reação basal na ausência de provocação. Em seguida, meça imediatamente a emissão de luz para todos os comprimentos de onda no espectro visível no leitor de microplaca.Aos quatro dias pós-germinação, carregue cada poço de uma placa de 48 poços com 500 microliters de MS médio suplementado com uma diluição de peptídeo elicitor. Em seguida, use fórceps estéreis para transplantar cuidadosamente seis a oito mudas do mesmo tamanho, idade e genótipo para cada diluição de peptídeos, tomando cuidado para que não haja danos à muda ou quebra da raiz e que a raiz esteja submersa em meio. Quando todas as mudas tiverem sido banhadas, sele as placas com fita micropora e coloque as plantas em condições padrão de curto-dia por oito a 12 dias.Para determinar a inibição percentual de crescimento, tire uma foto para registrar visualmente a inibição do crescimento antes de remover cuidadosamente as mudas de cada poço. Em seguida, descarar as raízes em uma toalha de papel para secar, e pesar cada muda em uma escala analítica. Neste experimento representativo, plantas mutantes com sinalização imune hiperativa demonstraram uma maior explosão oxidativa acumulada e média em comparação com plantas arabidopsis do tipo selvagem, enquanto plantas mutantes com sinalização imunológica prejudicada apresentaram uma explosão oxidativa reduzida em concentrações entre 10 e 1.000 nanomolar.Diferenças esperadas na inibição do crescimento das mudas também podem ser discernidas entre todos os genótipos cultivados em 100 e 1.000 concentrações de peptídeos nanomolares. Quando cultivados na diluição de peptídeos nanomolar de 1.000, os mutantes com sinalização imunológica hiperativa eram notavelmente menores do que as plantas do tipo selvagem cultivadas sob as mesmas condições, enquanto os mutantes com sinalização imunológica prejudicada exibiam uma fraca inibição do crescimento em relação às plantas do tipo selvagem. Esses métodos fornecem evidências de respostas imunes precoces e tardias.Várias outras técnicas, incluindo ensaios de quinase MAP, expressão genética induzida por patógenos e ensaios de infecção, podem ser usadas para delinear essas vias. Estas técnicas foram modificadas para uso em telas de grande escala, que identificaram com sucesso proteínas receptoras de patógenos e vários outros componentes de sinalização.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Imunologia e Infecção

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patossistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Ensaios para a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...