Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Работа в нашей лаборатории финансируется через Природные ресурсы и инженерные исследования Совета Канады (NSERC) Discovery Program, Канадский фонд инноваций Джон Р. Эванс Лидер фонда, и Королевский университет. KS и IS поддерживаются тандемом Онтарио аспирантские стипендии и NSERC Канада стипендии для студентов магистра (CGS-M).

1. Обнаружение ВСПЛЕСКа ROS в дисках листьев Arabidopsis после иммунной выскания
<ol><li>Рост и техническое обслуживание растений.<ol>
<li>Чтобы синхронизировать прорастание, расслоите семена арабидопсиса, приостановив около 50 семян в 1 мл стерильных 0,1% агара и хранить при 4 градусах Цельс...

В настоящем документе описаны два метода для оценки шаблона триггерных иммунных реакций в Arabidopsis, предлагая количественные подходы к оценке иммунной продукции без использования специализированного оборудования. В сочетании, срабатывающие шаблонЫ ROS и SGI могут быть использованы д...

Чтобы воспринимать и защищать от патогенных микроорганизмов, растения эволюционировали мембраны связаны рецепторы распознавания образов (PRRs), которые обнаруживают сохраненные молекулы микробов за пределами клетки, известные как микроб связанных молекулярных моделей (MAMPs)1. Привязка MAMPs к их cognate PRRs инициирует протеин киназы-опосредованную иммунную сигнализацию, приводящую к устойчивости болезни широкого спектра2. Одной из самых ранних реакций после активации PRR является фосфорилирование и активация интегральной плазменной мембраны RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) белков, которые катализморают производство внеклеточных реактивных видов кислорода (ROS)3 , 4. ROS играют важную роль в установлении устойчивости к болезням, действуя как вторичные посланники для распространения иммунной сигнализации, а также прямые противомикробные агенты5. Первое наблюдение иммунно-elicited окислительного всплеска был описан с использованием клубней картофеля cv. Rishiri после Phytophthora infestans прививки6. ROS производство было оценено в несколькихвидов растений с использованием листовых дисков 7, клеточной суспензии культур8, и протопласты6. Описанный здесь простой метод для assaying шаблон-спровоцированный производство ROS в листовых дисках Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
В ответ на восприятие MAMP, активированные белки RBOH катализируют производство супероксидных радикалов (O2- ),гидроксиловые радикалы (ЗОХ) и синглетного кислорода (1O2), которые преобразуются в перекись водорода (H2O 2)во внеклеточном пространстве9. H2O2 может быть количественно люминол основе химилюминесценции в присутствии окислительного агента хрен пероксидаза (HRP)10. HRP окисляет H2O2 генерации гидроксидного иона (OH)и кислородного газа (O2), которые реагируют с люминолом для получения нестабильного промежуточного, который выпускает фотон света10. Фотон-излучение может быть количественно оценено как относительные световые единицы (RLUs) с помощью микроплитного считывателя или изображения, способного обнаруживать люминесценцию, которая стала стандартным оборудованием в большинстве молекулярных лабораторий. Путем измерять свет произведенный над интервалом 40-60 минут, преходящий окислительный взрыв можно обнаружить уже через 2-5 минут после обработки вымлитора, достигая пика на 10-20 минутах, и возвращающ к базальным уровням после q60 минут11. Кумулятивный свет, производимый в течение этого времени, может быть использован в качестве меры иммунной силы, соответствующей активации белков RBOH12. Удобно, что этот анализ не требует специализированного оборудования или громоздкой подготовки образца.
Пик вскоре после обнаружения MAMP, окислительный всплеск считается ранним иммунным ответом, наряду с активацией MAPK и производством этилена5. Позже иммунные реакции включают транскрипционного перепрограммирования, стоматальное закрытие, и осаждение клилоза2,5. Длительное воздействие MAMPs постоянно активирует энергично-дорогостоящие иммунные сигнализации в результате ингибирования роста растений, что свидетельствует о компромиссе между развитием и иммунитетом13. Шаблон триггеров роста саженцев (SGI) широко используется для оценки иммунной продукции в Арабидопсис и был неотъемлемой частью выявления нескольких ключевых компонентов иммунной сигнализации, включая PRRs14,15 ,16. Таким образом, в этой статье дополнительно представлена ассс для шаблона срабатывает SGI в Arabidopsis, в котором саженцы выращиваются в нескольких колодцев, содержащих стандартные средства массовой информации или средств массовой информации дополняется иммунной выдыхатель в течение 8-12 дней, а затем весил с помощью аналитической шкалы.
Чтобы продемонстрировать, как ROS и SGI анализы могут быть использованы для мониторинга PRR-опосредованной сигнализации, три генотипа, которые представляют различные иммунные выходы были выбраны: (1) дикий тип Arabidopsis присоединения Колумбии (Col-0), (2) доминирующей отрицательной bak1-5 мутант, в котором многофункциональный PRR ко-рецептор BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-АССОЦИированный КИНАС1 (BAK1) является нефункциональным в иммунной сигнализации17,18,и (3) рецессивный cpk28-1 мутант, который не хватает регуляторный белок CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) и отображает повышенные иммунные реакции19,20. ROS и SGI анализы представлены в ответ на синтетически производства эльф18 пептид эпитоп бактериального фактора удлинения Ту (EF-Tu), признанных в Arabidopsis PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Эти протоколы могут быть использованы с другими иммунными вылиторами, такими как бактериальная мотилизирующая белка flagellin14 или эндогенных растительных белков elicitor (AtPeps)16, однако, следует отметить, что отзывчивость растений отличается в зависимости от элицитор21. Вместе, ROS и SGI анализы могут быть использованы для быстрой и количественной оценки ранних и поздних PRR-опосредованных ответов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Растения развили надежную иммунную систему, чтобы воспринимать патогенные микроорганизмы и защищать от болезней. В этой статье описаны два анализа, которые могут быть использованы для измерения силы иммунной активации в Arabidopsis thaliana после лечения с молекулами выжидателя. Представленпервый первый метод для захвата быстро индуцированного и динамического окислительного всплеска, который может контролироваться с помощью наблюдения на основе люминола. Представлен второй метод, описывающий, как измерить иммунно-индуцированного ингибирования роста рассады. Эти протоколы являются быстрыми и надежными, не требуют специальной подготовки или оборудования, и широко используются для понимания генетической основы иммунитета растений.

Мутант cpk28-119,25 и bak1-517,18 растений были использованы для демонстрации ожидаемых результатов для генотипов с высокими и низкими иммунными реакциями, соответственно, при окислительном взрыве и SGI ан...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Шаблон-Triggered Окислительный взрыв и рассады Ингибирование роста Анализы в Arabidopsis талиана

В настоящем документе описаны два метода количественной оценки ответов на защиту в Arabidopsis thaliana после воздействия иммунных вырезов: преходящий окислительный всплеск и ингибирование роста рассады.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Эти анализы могут быть использованы для оценки и сравнения иммунных выходов различных генотипов растений. Основным преимуществом этих методов является то, что они быстры, надежны и используют общее лабораторное оборудование. Для анализа ингибирования роста, саженцы того же размера и возраста должны быть пересажены и полностью смыты сухим перед взвешиванием, чтобы ограничить изменение.На четыре-пять недель после прорастания, использовать резкий четырехмиллиметровый пунш биопсии, чтобы удалить один лист диска на растение Arabidopsis, избегая среднего и быть осторожным, чтобы ограничить ранение. Соберите диски в отдельные скважины неиспользованной 96-хорошо люминометрической пластины, содержащей 100 микролитров двойной дистиллированной воды на скважину, адаксиальной стороны вверх, чтобы предотвратить высыхание. При оценке нескольких elicitors, удалить второй лист диска из одного и того же листа для каждого elicitor лечения, и покрыть пластину крышкой, чтобы лист дисков восстановить ночь при комнатной температуре.На следующее утро установите параметры считыватель микропластинок до 1000-миллисекундного времени интеграции за двухминутные интервалы в течение 40-60-минутного периода для захвата динамического окислительного всплеска. Далее, используйте многоканальный пипетку, чтобы заменить воду в каждой колодец с 100 микролитров свежеприготовленного раствора реакции, включая контроль, никакую реакцию разгора для каждого генотипа для оценки базальной реакции уровней кислорода при отсутствии вызвали. Затем немедленно измерьте излучение света для всех длин волн в видимом спектре на считыватель микроплюсов.В течение четырех дней после прорастания, загрузить каждый колодец 48-хорошо пластины с 500 микролитров MS среды дополняется разбавления пептида elicitor. Затем используйте стерильные типсы, чтобы тщательно пересадить шесть-восемь саженцев одного размера, возраста и генотипа на каждое разбавление пептида, заботясь о том, чтобы не было повреждений рассады или поломки корня и чтобы корень погружался в среду. Когда все саженцы были помойки, печать пластин с Micropore ленты, и место растений в стандартных условиях короткий день в течение восьми до 12 дней.Чтобы определить процентное торможение роста, сделайте фотографию, чтобы визуально зафиксировать ингибирование роста, прежде чем тщательно удалить саженцы из каждой хорошо. Затем, мазок корни на бумажное полотенце, чтобы высохнуть, и взвесить каждый рассады в аналитическом масштабе. В этом репрезентативном эксперименте мутантные растения с гиперактивной иммунной сигнализацией продемонстрировали более высокий кумулятивный и средний окислительный всплеск по сравнению с растениями арабидопсиса дикого типа, в то время как мутантные растения с нарушениями иммунной сигнализации показали снижение окислительного всплеска в концентрациях от 10 до 1000 наномолярных.Ожидаемые различия в ингибировании роста рассады также можно различить между всеми генотипами, выращенными в 100 и 1000 наномолярных пептидных концентрациях. Когда они выращивались в разбавлении пептида 1000 наномолеров, мутанты с гиперактивной иммунной сигнализацией были заметно меньше, чем растения дикого типа, выращенные в тех же условиях, в то время как мутанты с ослабленной иммунной сигнализацией проявляли слабое торможение роста по отношению к растениям дикого типа. Эти методы дают доказательства раннего и позднего иммунного ответа.Для разграничения этих путей можно использовать ряд других методов, включая анализы киназы MAP, экспрессию генов, вызванных патогенами, и анализы инфекций. Эти методы были модифицированы для использования в крупномасштабных экранах, которые успешно определили патогенные рецепторы белков и ряд других сигнальных компонентов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Количественная оценка респираторный взрыв ответ как показатель врожденной иммунной здравоохранения в данио рерио

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной<em&gt; Хламидиоз</em&gt; Вакуоли Динамика роста в живых клетках

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Биоэнергетика и окислительного: протоколах выделения и оценки человека лейкоцитов и тромбоцитов

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Бактериальный лист инфильтрация Анализ на тонкой Характеристика защитных реакций растений с помощью<em&gt; Резуховидка Таля-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Измерение гранулоцитов и моноцитов Фагоцитоз и окислительный взрыв активности в крови человека

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Скрининг Assays характеризовать Роман эндотелиальной регуляторы, участвующих в воспалительной реакции

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Анализы для конкретных рост и способность клеток привязки ротавирусной инфекции

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Мониторинг бактериальной колонизации и технического обслуживания на арабидопсис thaliana Корни в плавающей гидропонной системы

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Портняжное в естественных условиях цитотоксичности исследования для изучения Иммунодоминирования в опухоль конкретных CD8+ т ячейки ответы

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Определение эффективности химического ингибитора против внутриклеточного токсоплазмы Gondii Рост С помощью Люциферазы основе анализ роста

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...