Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Arbetet i vårt labb finansieras genom naturresursernas och ingenjörs forskningens råd (NSERC) Discovery program, den kanadensiska Stiftelsen för innovation John R. Evans Leader ' s Fund, och Queen ' s University. KS och är stöds av tandem Ontario Graduate stipendier och NSERC Kanada Graduate stipendier för masterstudenter (CGS-M).

1. detektion av ROS burst i Arabidopsis löv skivor efter immunelicitation
<ol><li>Växternas tillväxt och underhåll.<ol>
<li>För att synkronisera grobarheten, stratifiera Arabidopsis frön genom att skjuta upp cirka 50 frön i 1 mL steril 0,1% agar [w/v] och förvara vid 4 ° c (ingen ljus) för 3-4 dagar. Notera: stratifiera en Wild typ bakgrundskontroll (till exempel, Col-0) och genotyper med höga och låga immun utgångar (till exempel cpk28-1 och bak1-5, respektive) att f...

Denna uppsats beskriver två metoder för testmetoder mönster-utlöst immunsvar i Arabidopsis, erbjuder kvantitativa metoder för att utvärdera immun produktionen utan användning av specialiserad utrustning. I kombination, mönster-utlöst ros och SGI kan användas för att bedöma tidiga och sena svar på mikrob perception, respektive.
Den största begränsningen av den oxidativa burst-analysen är variation. Av skäl som inte är helt klarlagda, absoluta RLUs skiljer sig ofta med...

Att uppfatta och försvara sig mot patogener, växter har utvecklats membran-bundna mönsterigenkänning receptorer (PRRs) som upptäcker bevarade mikrobiella molekyler utanför cellen kallas Microbe-associerade molekylära mönster (MAMPs)1. Bindningen av mamps till deras besläktat PRRS initierar proteinkinas-medierad immun signalering vilket resulterar i bredspektrum sjukdoms resistens2. En av de tidigaste Svaren efter PRR aktiveringen är fosforylering och aktivering av integrerad plasmamembran respiratorisk BURST OXIDAS HOMOLOG (RBOH) proteiner som katalyserar produktionen av extracellulära reaktiva syreradikaler (ROS)3 , 4. ros spelar en viktig roll i att fastställa sjukdoms beständighet, agerar både som sekundära budbärare att propagera immun signalering samt direkta antimikrobiella medel5. Den första observationen av en immunsuppressiva oxidativ explosion beskrevs med hjälp av potatisknölar av CV. Rishiri efter Phytophthora infestans inympning6. ROS produktion har utvärderats i flera växtarter med hjälp av blad skivor7, cellsuspension kulturer8, och protoplasts6. Beskrivs här är en enkel metod för testmetoder mönster-utlöst ros produktion i blad skivor av Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Som ett svar på MAMP perception, aktiverade rboh proteiner katalysera produktionen av superoxid radikaler (O2-), hydroxylradikaler (• OH), och linne syre (1o2) som omvandlas till väteperoxid (H2o 2) i extracellulära rymden9. H2O2 kan kvantifieras med luminol-baserad chemiluminescens i närvaro av oxidationsmedlet pepparrot PEROXIDAS (HRP)10. HRP oxiderar H2O2 och genererar en HYDROXIDJON (Oh−) och syre gas (O2) som reagerar med luminol för att framställa en instabil intermediär som frigör en fotton av ljus10. Photon emission kan kvantifieras som relativ ljusenheter (RLUs) med hjälp av en mikroplattläsare eller Imager som kan detektera Luminescens, som har blivit standarddelar av utrustning i de flesta molekylära laboratorier. Genom att mäta ljuset som produceras under en 40-60-minuters intervall, en övergående oxidativ burst kan upptäckas så tidigt som 2-5 minuter efter elicitor behandling, topp på 10-20 minuter, och återvänder till basal nivåer efter ~ 60 minuter11. Det kumulativa ljus som produceras under denna tid kurs kan användas som ett mått på immunförsvaret som motsvarar aktiveringen av RBOH proteiner12. Bekvämt, denna analys kräver inte specialiserad utrustning eller besvärliga provberedning.
Peaking kort efter MAMP upptäckt, den oxidativa burst anses vara ett tidigt immunsvar, tillsammans med MAPK aktivering och etenproduktion5. Senare immunsvar inkluderar transkriptionell omprogrammering, stomatala stängning, och callose deposition2,5. Långvarig exponering för MAMPs aktiverar kontinuerligt energiskt kostsamma immun signalering resulterar i hämning av växternas tillväxt, tyder på en avvägningen mellan utveckling och immunitet13. Mönsterutlöst Groddplanta tillväxthämning (SGI) används ofta för att bedöma immun produktionen i Arabidopsis och har varit en integrerad del av identifieringen av flera viktiga komponenter i immun signalering inklusive PRRS14,15 ,16. Därför presenterar detta papper dessutom ett test för mönster-utlöst SGI i Arabidopsis, varvid plantor odlas i multi-well tallrikar som innehåller standardmedier eller media kompletteras med en immun elicitor för 8-12 dagar och sedan vägde med hjälp av en analytisk skala.
För att demonstrera hur ROS-och SGI-analyser kan användas för att övervaka PRR-medierad signalering valdes tre genotyper som representerar olika immun utgångar: (1) Wild Type Arabidopsis anslutning Columbia (Col-0), (2) den dominerande-negativa bak1-5 Mutant där multifunktionell PRR Co-receptor brassinosteroid okänslig 1-associerad Kinas 1 (BAK1) är icke-funktionell i immun signalering17,18, och (3) den recessiv cpk28-1 Mutant, som saknar den reglerande protein kalciumberoende proteinkinas 28 (CPK28) och visar förhöjda immunsuppressiva svar19,20. Analyser av ROS och SGI presenteras som svar på en syntetiskt producerad elf18 peptid epitop av bakteriell Elongation Factor tu (EF-TU), erkänd i Arabidopsis av PRR EF-tu-receptorn (EFR)15. Dessa protokoll kan användas med andra immunologiska elicitorer såsom bakteriell motilitet protein flagellin14 eller endogena växt Elixir proteiner (AtPeps)16, det bör dock noteras att anläggningens reaktionsförmåga varierar beroende på elicitor21. Tillsammans kan ROS-och SGI-analyser användas för snabb och kvantitativ bedömning av tidiga och sena PRR-medierade svar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Växter har utvecklats ett robust immunförsvar att uppfatta patogener och skydda mot sjukdomar. Denna uppsats beskriver två analyser som kan användas för att mäta styrkan av immunförsvaret aktivering i Arabidopsis thaliana efter behandling med elicitor molekyler. Presenteras först är en metod för att fånga den snabbt inducerad och dynamisk oxidativ burst, som kan övervakas med hjälp av en luminol-baserad analys. Presenteras andra är en metod som beskriver hur man mäter immun-inducerad hämning av plantan tillväxt. Dessa protokoll är snabba och pålitliga, kräver inte specialiserad utbildning eller utrustning, och används i stor utsträckning för att förstå den genetiska grunden för växt immunitet.

Mutant cpk28-119,25 och bak1-517,18 växter användes för att demonstrera förväntade utfall för genotyper med högt och lågt immunsvar, respektive, i oxidativ burst och SGI analyser i förhållande till en Wild-Type bakgrundskontroll (Col-0). För att bedöma dosberoende effekter användes en 10-faldig peptid spädningsserie (1-1000 nM) elf18. Som v?...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Mönster-utlöst oxidativ burst och Groddplanta tillväxthämning i Arabidopsis thaliana

Denna uppsats beskriver två metoder för att kvantifiera försvars svar i Arabidopsis thaliana efter exponering för immunelicitors: den övergående oxidativ bristning, och hämning av plantan tillväxt.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Dessa analyser kan användas för att bedöma och jämföra immunutgångar av olika växt genotyper. Den största fördelen med dessa tekniker är att de är snabba, tillförlitliga, och använder vanliga laboratorieutrustning. För tillväxthämningsanalysen ska plantor av samma storlek och ålder transplanteras och helt blottas torrt innan de väger för att begränsa variationen.Vid fyra till fem veckor efter groning, använd en skarp fyra millimeter biopsi punch för att ta bort ett blad skiva per Arabidopsis växt, undvika midvein och vara noga med att begränsa sår. Samla upp skivorna i enskilda brunnar av en oanvänd 96-brunn luminometerplatta som innehåller 100 mikroliter dubbeldestillerat vatten per brunn, adaxial sida upp, för att förhindra uttorkning. Om man bedömer flera elicitors, ta bort en andra bladskiva från samma blad för varje elicitorbehandling, och täck över plattan med locket så att bladskivorna kan återhämta sig över natten i rumstemperatur.Nästa morgon, ställ in mikroplatt läsare parametrar till en 1, 000-millisekkunder integrationstid i två minuters intervall under en 40-till 60-minuters period för att fånga den dynamiska oxidativ burst. Därefter använder en flerkanalspipett för att ersätta vattnet i varje brunn med 100 mikroliter av nyberedda reaktionslösning, inklusive en kontroll, ingen elicitorreaktion för varje genotyp för att bedöma de basala reaktionssyresternas nivåer i frånvaro av elicitation. Sedan, omedelbart mäta ljusemissionen för alla våglängder i det synliga spektrumet på mikroplattan läsaren.Vid fyra dagar efter grobarhet, ladda varje brunn av en 48-brunnsplatta med 500 mikroliter av MS-medium kompletterat med en utspädning av elicitorpeptid. Därefter använder sterila tänjas för att noggrant transplantera sex till åtta plantor av samma storlek, ålder, och genotyp till varje peptidspädning, var noga med att det inte finns någon skada på plantan eller brott till roten och att roten är nedsänkt i medium. När alla plantor har pläterats, försegla plattorna med Micropore tejp, och placera växterna under standard kortdagarsförhållanden i åtta till 12 dagar.För att bestämma procenttillväxthämningen, ta ett foto för att visuellt registrera tillväxthämningen innan du försiktigt tar bort plantorna från varje brunn. Sedan, badda rötterna på en pappershandduk för att torka, och väga varje planta på en analytisk skala. I detta representativa experiment, mutanta växter med hyperaktiva immun signalering visat en högre kumulativa och genomsnittliga oxidativ burst jämfört med vild-typ Arabidopsis växter, medan mutanta växter med nedsatt immun signalering visas en minskad oxidativ burst vid koncentrationer mellan 10 och 1, 000 nanomolar.Förväntade skillnader i plantor tillväxthämning kunde också urskiljas mellan alla de genotyper som odlas i 100 och 1, 000 nanomolar elicitor peptid koncentrationer. När odlas i 1, 000 nanomolar peptid utspädning, mutanterna med hyperaktiva immun signalering var markant mindre än vilda växter som odlas under samma förhållanden, medan mutanter med nedsatt immun signalering visade en svag inhibering av tillväxt i förhållande till vilda växter. Dessa metoder ger bevis för tidiga och sena immunsvar.Flera andra tekniker, inklusive MAP kinas assays, patogen-inducerad gen uttryck, och infektion assays, kan användas för att avgränsa dessa vägar. Dessa tekniker har modifierats för användning i storskaliga skärmar, som framgångsrikt har identifierat patogenreceptorproteiner och flera andra signalkomponenter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifiering av Respirator Burst Response som en indikator för Innate Immune Health i Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Använda fluorescerande proteiner för att visualisera och kvantifiera<em&gt; Klamydia</em&gt; Vacuole tillväxtdynamiken i levande celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik och Oxidativ Burst: Protokoll för isolering och utvärdering av humana leukocyter och trombocyter

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bakteriell Leaf Infiltration analys för Fine karakterisering av växt Defense Svar använder<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Mätning Granulocyt och monocyt Fagocytos och Oxidativ Burst Aktivitet i humant blod

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Screening analyser för att karakterisera roman Endothelial tillsynsmyndigheter deltar i den inflammatoriska reaktionen

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Analyser för de specifika tillväxttakt och Cell-bindande förmåga Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Övervakning bakteriell kolonisering och underhåll på Arabidopsis thaliana rötter i en flytande hydroponiska system

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Skräddarsy in vivo cytotoxicitet assays att studera Immunodominans i Tumörspecifika CD8+ T cell svar

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Bestämning av kemisk hämmare effektivitet mot intracellulära Toxoplasma Gondii tillväxt med hjälp av en Luciferase-baserad tillväxt analys

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...