Name: pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Laboratuvarımızda çalışmak, Kanada 'nın doğal kaynaklar ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery programı, Kanadalı Inovasyon Vakfı John R. Evans Leader 'ın Fonu ve Kraliçe 'nin Üniversitesi aracılığıyla finanse edilmektedir. KS ve yüksek lisans öğrencileri (CGS-M) için tandem Ontario Lisansüstü Bursları ve NSERC Kanada lisansüstü Burslar tarafından desteklenir.

1. bağışıklık özelliğini takiben Arabidopsis yaprak DISKLERINDE Ros patlaması algılanması
<ol><li>Bitki büyüme ve bakım.<ol>
<li>Çimlenme senkronize etmek için, yaklaşık 50 tohumları askıya alarak Arabidopsis tohumları tabakalaşmak steril 0,1% agar [w/v] ve mağaza 4 °c (ışık yok) içinde 3-4 gün için 1 ml. Not: bir vahşi tür arka plan denetimi (örneğin, col-0) ve yüksek ve düşük bağışıklık çıkışları (örneğin, cpk28-1 ve BaK1-5, sıra...

Bu yazıda, Arabidopsis'te desen tetiklenen immün tepkiler vermek için iki yöntem açıklanmaktadır, özel ekipman kullanmadan bağışıklık çıkışını değerlendirmek için nicel yaklaşımlar sunar. Kombinasyon halinde, çoğaltma tetikleyen ROS ve SGı, sırasıyla mikrobe algısına erken ve geç yanıt değerlendirmek için kullanılabilir.
Oksidatif patlama tahlil büyük sınırlama değişkenlik olduğunu. Tamamen anlaşılmayan nedenlerle, mutlak RLUs 'Lar genellikl...

Patojenlere karşı tespit etmek ve savunmak için, bitkiler mikroorganizma ilişkili moleküler desenler (MAMPs)1olarak bilinen hücrenin dışında bulunan mikrobiyal molekülleri algılayan membran bağlı desen tanıma reseptörleri (prrs) gelişti. MAMPs 'ın bilat PRRs 'larına bağlanması, geniş spektrumlu hastalık direnci2' ye neden olan protein kinaz aracılı bağışıklık sinyallerini başlatır. PRR aktivasyonunun ardından en erken yanıtlardan biri, ekstraselüler reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini katalizleştiren entegre plazma membranı solunum PATLAMASı OKSIDAZ HOMOLOG (RBOH) proteinlerinin fosforilasyon ve aktivasyonu olduğunu3 , 4. Ros bağışıklık sinyalizasyon yanı sıra doğrudan antimikrobiyal ajanlar5yaymak için ikincil haberciler olarak hareket, hastalık direnci kurulması önemli bir rol oynamaktadır. Bağışıklık-elicited oksidatif patlama ilk gözlem CV patates yumrular kullanılarak tanımlanmıştır. Rishiri Phytophthora Mildiyö aşı takip6. ROS üretimi, yaprak diskler7, hücre süspansiyon kültürleri8ve protoplastlar6kullanarak çeşitli bitki türlerinde değerlendirildi. Burada açıklanan Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) yaprak DISKLER desen tetiklenen Ros üretimi için basit bir yöntemdir.
Mamp algı bir yanıt olarak, aktif rboh proteinleri superoksit radikallerin üretimini katalizler (o2-), hidroksil radikaller (• Oh), ve atlet oksijen (1o2) hidrojen peroksit dönüştürülür (H2o 2) ekstrellüler uzayda9. H2O2 oksitleyici ajanın varlığında luminol tabanlı kemiluminesans ile NICELIK olabilir (HRP)10. HRP oksitler H2O2 üreten bir HIDROKSIT iyon (Oh−) ve oksijen gazı (O2) hangi ışık bir foton bültenleri kararsız bir ara üretmek için luminol ile reaksiyon10. Foton emisyonu bağıl ışık üniteleri (RLUs) olarak, en moleküler laboratuvarlarda standart ekipman parçaları haline gelen Luminesans algılayabilen bir Mikroplaka Okuyucu veya görüntü kullanarak nicelik olabilir. 40-60 dakikalık bir Aralık üzerinde üretilen ışığı ölçerek, geçici bir oksidatif patlama, elicitor tedavisinden sonra 2-5 dakika kadar erken, 10-20 dakika içinde peaking ve ~ 60 dakika11' den sonra bazal seviyelere dönerek tespit edilebilir. Bu zaman kursunda üretilen birikimli ışık, RBOH proteinlerinin aktivasyonuna karşılık gelen bağışıklık gücünün bir ölçüsü olarak kullanılabilir12. Uygun, bu tahlil özel ekipman veya hantal numune hazırlama gerektirmez.
MAMP algılama kısa bir süre sonra peaking, oksidatif patlama erken bağışıklık yanıtı olarak kabul edilir, MAPK aktivasyon ve etilen üretimi ile birlikte5. Daha sonra bağışıklık tepkiler transkripsiyonel yeniden programlama, evcikli kapatma ve kallose biriktirme2,5içerir. MAMPs 'a uzun süreli maruz kalma, bitki büyümesinin inhibisyonu ile sonuçlanan, kalkınma ve bağışıklık13arasında bir ticaret-off göstergesidir. Desen-tetiklenen fide büyüme inhibisyonu (SGI) yaygın Arabidopsis bağışıklık çıkışı değerlendirmek için kullanılan ve prrs dahil bağışıklık sinyalizasyon birkaç anahtar bileşenlerinin tanımlanması için ayrılmaz olmuştur14,15 ,16. Bu nedenle, bu kağıt Ayrıca model için bir tahlil sunuyor- Arabidopsisiçinde SGI tetikleyen, fidanlar çok iyi plakalar standart medya veya medya 8-12 gün için bir bağışıklık elicitor ile tamamlayıcı içeren yetiştirilen ve daha sonra tartılır analitik bir ölçek kullanarak.
ROS ve SGı 'nin PRR-aracılı sinyalizasyon izlemek için nasıl kullanıldığını göstermek için, farklı bağışıklık çıkışlarını temsil eden üç genotip seçilmiştir: (1) vahşi tip Arabidopsis üyeliği Columbia (col-0), (2) dominant-negatif BaK1-5 mutant içinde çok fonksiyonlu PRR Co-reseptör brassinosteroıd duyarsız 1-ilişkili kinase 1 (BAK1) bağışıklık sinyalizasyon fonksiyonel olmayan17,18, ve (3) resessive cpk28-1 mutant, hangi yoksun Düzenleyici protein kalsiyum bağımlı protein kinaz 28 (CPK28) ve görüntüler artmış bağışıklık tetiklenen tepkiler19,20. Ros ve SGI tanılar, PRR EF-tu reseptör (EFR)15ile Arabidopsis 'te tanınan, bakteri uzaması Factor tu (EF-tu) ' ın sentetik olarak üretilen elf18 peptid epitopu yanıtı ile sunulmuştur. Bu protokoller bakteriyel motilite protein flagellin14 veya endojen bitki Elicitor proteinleri (AtPeps)16gibi diğer immün elicitors ile kullanılabilir, ancak, bu bitki yanıt bağlı olarak farklılık unutulmamalıdır 21. ROS ve SGı desteği, erken ve geç PRR aracılı yanıtların hızlı ve nicel değerlendirilmesi için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-20-20 Fertilizer</td>
			<td>Plant Prod</td>
			<td>10529</td>
			<td>Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Medical Mart</td>
			<td>232-33-34-P</td>
			<td>A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Sterile Plates with Lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale with Draft Sheid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td>Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>725240</td>
			<td>Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td>cp7211</td>
			<td>Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murisage and Skoog Basal Salts</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>MSP09-100LT</td>
			<td>Store at 4C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>SunGrow Horticulture</td>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Must request a quote</td>
			<td>Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Bitkiler, patojenleri algılamak ve hastalığa karşı korumak için sağlam bir bağışıklık sistemi geliştirmiştir. Bu yazıda elicitor molekülleri ile tedavi sonrasında Arabidopsis thaliana bağışıklık aktivasyonunun gücünü ölçmek için kullanılabilecek iki asder açıklanmaktadır. İlk sunulan bir luminol tabanlı tahlil kullanılarak izlenebilir hızla indüklenen ve dinamik oksidatif patlama, yakalamak için bir yöntemdir. İkinci sundu fide büyüme bağışıklık kaynaklı inhibisyonu ölçmek için nasıl açıklayan bir yöntemdir. Bu protokoller hızlı ve güvenilirdir, özel eğitim veya ekipman gerektirmez ve bitki dokunulmazlığının genetik temelini anlamak için yaygın olarak kullanılır.

Mutant cpk28-119,25 ve BaK1-517,18 bitkiler oksidatif patlama ve sgi, sırasıyla, yüksek ve düşük immün tepkiler ile genotipler için beklenen sonuçları göstermek için kullanıldı bir vahşi tür arka plan denetimi (col-0) göreli olarak diyor. Doz bağımlı etkileri değerlendirmek için, 10 kat peptid seyreltme serisi (1-1000 nM) elf18 kulla...

Watch this Scientific Journal Video about Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Bu tahliller değerlendirmek ve farklı bitki genotiplerinin bağışıklık çıktıları karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu tekniklerin en büyük avantajı, hızlı, güvenilir ve ortak laboratuvar ekipmanları kullanmak olmasıdır. Büyüme inhibisyonu töziçin, aynı boyutta ve yaştaki fideler, değişimi sınırlamak için tartılmadan önce nakledilmeli ve tamamen kurutulmalıdır.Çimlenmeden dört ila beş hafta sonra, Arabidopsis bitkibaşına göre bir yaprak diski çıkarmak için dört milimetrelik keskin bir biyopsi yumruğu kullanın, midveinden kaçının ve yaralanmayı sınırlamaya dikkat edin. Desiccation önlemek için, kuyu başına çift distile su 100 mikrolitre içeren kullanılmayan 96-iyi luminometer plaka bireysel kuyular halinde diskler toplayın, adaxial tarafı kadar. Birden fazla elicitors değerlendirirken, her elicitor tedavisi için aynı yaprak diski çıkarın ve yaprak diskler oda sıcaklığında bir gecede kurtarmak için izin vermek için kapağı ile plaka kapağı.Ertesi sabah, dinamik oksidatif patlamayı yakalamak için mikroplaka okuyucu parametrelerini 40 ila 60 dakikalık bir süre içinde iki dakikalık aralıklarla 1,000 milisaniyelik bir tümleştirme süresine ayarlayın. Daha sonra, her kuyudaki suyu 100 mikrolitre taze hazırlanmış reaksiyon çözeltisi ile değiştirmek için çok kanallı bir pipet kullanın, buna bir kontrol, her genotip için elicitor reaksiyonu olmadan, elicitation yokluğunda bazal reaksiyon oksijen türleri seviyelerini değerlendirin. Daha sonra, mikroplaka okuyucudaki görünür spektrumdaki tüm dalga boyları için ışık emisyonuna hemen görebilen.Çimlenme sonrası dört gün, elicitor peptid seyreltme ile birlikte MS orta 500 mikrolitre ile 48-iyi plaka her kuyu yükleyin. Daha sonra, her peptid seyreltme altı ila sekiz fide dikkatlice nakli için steril forceps kullanın, kök için fide veya kırılma hiçbir zarar olduğunu ve kök orta batık olduğunu dikkat. Tüm fideler kaplandığında, plakaları Mikropore bantla kapatın ve bitkileri 8 ila 12 gün boyunca standart kısa gün koşullarına yerleştirin.Yüzde büyüme inhibisyonu belirlemek için, dikkatle her kuyudan fide çıkarmadan önce büyüme inhibisyonu görsel olarak kaydetmek için bir fotoğraf çekmek. Sonra, kurubir kağıt havlu üzerinde kökleri dab ve analitik bir ölçekte her fide tartmak. Bu temsili deneyde, hiperaktif immün sinyalizasyonu olan mutant bitkiler yabani tip Arabidopsis bitkilerine göre daha yüksek kümülatif ve ortalama oksidatif patlama gösterirken, bağışıklık sinyali bozulmuş mutant bitkiler 10 ile 1000 nanomolar arasında konsantrasyonlarda azaltılmış oksidatif patlama göstermiştir.100 ve 1,000 nanomolar elicitor peptid konsantrasyonlarında yetişen tüm genotipler arasında fide büyüme inhibisyonunda beklenen farklılıklar da ayırt edilebilir. 1, 000 nanomolar peptid seyreltme büyüdü, hiperaktif bağışıklık sinyali ile mutantlar belirgin aynı koşullar altında yetiştirilen yabani tip bitkilerdaha küçüktü, bozulmuş bağışıklık sinyali ile mutantlar yabani tipi bitkilere göre büyüme zayıf bir inhibisyon gösterdi. Bu yöntemler erken ve geç immün yanıtlar için kanıt sağlar.MAP kiazaz tahlilleri, patojen kaynaklı gen ekspresyonu ve enfeksiyon tahlilleri de dahil olmak üzere diğer birçok teknik, bu yolları nitada etmek için kullanılabilir. Bu teknikler, patojen reseptör proteinlerini ve diğer bazı sinyal bileşenlerini başarıyla tanımlayan büyük ölçekli ekranlarda kullanılmak üzere değiştirilmiştir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Yüzen hidroponik sistemde Arabidopsis thaliana kökleri üzerinde bakteriyel kolonizasyon ve bakım izleme

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...