Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

E.J.N.G. Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z) tarafından desteklenir. Diğer finansman SMA Trust (SMA İngiltere'de konsorsiyum; tarafından sağlanmıştır T.H.G. & Y-T. H.), SMA Avrupa (T.H.G, D.v.D.H. ve E.J.N.G.), University of Edinburgh DTP hassas Tıp (T.H.G., L.L. ve A.M.M.) ve Euan MacDonald Merkezi Motor nöron hastalığı Araştırma (T.H.G).

Bu yordam için doku Edinburgh Üniversitesi, iç Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve uyum ile kurumsal ve İngiltere İçişleri Bakanlığı yönetmeliklerine yetkisi altında ilgili gerçekleştirilen hayvan çalışmaları elde Kişisel ve proje lisansları.
Not: Bu protokol tekrarlanabilirlik artırmak için standart, piyasada kitleri ve reaktifler kullanarak optimize edilmiştir ( Tablo malzemelerigörmek).
1. hazırlanması örnekleri...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Uygun deneysel tasarım, kontrol tedbirleri ve istatistiksel analizi ile western Blot protein ifade içinde ve biyolojik örnekleri çeşitli bir dizi arasında güvenilir kantitatif tahminler yapmak için kullanılabilir. Biz mevcut el yazması tarif Protokolü Floresans tabanlı bir birleşimini kullanarak daha büyük ve daha karmaşık örnekleri, gruplarında kantitatif analiz üstlenmeyi kurutma Western kullanmak isteyen araştırmacılar için bir kılavuz olarak hizmet amaçlamaktadır algılama yöntemleri, topl...

Western Blot algılamak ve doku homogenates veya özleri içeren protein ifadeler ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Yıllar içinde bu teknik temel ve klinik araştırmalarda birçok gelişmeler bu bir tanı aracı hastalık1,2varlığı tanımlamak için kullanıldığı yerler yol açmıştır. Western Blot ilk 1979 yılında proteinler polyacrylamide jeller nitroselüloz sayfalara aktarmak ve daha sonra proteinler radioactively etiketli ya da floresein için Birleşik ikincil antikorlar kullanarak görselleştirmek için bir yöntem olarak tanımlanmıştır veya peroksidaz3. Piyasada kitleri ve ekipman geliştirilmesi yoluyla, Western Blot yöntemlerinin edilmiş giderek standart ve yıllar içinde Basitleştirilmiş. Gerçekten de, teknik artık kolayca farklı arka plan ve deneyim düzeylerini ile bilim adamları tarafından yapılmaktadır. Ancak, birçok benzer deneysel teknikleri olduğu gibi Western blot analizleri sonucu kolayca tasarım ve deney yürütülmesi açısından yapılan seçimler etkilenmiştir. Bu nedenle, standart Western Blot yöntemlerinin erişilebilirliğini dikkatli deneysel planlama gereğini karanlık değil ve tasarım önemlidir. Deneysel konuları içerir, ancak sınırlı için örnek hazırlama ve işleme, seçim ve antikor protein algılama için doğrulama ve jel membran transfer verimi özellikle küçük veya büyük değildir (< 10 veya > 140 kDa) proteinler4,5,6,7,8,9. Orijinal örnek protein kalitesini sonraki Western blot analizi sonucu belirlemede önemli bir rol oynar. Protein-ebilmek var olmak hulâsa çok çeşitli örnekleri ve hücre hatları, hayvan modelleri dokulardan ve öldükten sonra insan dokular, birçok kaynaktan gibi tutarlılık işleme ve işlem tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Uzun süreli depolama örnekleri protein çıkarılması için gerekli olduğunda, örneğin, protein-80 ° C'de genellikle istikrarlı olmasına rağmen protein istikrar ayıklanan proteinler ve-80 ° C'de sağlam dokular arasındaki farklılıkları olup olmadığını, önemli bildirilen10. Ayrıca, protein miktarları tekrarlanabilir tahminleri elde etmek için tutarlı homojenizasyon örneklerin çok önemlidir. Farklı lizis arabellekleri ve homojenizasyon yöntemleri (otomatik yöntemlerine göre Örneğin, el ile homojenizasyon) en iyi duruma getirme büyük ölçekli bir nicel deney başlamadan önce gerekli.
Normalleştirme stratejileri için protein yükleme ve miktar değişkenlik düzeltmek için sağlam, nicel protein ifadenin sonuçlarını elde etmek için gereklidir. β-aktin gibi proteinler kat Hizmetleri tübülin α, β-tübülin ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) geleneksel olarak protein düzeyleri için miktar normalleştirmek için kullanılmaktadır. Ancak, belirli temizlik proteinlere miktar amaçlar için normalleştirme giderek son birkaç yıl11,12eleştirilmiştir. Ifade temizlik proteinlerin dokuları aynı hayvan4ve çeşitli hastalık koşulları4,15 arasında farklı gelişim aşamalarında13,14arasında Örneğin, değiştirebilirsiniz ,16,17. Bu nedenle, belirli temizlik proteinler arasında farklı dokular, farklı timepoints ve deneysel koşullar değişen altında ifadeden protein daha karmaşık karşılaştırmalar yapma olanaklarını kısıtlar. Temizlik proteinler için protein varyasyon yükleme denetimine alternatif bir toplam protein leke (TPS) bu etiketleri kullanılır ve tüm proteinler bir örnek mevcut görüntüler. Belirli bir protein seviyeleri ve bu nedenle miktar TPS sinyal karşılaştırılabilir ve deneysel durumu, örnek türü veya gelişimsel timepoint bağımsız olarak tekrarlanabilir olmalıdır yerine TPS toplam protein yüküne göre sinyal normalleştirme sağlar . Ponceau S, leke içermeyen jeller, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo siyah ve Cy5 (ref. 18 gözden) toplam protein lekeleri örnekleridir. Bu yöntemlerin her biri belirli avantajları ve sınırlamalar vardır ve deneysel kurulum4,18yanı sıra zaman ve araçlarını yöntemi seçimi bağlıdır.
Membran içinde yükleme ve miktar değişkenliği için düzeltmek için bir TPS kullanmanın yanı sıra, örnekleri arasında özellikle büyük ölçekli protein ifade analizi yaparken farklı membranlar, karşılaştırmak gerekli olabilir. Ancak, verimlilik ve toplam protein leke yoğunluğu bağlama antikor gibi faktörler değişkenliği daha fazla ayrı jeller üzerinde analiz protein örnekleri ve membranlar arasında değişkenlik tanıştırayım. Bu durumda sağlam miktar için bu nedenle membran arasındaki değişkenliği için hesabınıza bir normalleştirme adım tanıtmak gereklidir. Bu bir iç yükleme standart deneyler arasında sabit tutulur ayrı ayrı analiz membranlar tümünde ekleyerek elde edilebilir. Bu standart herhangi bir protein bu denemede dahil tüm membranlar arasında kullanılmak üzere yeterli miktarda elde edilebilir lysate şeklinde alabilir. Burada, bir lysate (5 gün eski kontrol fare elde edilen) fare beynin beyin kolayca homojenize ve lysate elde edilen protein yüksek, protein önemli bir miktarda içerir gibi kullanırız. Nüsha bir iç standart yükleme örnekleri normalleştirilmiş ve doğrudan göre ayrı membranlar sağlar.
Burada, biz bize farklı doku, fare modelleri (Hastalık modelleri de dahil olmak üzere) ve gelişimsel timepoints19arasında protein ifade varyasyon karmaşık karşılaştırmalar üstlenmek izin vermek için hazırladığımız detaylı bir iletişim kuralı tanımlamak. Bir floresan TPS bir iç yükleme standart kullanımı ile birleştirerek, biz örnekleri ve içinde tek bir deney karşılaştırılabilir deneysel koşullar, varolan kısıtlamaları aşmak başardık. Bu yaklaşım böylece araştırmacılar protein ifade farklı doku ve örnekleri arasında daha iyi keşfetmek izin veren geleneksel Western blot tekniklerin kullanılması genişletir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Western Blot algılamak ve protein ifade ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Yıllar içinde bu teknik temel ve klinik araştırmalarda birçok gelişmeler yol açmıştır. Ancak, birçok benzer deneysel teknikleri olduğu gibi Western blot analizleri sonucu kolayca tasarım ve deney yürütülmesi açısından yapılan seçimler etkilenmiştir. Belirli temizlik proteinler protein düzeyleri için miktar normalleştirmek için geleneksel olarak kullanılmıştır, ancak, bu sınırlamalar bir dizi var ve bu nedenle giderek son birkaç yıl içinde eleştirdi. Burada, biz bize farklı doku, fare modelleri (Hastalık modelleri de dahil olmak üzere) ve gelişimsel timepoints arasında protein ifade varyasyon karmaşık karşılaştırmalar üstlenmek izin vermek için hazırladığımız detaylı bir iletişim kuralı tanımlamak. Bir floresan toplam protein leke kullanarak ve bir iç yükleme standart kullanımı tanıtımı, deneyler içinde karşılaştırılabilir ve sistematik olarak protein düzeyleri arasında karşılaştırma örnekleri sayısı, varolan kısıtlamaları üstesinden gelmek mümkündür bir deneysel koşullar dizi. Bu yaklaşım böylece araştırmacılar protein ifade farklı doku ve örnekleri arasında daha iyi keşfetmek izin veren geleneksel Batı leke tekniklerin kullanılması genişletir.

TPS ve dahili bir standart doku ve zaman puan arasında karşılaştırmalar protein düzeyleri kolaylaştırmak için kullanımı örnekleri içerir. Şekil 1 yenidoğan (doğum sonrası 5 gün) Yetişkin fareler (10 - haftalık) ile karşılaştırıldığında elde edilen dokular çıkarılan protein Western Blot sonuçları gösterir. TPS ve Smn immunoblot şekil 1A', Cgösterilir. TPS floresan yoğunluğu mi...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Bu yöntem protein düzeyleri farklı dokular ve standartlaştırılmış bir nicel Batı blotting yaklaşım kullanarak farklı gelişim timepoints karşılaştırılması için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım açıklar.

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Bu protokol, farklı doku ve zaman noktaları arasında protein ekspresyonuna bakarak temel ve klinik araştırmalardaki önemli soruları ele almak için kullanılabilir. Güvenilir kantitatif Batı lekeleme gerçekleştirmek için, bir iç yükleme kontrolü ile floresan toplam protein lekesi birleştirir. Bu deneysel koşullar arasında çeşitli dokular karşılaştırArak ortaya çıkan sınırlamalar üstesinden.Dondurulmuş hücre veya doku örneklerinden protein elde etmek için, tabloya göre numuneleri uygun şekilde yıkamadan önce eksi 80 derecelik numuneleri buz üzerinde eritin. Polipropilen havaneli el ele elektrif homojen kullanarak, yıkanmış numuneleri homojenize edin, havaneleri çift distile suda durulayın ve numuneler arasında temiz bir doku ile kurutun. Örnekleri 10 dakika buzda bırakın, ardından santrifüj.Daha sonra, protein içeren süpernatant'ı, peleti bozmadan buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Protein konsantrasyonunun ölçülmesi için, üç aylık konsantrasyonları artırarak sığır serum albumin standartları ayarlayın ve 96 kuyulu optik plakanın uygun kuyularına her protein örneğinden bir mikrolitre ekleyin. Protein konsantrasyonu düşük olması bekleniyor sayılsa 10 dakika veya daha uzun bir süre için 60 derece santigrat ısı bloğu üzerinde protein kuluçka ve bir plaka okuyucu üzerinde 560 nanometre emilimini ölçmek.Plaka okuyucu ölçümlerini aktarın ve her numunenin ortalama emicilik değerlerini protein standardı kullanılarak elde edilen standart bir eğriyle karşılaştırarak protein konsantrasyonu hesaplayın. Protein miktarını normalleştirmek için, numune tamponu ve ultra saf sudaki protein örneklerinin seyreltmelerini hazırlayın ve numuneleri 70 derecelik bir ısı bloğunda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, girdap ve kısaca santrifüj önce buz üzerinde örnekleri yerleştirin.Elektroforez için, jel elektroforez odası sisteminde bir prekast dört ila % 12 Bis-Tris gradyan jel kurmak ve kuyuya bir protein standardının 3,5 mikrolitre yük. Membran arası normalizasyon için bir iç standart kullanırken, protein merdiveninin yanındaki ilk üç kuyuya diğer örneklere eşit bir miktar yükleyin ve her numunenin 30 mikrogramını kalan kuyulara yükleyin. Daha sonra, 10 dakika boyunca 80 volt istifleme jel istifleme jel ile örnekleri çalıştırın ek bir 45-60 dakika için 150 volt izledi.Elektroforezsonunda, transfer yığını monte etmek için, filtre kağıdı takip polivinilidendiit membran içeren alt yığını üzerine protein jeli yerleştirin. Hava kabarcıklarını kaldırmak için blotrulokullanın ve hava kabarcıkları kaldırmak için tekrar yığını haddeleme önce filtre kağıdının üstüne üst yığını yerleştirin. Cihazın sol tarafındaki elektrotla tüm desteyi transfer cihazına aktarın ve jel süngeri, cihazın üzerindeki ilgili elektrik kontamıyla hizalandır diye yığının üstüne yerleştirin.Kapağı kapattıktan sonra, uygun programı seçin ve başlatın. Programın sonunda, jel boyutuna membran kesilmiş ve toplam protein lekesi ile devam etmeden önce çift distile su ile hızlı bir şekilde kesilmiş membran yıkayın. Toplam protein boyama için, protein tarafı içe bakacak şekilde 50 mililitrelik bir tüp içine membran rulo ve bir duman kaputunda oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir rulo üzerinde protein leke çözeltisi beş mililitre ile membran etiket.Kuluçka sonunda, membranı beş mililitre yıkama çözeltisi ile hızlı bir şekilde yıkayın, tüpü yıkama arasındaki ruloya kısa bir süreliğine geri döndürün ve ardından ultra saf suyla kısa bir durulama layın. Membrana üç mililitre bloke tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca silindir membran dönmek. Engelleme tamponu uygun optimize konsantrasyonda birincil ilgi antikorile değiştirin ve dört santigrat derece de rulo üzerinde membran kuluçka.Ertesi gün, oda sıcaklığında rulo üzerinde yıkama başına taze PBS beş mililitre ile beş dakika boyunca membran altı kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca silindir üzerinde uygun ikincil antikor solüsyonu ile membran ı kuluçkaya yatırın ve yıkama başına 30 dakika üç yıkama. Son yıkamadan sonra membranı kurutun ve membranı ışıktan korumak için alüminyum folyo kullanın.Görüntü edinimi için, protein tarafı aşağı bakacak şekilde membranı tarayıcıya yerleştirin ve yazılımdaki tarama alanını seçin. Ardından, her iki kanalda da görüntü edinin ve görüntüleri uygun bir görüntü analiz programına aktarın. Toplam protein boyama sonucunu göstermek için 700 nanometrekanalını görüntüleyin ve normalleştirme için ilgi alanını tanımlamak için Analiz ve Draw Rectangle'yi seçin.Ardından, tanımlanan bölgenin analiz edilen şeritlerin tümü için aynı boyutta olduğundan emin olmak için ilk dikdörtgen alanını her bir örneğe kopyalayıp yapıştırın. Her şeritteki protein konsantrasyonu ölçmek için, hem toplam protein lekesi hem de ilgi proteininin sonuçlarını bir elektronik tablo programına kopyalayın ve en yüksek toplam protein leke sinyalini belirleyin. Daha sonra, normalleştirilmiş protein yükleme değerini elde etmek için her toplam protein leke savardırizasyon değerini bu değere bölün ve farklı örneklerdeki göreli protein ifade oranını hesaplamak için her bir örneklemdeki 800 nanometrelik sinyal değerini karşılık gelen normalleştirilmiş protein değerine bölün.Bu temsili Batı lekeleri, doğum sonrası beş fareler den elde edilen dokulardan elde edilen proteinler 10 haftalık yetişkin farelerden elde edilen proteinler ile karşılaştırılır. Toplam protein lekesinin floresan yoğunluğunun ölçülmesi, her şeritteki dikdörtgen kutunun içindeki floresan yoğunluğunun ölçülmesi ile elde edilmiştir. Tüm şeritler analiz edildiğinde, floresan yoğunluğu örnekler arasında nispeten benzer kalır, normalleştirme için toplam protein lekesinin kullanılması nın bu amaca uygun olduğunu gösterir.Floresan total protein lekesi de farklı gelişimsel zaman noktalarında protein düzeylerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, farelerde yaşla birlikte sağkalım motor nöron protein düzeyleri açıkça azalsa da, toplam protein lekeli nicelik sabit kalır. İç standartların kullanımı, floresan tabanlı normalizasyon ve yeterli istatistikler farklı koşullar arasında karmaşık protein ekspresyonu analizinin sağlamlığını artırır.Bu protokol, geleneksel Batı leke tekniklerine katkıda, deneysel gruplar arasında uygun yükleme kontrolleri ve karşılaştırmalar sorunlarının üstesinden gelmek ve protein ekspresyonu analizi için esneklikler sağlamak. Bu yaklaşım, diğer deneysel koşullar altında protein ekspresyonunu karşılaştırmaya kadar genişletilebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA CLC: Western Blot, lizozomal enzimlerin inhibisyonu ve immunositokimya ile gösterildiği gibi CNTFRα CLF-1 bağımlı baskılanması

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...