Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية في المعهد الوطني للصحة العقلية (ZIA MH002964-02). نود أن نشكر دعم نيمه IRP القوارض الأساسية السلوكية (ZIC MH002952).

تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجان رعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للمعهد الوطني للصحة العقلية . وقد بُذلت جميع الجهود للتقليل إلى أدنى حد من الألم وعدد الحيوانات المستخدمة.
1- حقن الفيروس المرتبطبة بأدينو في الحصين
ملاحظة:...

<ol>
	<li>Park, H. G., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Manipulation+of+Neural+Circuits.">Selective Manipulation of Neural Circuits.</a> Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).</li><li>Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+depressed+brain:+optogenetic+and+chemogenetic+circuit+interrogation+in+animal+models+of+depression.">Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression.</a> Neuropsychopharmacology. 1, (2018).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+Tools+with+Therapeutic+Utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellate+cells+drive+maturation+of+the+entorhinal-hippocampal+circuit.">Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit.</a> Science. 355 (6330), (2017).</li><li>Mahler, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+receptors+show+role+for+ventral+pallidum+input+to+ventral+tegmental+area+in+cocaine+seeking.">Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking.</a> Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).</li><li>Lichtenberg, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+Amygdala+to+Orbitofrontal+Cortex+Projections+Enable+Cue-Triggered+Reward+Expectations.">Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).</li><li>Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+stressful+procedures+as+ether+anesthesia+and+intracranial+injections+on+amino+acid+incorporation+into+brain+protein.">Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein.</a> Brain Research Bulletin. , (1977).</li><li>Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+behavioral+deficits+following+a+routine+surgical+procedure+in+rats.">Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats.</a> Brain Research. , (2007).</li><li>Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye-Drops+for+Activation+of+DREADDs.">Eye-Drops for Activation of DREADDs.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).</li><li>LeGates, T. A., Altimus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+circadian+and+acute+light+responses+in+mice+using+wheel+running+activity.">Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+hedonic+drinking+behavior+in+mice.">Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice.</a> Neuroscience. 349, 229-238 (2017).</li><li>Fernandez, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Affects+Mood+and+Learning+through+Distinct+Retina-Brain+Pathways.">Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways.</a> Cell. 175 (1), 71-84 (2018).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin&#8217;s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs):+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li><li>Urban, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+The+Behavioral+Program+and+Neuronal+Network+Encoded+by+Dorsal+Raphe+Serotonergic+Neurons.">Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons.</a> Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).</li><li>Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+of+a+designer+G+q-coupled+receptor+improves+&#946;+cell+function.">Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves &#946; cell function.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).</li><li>MacLaren, D. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+N-Oxide+Administration+Produces+Behavioral+Effects+in+Long-Evans+Rats:+Implications+for+Designing+DREADD+Experiments.">Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetics+revealed:+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine.">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li></ol>

وقد ظهرت DREADDs كنهج شعبية وفعالة للتعامل عن بعد النشاط العصبي17. ومن ثم، فإن تصميم استراتيجيات بديلة لتقديم عمل كل من CNO سيزيد بشكل عام من نطاق الخيارات المتاحة لبيئات تجريبية محددة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاستراتيجيات غير الغازية لتسليم CNO تقلل من أي سوء تفسير محتمل للنتائج عن ...

وقد سمحت التطورات التقنية في مجال علم الأعصاب العلماء لتحديد ومراقبة نشاط مجموعات معينة من الخلايا العصبية1. وقد ساهم هذا في فهم أفضل لأساس الدوائر العصبية وتأثيرها على السلوك الحيواني، وكذلك، مراجعة العقائد الراسخة2،3. ومن بين هذه الأدوات الجديدة، كان للاستراتيجيات الوراثية البصرية والكيميائية تأثير عميق ليس فقط على نوعية الاكتشافات ولكن أيضا على الطريقة التي يتم بها تصور التجارب وتصميمها4. في هذه المخطوطة، نركز على استراتيجيات علم الوراثة الكيميائية للسيطرة على تنشيط الخلايا العصبية من خلال استراتيجيات مستقبلات ligand هندسية. مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل مصمم الأدوية (DREADDs) تمثل واحدة من الأدوات الكيميائية الوراثية الأكثر شعبية للتحكم عن بعد من النشاط العصبي, كما استعرض روث 20165. DREADDs الاستفادة المعدلة مستقبلات أستيل موسكارينيالتي يتم تفعيلها على وجه التحديد من قبل ليجانت خاملة, كلوزابين-N-أكسيد (CNO)6.
معظم الدراسات استخدام CNO تدار عن طريق الحقن داخل اقاب (i.p.) ، والتي تسيطر بشكل فعال على الجرعة وتوقيت تنشيط مستقبلات هندسية بطريقة حادة. ومع ذلك، عندما يكون التنشيط DREADD المتكررة أو المزمنة مطلوبة، يصبح استخدام حقن i.p. متعددة غير ممكن. لمعالجة هذه المسألة، تم الإبلاغ عن استراتيجيات مختلفة لتسليم CNO المزمن، بما في ذلك المضخات الصغيرة المزروعة7 والقنية داخل الجمجمة8،9. إلى درجات مختلفة، كل هذه الاستراتيجيات تسبب الإجهاد والألم الحيوانات10،وتتطلب التدخل الجراحي الذي يمكن أن يكون له أيضا تأثير مباشر على الاستجابات السلوكية ليتم اختبارها11. هنا، ونحن نصف ثلاث استراتيجيات غير الغازية لتسليم CNO المزمنة.
لهذا الغرض، تم حقن الفئران مجسما في الحصين مع فيروس الأيدينو المرتبطة (AAV) ترميز نسخة هندسية من مستقبلات موسكارينيك M3 المحفزة (hM3Dq) أنه عند تفعيلها من قبل CNO ligand يؤدي إلى إطلاق النار مثل انفجار الخلايا العصبية6. وقد تبين سابقا أن قطرة عين واحدة تحتوي على CNO يمكن أن تثير بشكل فعال تفعيل قوي من الخلايا العصبية التي تعبر عن DREADD12. هنا نقوم بوصف طريقة معدلة للتسليم المتكرر لقطرات العين. لتحقيق السيطرة المزمنة والمستدامة على مستقبلات المصمم، ونحن نوصف المقبل استراتيجية غير الغازية لتسليم CNO للفئران من خلال مياه الشرب. وأخيراً، نقوم بوصف نموذج بديل لتقديم CNO في مياه الشرب خلال فترة زمنية محدودة. الفئران النشاط الحركي، فضلا عن سلوك الشرب واستهلاك حلول السعرات الحرارية الحلوة، وتقتصر في الغالب على الجزء المظلم من دورة الضوء / الظلام13،14. لذلك، اعتمدنا بروتوكول على أساس تفضيل الماوس للسكروز. من خلال قياس تحريض الجينات الفورية في وقت مبكر ج-فوس في الخلايا المصابة AAV, كقراءة لتنشيط الخلايا العصبية12,15, وجدنا أن هذه الاستراتيجيات تسليم CNO تنشيط بقوة الخلايا العصبية التي تسيطر عليها DREADD على مدى تمديد المدد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

وقد ظهرت استراتيجيات علم الوراثة الكيميائية كأدوات موثوق بها للتحكم عن بعد في النشاط العصبي. من بين هذه, مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل مصمم الأدوية (DREADDs) أصبحت النهج الأكثر شعبية علم الالوراثة الكيميائية المستخدمة في علم الأعصاب الحديثة. معظم الدراسات تقديم كلوزابين-N-أكسيد ليجاند (CNO) باستخدام حقن واحد داخل اقابي، وهو مناسب لتنشيط / تثبيط حاد من السكان الخلايا العصبية المستهدفة. ومع ذلك، لا يوجد سوى عدد قليل من الأمثلة على استراتيجيات التشكيل المزمن للخلايا العصبية التي تسيطر عليها DREADD، ومعظمها يعتمد على استخدام أنظمة التسليم التي تتطلب التدخل الجراحي. هنا، ونحن توسيع على اثنين من الاستراتيجيات غير الغازية لتقديم CNO ligand للتلاعب المزمن السكان العصبية في الفئران. كان يتم إعطاء CNO إما باستخدام قطرات العين المتكررة (اليومية)، أو بشكل مزمن من خلال مياه الشرب في الحيوان. هذه النماذج غير الغازية تؤدي إلى تنشيط قوي لمستقبلات المصمم التي استمرت في جميع أنحاء العلاجات CNO. الطرق الموصوفة هنا توفر بدائل للسيطرة المزمنة بوساطة DREADD من النشاط العصبي، وقد تكون مفيدة للتجارب المصممة لتقييم السلوك في الحيوانات المتحركة بحرية، مع التركيز على أساليب التسليم CNO أقل الغازية.

لاحظنا أن التسليم المتكرر CNO باستخدام قطرات العين أثار تحريض قوي من التعبير c-Fos في معظم الخلايا العصبية المصابة (الشكل1C)،مما يدل على أن فعالية تسليم CNO تستمر خلال التعرض المتكرر. وعلاوة على ذلك، لوحظ تحريض كبير من c-Fos في العينات التي تم جمعها 2 ساعة بعد العلاج CNO، مقارنة مع ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

هنا نقوم بوصف طريقتين غير الغازية للسيطرة المزمنة على النشاط العصبي باستخدام علم الوراثة الكيميائية في الفئران. واستخدمت قطرات العين لتسليم كلوزابين-N-أكسيد (CNO) يوميا. كما نقوم بوصف طريقتين لإطالة فترة إدارة CNO في مياه الشرب. هذه الاستراتيجيات للسيطرة العصبية المزمنة تتطلب الحد الأدنى من التدخل الحد من الإجهاد الحيوانات.

استراتيجيات غير الغازية للتلاعب المزمن من النشاط العصبي الذي تسيطر عليه DREADD

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDs هي النهج الكيميائي الأكثر شعبية للتحكم عن بعد من نشاط الخلايا العصبية. هنا نقدم بدائل جديدة للتحكم في DREADD المتكررة أو المزمنة ، مع التركيز على طرق توصيل CNO أقل توغلًا. نحن نصف استراتيجيتين للتسليم CNO لفترات طويلة في الفئران عن طريق قطرات العين المتكررة، أو بشكل مزمن من خلال مياه الشرب الحيوانية.البروتوكولات المذكورة هنا هي أمثلة على الخيارات المزمنة وغير الباضعة للتسليم CNO التي يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من التصاميم التجريبية بما في ذلك المتغيرات DREADD المختلفة ، والأنسجة ، أو حتى الأنواع. القضية الرئيسية لتسليم CNO هو الإجهاد والألم الحيوان. هذه البروتوكولات تقليل هذه المشكلة وسهلة الأداء والتكيف مع إعدادات تجريبية مختلفة.قبل إجراء الجراحة، تنظيف وتعقيم الإطار stereotaxic وجميع الصكوك اللازمة. عندما يكون الإطار جاهزًا ، تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع في خلفية مختلطة من نوع وحشي مُجَذَّن ، حلق الجزء العلوي من الرأس ، وإصلاح رأس الماوس إلى الإطار. ثم تطبيق مواد التشحيم واقية العين على العينين وأخيرا، تنظيف الجلد المكشوفة مع اليود povidone متتابعة و 70٪ من الدعك الإيثانول.استخدام مشرط معقمة لفضح الجمجمة ومعايرة الإطار إلى نقطة bregma. حفر في إحداثي متوسط من 2.9 ملليمتر، واحداثي خلفي من ناقص 2.7 ملليمتر لاستهداف الحصين. عندما يتعرض الدماغ، واستخدام الحقن الدقيقة وسحبت ماصة ميكرو كابيليري لحقن من جانب واحد 90 نانويترات من الفيروس adenoassociated في قرن آمون في عمق البطن الظهرية من ناقص ثلاثة ملليمترات.ثم أغلق الشق مع خياطة النايلون ، وإزالة الحيوان من الإطار لإدارة المسكنات. للتسليم CNO المتكررة ، تبدأ أربعة أسابيع بعد الحقن ، التأقلم مع الحيوانات للتعامل مع عن طريق scruffing كل فأرة ثلاث دقائق يوميا لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام قبل إعطاء قطرات العين. عندما أصبحت الفئران متأقلمة مع التعامل، تزن كل ماوس لتحديد الكمية المناسبة من CNO ليتم تسليمها لتحقيق واحد ملليغرام من CNO لكل كيلوغرام من تركيز وزن الجسم.قبل ساعتين من الأضواء خلال المرحلة الخاملة ، قم بتحميل واحد إلى ثلاثة ميكرولترات من محلول CNO المعد في p10 micropipette وشل حركة الماوس عن طريق scruffing. طرد المحلل ببطء حتى تتشكل قطرات ثابتة على طرف الماصات و أحضر القطرة بعناية بالقرب من القرنية حتى يتم تسليم المحلل دون لمس طرف الماصات إلى عين الماوس. ثم العودة إلى قفص الماوس المنزل قبل تطبيق قطرة العين CNO إلى عين الحيوان المقبل.في الحالات التي تحتاج إلى تسليم CNO أثناء مرحلة الماوس النشطة، تأكد من وجود ضوء أحمر خافت للتعامل مع الحيوانات السليمة والتسليم CNO. لعلاج CNO المزمن، ابتداء من أربعة أسابيع بعد الحقن وثلاثة أيام قبل بدء العلاج، واستبدال زجاجات المياه العادية مع زجاجات صغيرة توقفت مع صنبور المطاط ومغطاة مع رقائق الألومنيوم التي تحتوي على 10 ملليلتر من المياه العادية. آمن إلى الأقفاص مع الشريط للسماح للفئران بالتأقلم مع الزجاجات.قياس استهلاك المياه اليومية لكل فأر، ووزنها كل الماوس. اختبار مجموعة من تركيزات CNO لتحديد الجرعة التي تعرض أقصى قدر من الفعالية مع الحد الأدنى من تركيز CNO. ثم تعبئة كل زجاجة صغيرة مع ثمانية ملليلتر من المياه العادية بالإضافة إلى الكمية المطلوبة من CNO.لمعالجة CNO المقيدة، ابتداء من أربعة أسابيع بعد الحقن وثلاثة أيام قبل بدء العلاج، ووضع زجاجة صغيرة تحتوي على 10 ملليلتر من الماء بالإضافة إلى 1٪ السكروز على القفص بعيدا عن زجاجة المياه الأصلية خلال الجزء الأخير من المرحلة النشطة للحيوان. في نهاية التعرض، وإزالة المياه بالإضافة إلى محلول السكروز من كل قفص وقياس استهلاك المياه السكروز لكل. بالنسبة لـ CNO، املأ الزجاجات بخمسة ملليلترات من الماء بالإضافة إلى 1٪ سكروز ومليغرام واحد لكل كيلوغرام من CNO.وضع زجاجة في نفس الموقف كما هو الحال خلال فترة تأقلم الماء السكر خلال الجزء الأخير من المرحلة النشطة، وإزالة الزجاجات وقياس كمية المياه والسكروز وCNO المستهلكة كما هو موضح. في نهاية التجربة، حصاد الدماغ الحيوانية المعالجة في تثبيت جديدة. بعد 9 إلى 12 ساعة، cryoprotect أنسجة الدماغ في محلول السكروز 30٪.عندما يغرق الدماغ، قسم العينة على التبريد. عندما تم الحصول على جميع أقسام الدماغ والربط غير محدد سدت، احتضان عينات الأنسجة مع محلول الأجسام المضادة المضادة C-C-فوس في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع التحريض المستمر. في صباح اليوم التالي، وغسل العينات مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني الطازجة لكل غسل قبل احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة.بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة والهياج المستمر المحمية من الضوء، والحصول على الصور الرقمية من أقسام الأنسجة المسمى عن طريق المنظار المجهري الفلوري. بعد تحميل الصور في ImageJ ، outline في قياس مناطق الخلايا الإيجابية المصابة في أدينو المصابة وتقيّم عدد الخلايا الإيجابية الخاطئة C داخل هذه المنطقة للحصول على عدد الخلايا المنشطة لكل منطقة. المتكررة CNO التسليم باستخدام قطرات العين يثير تحريض قوي من التعبير cFos في معظم الخلايا العصبية المصابة مما يدل على أن فعالية تسليم CNO يتم الحفاظ عليها خلال التعرض المتكرر.وعلاوة على ذلك، لوحظ تحريض كبير من cFos في العينات التي تم جمعها بعد ساعتين من العلاج CNO مقارنة مع العينات التي تم الحصول عليها بعد ست ساعات من التعرض CNO، مما يشير إلى أن التغيرات الناجمة عن CNO تعتمد على الوقت. الاستهلاك اليومي للمياه بالإضافة إلى CNO لا يختلف كثيرا بالمقارنة مع الحجم الإجمالي للمياه العادية المستهلكة. وبالمثل، فإن كمية المياه بالإضافة إلى 1٪ من السكروز المستهلكة خلال الليل لا تتأثر بإضافة CNO، ولا الاختلافات في الاستهلاك اليومي لكل من المياه بالإضافة إلى CNO، والماء بالإضافة إلى السكروز بالإضافة إلى CNO لوحظت على مدى فترة تجريبية لمدة خمسة أيام.على غرار تطبيق قطرات العين CNO ، لوحظ تحريض قوي من cFos بعد ساعتين ، ولكن ليس ست ساعات من الوصول إلى مياه الشرب CNO. بالإضافة إلى ذلك، هناك عتبة واضحة من فعالية CNO كما جرعة CNO منخفضة لا تثير تفعيل cFos مقارنة مع التحكم في المالحة، في حين أن الجرعات العالية تحفز على التعريفي cFos قوية ومماثلة. نوصي بإجراء تحليل استجابة جرعة لتحديد أدنى جرعة CNO التي لا تقلل بشكل كبير تنشيط الخلايا العصبية, والنظر في استخدام كلوزابين باعتبارها يغاند.هنا أظهرنا باستخدام cFos بوساطة CNO التعريفي نتيجة لتنشيط الخلايا العصبية. ومع ذلك، يمكن اعتماد هذه البروتوكول بسهولة للتحليل الكهربائي أو الاختبارات السلوكية. إن تقنية DREADD هي أداة قوية للتحكم عن بعد في نشاط الخلايا العصبية، وتصميم استراتيجيات بديلة لتوصيل CNO.سنزيد من مجموعة الخيارات للبيئات التجريبية والتدخلات السريرية المحتملة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

الجراحية زرع الأقطاب الكهربائية العصبية المزمنة لتسجيل نشاط وحدة واحدة وإشارات Electrocorticographic

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

متني غير الغازية، والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي عالية التردد الموجات فوق الصوتية والضوئي الجرذ أعماق الدماغ التصوير

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

تقييم غير الغازية للتغييرات في نقل كورتيكوموتونورونال في البشر

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

خارج الخلية تسجيل النشاط العصبية جنبا إلى جنب مع Microiontophoretic تطبيق المواد Neuroactive في الفئران مستيقظا

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

تسجيل درجة الحرارة التي يسببها العصبية آخر من خلال مراقبة التغيرات الكالسيوم في البصلة الشمية من<em&gt; القيطم المورق</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

التحفيز الكهربائي Transcranial المزمن وتسجيل إينتراكورتيكال في الفئران

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

تعديل غير الغازية ورسم الخرائط الروبوتية من القشرة الحركية في الدماغ النامية

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...