Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af murene Research program på National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02). Vi vil gerne takke støtte fra NIMH IRP gnaver adfærdsmæssige kerne (ZIC MH002952).

Alle dyr blev håndteret i overensstemmelse med retningslinjerne fra Udvalget for dyrepasning og-anvendelse under det nationale Institut for mental sundhed (NIMH). Alle bestræbelser blev gjort for at minimere smerten og antallet af dyr, der anvendes.
1. adeno-associerede virus injektioner i hippocampus
Bemærk: Vildtype hanmus af blandet baggrund (B6/129 F1 hybrid, 3 måneder gammel) blev for stereotaxatisk injiceres med en AAV kodning af M3 muskarin...

<ol>
	<li>Park, H. G., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Manipulation+of+Neural+Circuits.">Selective Manipulation of Neural Circuits.</a> Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).</li><li>Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+depressed+brain:+optogenetic+and+chemogenetic+circuit+interrogation+in+animal+models+of+depression.">Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression.</a> Neuropsychopharmacology. 1, (2018).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+Tools+with+Therapeutic+Utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellate+cells+drive+maturation+of+the+entorhinal-hippocampal+circuit.">Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit.</a> Science. 355 (6330), (2017).</li><li>Mahler, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+receptors+show+role+for+ventral+pallidum+input+to+ventral+tegmental+area+in+cocaine+seeking.">Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking.</a> Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).</li><li>Lichtenberg, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+Amygdala+to+Orbitofrontal+Cortex+Projections+Enable+Cue-Triggered+Reward+Expectations.">Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).</li><li>Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+stressful+procedures+as+ether+anesthesia+and+intracranial+injections+on+amino+acid+incorporation+into+brain+protein.">Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein.</a> Brain Research Bulletin. , (1977).</li><li>Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+behavioral+deficits+following+a+routine+surgical+procedure+in+rats.">Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats.</a> Brain Research. , (2007).</li><li>Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye-Drops+for+Activation+of+DREADDs.">Eye-Drops for Activation of DREADDs.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).</li><li>LeGates, T. A., Altimus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+circadian+and+acute+light+responses+in+mice+using+wheel+running+activity.">Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+hedonic+drinking+behavior+in+mice.">Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice.</a> Neuroscience. 349, 229-238 (2017).</li><li>Fernandez, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Affects+Mood+and+Learning+through+Distinct+Retina-Brain+Pathways.">Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways.</a> Cell. 175 (1), 71-84 (2018).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin&#8217;s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs):+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li><li>Urban, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+The+Behavioral+Program+and+Neuronal+Network+Encoded+by+Dorsal+Raphe+Serotonergic+Neurons.">Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons.</a> Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).</li><li>Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+of+a+designer+G+q-coupled+receptor+improves+&#946;+cell+function.">Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves &#946; cell function.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).</li><li>MacLaren, D. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+N-Oxide+Administration+Produces+Behavioral+Effects+in+Long-Evans+Rats:+Implications+for+Designing+DREADD+Experiments.">Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetics+revealed:+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine.">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li></ol>

DREADDs er dukket op som en populær og effektiv tilgang til fjernt manipulere neuronal aktivitet17. Udformningen af alternative strategier for CNO levering vil stort set øge spektret af muligheder til rådighed for specifikke eksperimentelle indstillinger. Desuden, ikke-invasive strategier for levering af CNO minimere enhver potentiel fejlfortolkning af resultater ved at reducere bivirkninger, der direkte kan påvirke dyrets helbred. Her beskrev vi to ikke-invasive strategier for CNO-levering, d...

Tekniske fremskridt inden for neurovidenskab har gjort det muligt forskerne til præcist at identificere og kontrollere aktiviteten af bestemte neuronal populationer1. Dette har bidraget til bedre at forstå grundlaget for neuronal kredsløb og deres indvirkning på dyrs adfærd, samt, revidere etablerede dogmer2,3. Blandt disse nye værktøjer har optogenetiske og chemogenetiske strategier haft en dybtgående indvirkning ikke kun på kvaliteten af opdagelser, men også på den måde eksperimenter er udtænkt og designet4. I det nuværende manuskript fokuserer vi på chemogenetiske strategier for at kontrollere aktivering af neuroner via manipuleret receptor-ligand strategier. Designer receptorer udelukkende aktiveret af designer drugs (DREADDs) repræsenterer en af de mest populære kemogenetiske værktøjer til fjernstyring af neuronal aktivitet, som anmeldt af Roth 20165. DREADDs udnytte modificerede muskarine acetylcholin receptorer, der er specifikt aktiveret af en inaktiv ligand, clozapin-N-oxid (CNO)6.
De fleste undersøgelser bruger CNO administreret af intraperitoneal (IP) injektioner, som effektivt kontrollerer dosering og timing af manipuleret receptorer aktivering i en akut måde. Men, når gentagen eller kronisk DREADD aktivering er påkrævet, brugen af flere IP injektioner bliver uopnåelig. For at løse dette problem er der rapporteret om forskellige strategier for kronisk CNO-levering, herunder implanterede mini pumper7 og intrakranielle kanyle8,9. Til forskellige extents, alle disse strategier forårsage dyrene stress og smerte10, og kræver en kirurgisk indgreb, der også kunne have en direkte indvirkning på de adfærdsmæssige svar skal testes11. Her beskriver vi tre ikke-invasive strategier for den kroniske CNO-levering.
Til dette formål blev mus stereotaxatisk injiceret i hippocampus med en adeno-associeret virus (AAV), der indkoder en manipuleret version af den excitatoriske M3 muskariske receptor (hM3Dq), som, når den aktiveres af ligand CNO, fører til den brast lignende fyring af neuroner6. Det har tidligere vist sig, at en enkelt øjendråbe, der indeholder CNO, effektivt kan fremkalde en robust aktivering af DREADD-udtrykte neuroner12. Her beskriver vi en modificeret metode til gentagen levering af øjendråber. For at opnå kronisk og vedvarende kontrol af designeren receptorer, vi næste beskrive en ikke-invasiv strategi for at levere CNO til mus gennem drikkevand. Endelig beskriver vi et alternativt paradigme for at levere CNO i drikkevand i et begrænset tidsrum vindue. Mus bevægeapparatet aktivitet, samt drikke adfærd og forbruget af søde kaloriefattige løsninger, er for det meste begrænset til den mørke del af lys/mørk cyklus13,14. Derfor vedtog vi en protokol baseret på musens præference for saccharose. Ved at måle induktion af den umiddelbare tidlige gene c-FOS i AAV-inficerede celler, som en udlæser for neuronal aktivering12,15, vi fandt, at disse CNO levering strategier robust aktivere dreadd-kontrollerede neuroner over forlænget Varigheder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

Chemogenetiske strategier er dukket op som pålidelige værktøjer til fjernstyring af neuronal aktivitet. Blandt disse er designer receptorer udelukkende aktiveret af designer drugs (DREADDs) blevet den mest populære kemogenetiske tilgang, der anvendes i moderne neurovidenskab. De fleste undersøgelser leverer ligand clozapin-N-oxid (CNO) ved hjælp af en enkelt intraperitoneal injektion, som er egnet til akut aktivering/hæmning af den målrettede neuronal population. Der er dog kun et par eksempler på strategier for kronisk graduering af DREADD-kontrollerede neuroner, hvoraf de fleste er afhængige af brugen af leveringssystemer, der kræver kirurgisk indgreb. Her udvider vi på to ikke-invasive strategier for at levere ligand CNO til kronisk manipulere neurale befolkning i mus. CNO blev administreret enten ved hjælp af gentagne (daglige) øjendråber eller kronisk gennem dyrets drikkevand. Disse ikke-invasive paradigmer resulterer i robust aktivering af designer receptorerne, der varede gennem hele CNO-behandlingerne. De metoder, der er beskrevet her, tilbyder alternativer til kronisk DREADD-medieret kontrol af neuronal aktivitet og kan være nyttige for eksperimenter designet til at evaluere adfærd i frit bevægende dyr, med fokus på mindre invasive CNO leveringsmetoder.

Vi bemærkede, at gentagne CNO-levering ved hjælp af øjendråber fremkaldte en robust induktion af c-FOS-ekspression i de fleste inficerede neuroner (figur 1c), hvilket viser, at effektiviteten af CNO-levering opretholdes under gentagen eksponering. Desuden blev der observeret en signifikant induktion af c-FOS i prøver indsamlet 2 timer efter behandling med CNO, sammenlignet med prøver opnået 6 timer efter CNO-eksponering (figur 1d-E), hvilket viser, at ændringer induc...

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Her beskriver vi to ikke-invasive metoder til kronisk kontrol af neuronal aktivitet ved hjælp af chemogenetik i mus. Øjendråber blev brugt til at levere clozapin-N-oxid (CNO) dagligt. Vi beskriver også to metoder til forlænget administration af CNO i drikkevand. Disse strategier for kronisk neuronal kontrol kræver minimal intervention reducere dyrs stress.

Ikke-invasive strategier for kronisk manipulation af DREADD-kontrollerede neuronal aktivitet

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DreadDs er den mest populære chemogenetic tilgang til fjernbetjening af neuronal aktivitet. Her tilbyder vi nye alternativer til gentagne eller kroniske dreadd kontrol, med fokus på mindre invasive CNO leveringsmetoder. Vi beskriver to strategier for den langvarige CNO levering i mus ved gentagne øjendråber, eller kronisk gennem dyrets drikkevand.De protokoller, der er beskrevet her, er eksempler på kroniske og noninvasive muligheder for CNO levering, der kan tilpasses en række eksperimentelle design, herunder forskellige dreadd varianter, væv, eller endda arter. Et centralt spørgsmål for en CNO levering er et dyrs stress og smerte. Disse protokoller minimerer dette problem og er nemme at udføre og tilpasse sig forskellige eksperimentelle indstillinger.Før operationen udføres, skal du rengøre og sterilisere den stereoaksiske ramme og alle nødvendige instrumenter. Når rammen er klar, bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids i en bedøvet blandet baggrund vilde type mandlige mus, barbere toppen af hovedet, og fastgør hovedet af musen til rammen. Derefter anvende okulær beskyttende smøremiddel på øjnene og endelig, rense den eksponerede hud med sekventiel povidone jod og 70% ethanol scrubs.Brug en steril skalpel til at udsætte kraniet og kalibrere rammen til bregma punkt. Bor ved en medialateral koordinat på 2,9 millimeter, og en forreste bageste koordinat på minus 2,7 millimeter til at målrette hippocampus. Når hjernen er udsat, bruge en mikro injektor og trak mikrokapillære pipetter til ensidigt injicere 90 nanoliters af adenoassocieret virus i hippocampus på en dorsal ventral dybde på minus tre millimeter.Luk derefter snittet med nylonsuturer, og fjern dyret fra rammen for analgesiadministration. Ved gentagen CNO-levering, begyndende fire uger efter injektionen, akklimatiseres dyrene til håndtering ved at scruffing hver mus tre minutter dagligt i tre til fire dage før administration af øjendråber. Når musene er blevet akklimatiseret til håndtering, veje hver mus til at bestemme den passende mængde CNO, der skal leveres for at opnå en milligram CNO pr kg kropsvægt koncentration.To timer før lyset slukkes i den inaktive fase, skal du indlæse en til tre mikroliter af den forberedte CNO-opløsning i en P10-mikropipette og immobilisere musen via scruffing. Fjern langsomt opløsningen, indtil der dannes en stabil dråbe på pipettenspidsen, og tag forsigtigt dråben tæt på hornhinden, indtil opløsningen leveres uden at røre pipetetspidsen i musens øje. Vend derefter musen tilbage til sit hjem bur, før du anvender CNO eyedrop til øjet af det næste dyr.I tilfælde, hvor CNO skal leveres i den aktive musefase, skal du sikre, at der er et svagt rødt lys til korrekt håndtering af dyr og CNO-levering. For kronisk CNO behandling, begyndende fire uger efter injektion og tre dage før behandlingen, erstatte de regelmæssige vandflasker med små flasker stoppet med gummi tud og dækket med aluminiumsfolie indeholdende 10 milliliter almindeligt vand. Sikker på burene med tape, så musene kan akklimatisere sig til flaskerne.Mål det daglige vandforbrug for hver mus, og veje hver mus. Test en række CNO-koncentrationer for at bestemme den dosis, der viser den maksimale effektivitet med den minimale CNO-koncentration. Fyld derefter hver lille flaske med otte milliliter almindeligt vand plus den nødvendige mængde CNO.Ved begrænset CNO-behandling, begyndende fire uger efter injektionen og tre dage før behandlingen påbegyndes, skal en lille flaske indeholdende 10 milliliter vand plus 1 % saccharose på buret væk fra den oprindelige vandflaske i den sidste del af dyrets aktive fase. Ved eksponeringens afslutning fjernes vand plus saccharoseopløsningerne fra hvert bur, og forbruget af saccharosevand for hvert dyr måles. Ved levering af CNO fyldes flaskerne med fem milliliter vand plus 1 %saccharose og et milligram pr. kg CNO.Flasken placeres i samme position som i sukkervandacclimiseringsperioden i den sidste del af den aktive fase, hvor flaskerne fjernes, og mængden af vand, saccharose og CNO, der indtages som påvist, fjernes. I slutningen af forsøget, høste det behandlede dyr hjernen i frisk fiksativ. Efter 9 til 12 timer, kryobeskytte hjernevævet i en 30% saccharose opløsning.Når hjernen synker, afsnit prøven på en kryostat. Når alle hjernesektionerne er opnået, og den uspecifikke binding er blokeret, inkuberes vævsprøverne med en anti-c-Fos antistofopløsning ved fire grader Celsius natten over med konstant omrøring. Næste morgen vaskes prøverne med tre fem minutters vaske i frisk PBS pr. vask, før prøverne inkuberes med et passende fluorescenskonjugeret sekundært antistof.Efter en time ved stuetemperatur og konstant omrøring beskyttet mod lys, få digitale billeder af de mærkede væv sektioner ved fluorescens konfokal mikroskopi. Efter indlæsning af billederne i ImageJ, kontur på måle områder af Adeno-associerede inficerede mCherry positive celler og kvantificere antallet af C falske positive celler inden for denne region for at opnå antallet af aktiverede celler pr område. Gentagen CNO-levering ved hjælp af øjendråber fremkalder en robust induktion af cFos-udtryk i de fleste inficerede neuroner, der viser, at effektiviteten af CNO-levering opretholdes under den gentagne eksponering.Desuden observeres der en signifikant induktion af cFos i prøver, der er indsamlet to timer efter behandling med CNO sammenlignet med prøver, der er udtaget seks timer efter CNO-eksponering, hvilket indikerer, at ændringer forårsaget af CNO er tidsafhængige. Det daglige forbrug af vand plus CNO er ikke signifikant anderledes i forhold til den samlede mængde almindeligt vand, der forbruges. Tilsvarende påvirkes mængden af vand plus 1 %sucrose, der forbruges om natten, ikke af tilsætningen af CNO, og der er heller ikke forskelle i det daglige forbrug af både vand plus CNO, og vand plus saccharose plus CNO observeret over en fem dages forsøgsperiode.I lighed med anvendelsen af CNO øjendråber, en robust induktion af cFos er observeret efter to, men ikke seks timers CNO drikkevand adgang. Desuden er der en klar effektivitetstærskel for CNO, da en lav CNO-dosis ikke fremkalder cFos-aktivering sammenlignet med en saltvandskontrol, mens højere doser fremkalder en robust og lignende cFos induktion. Vi anbefaler, at du udfører en analyse af dosisrespons for at definere den laveste CNO-dosis, der ikke reducerer neuronal aktivering væsentligt, og overvejer brugen af clozapin som en ligand.Her demonstrerede vi ved hjælp af CNO-medieret cFos induktion som følge af neuronal aktivering. Men, disse protokol kan let vedtages til elektrofysiologisk analyse eller adfærdsmæssige tests. DREADD teknologi er et kraftfuldt værktøj til fjernbetjening af neuronal aktivitet, og designe alternative strategier for CNO levering.Vi øger spektret af muligheder for eksperimentelle indstillinger og potentielle kliniske indgreb.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Kirurgisk implantation af Kroniske Neurale elektroder til Optagelse Single Unit Aktivitet og Electrocorticographic signaler

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, Real-time måling af laktat Koncentration og Optogenetic Manipulation af neuronale aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulation af Cerebellær granuleneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em&gt; At studere Neuronal morfologi og Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Ikke-invasiv Parenkymalt, vaskulære og metaboliske højfrekvent ultralyd og Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

Ikke-invasiv vurdering af ændringer i kortikomotoneuronal transmission i mennesker

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Ekstracellulær Registrering af neuronal aktivitet Kombineret med Microiontophoretic Anvendelse af Neuroaktive stoffer i Awake mus

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Optagelse Temperatur-induceret neuronal aktivitet gennem Overvågning Calcium Ændringer i det olfaktoriske pære af<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk transkranial elektrisk Stimulation og Intracortical optagelse i rotter

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Ikke-invasiv modulation og robot kortlægning af motorisk cortex i udviklings hjernen

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...