Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma aan het National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02). We willen graag de steun van de NIMH IRP rodent Behavioral core (ZIC MH002952) bedanken.

Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de commissies voor dierenverzorging en-gebruik van het National Institute of Mental Health (NIMH). Alle inspanningen werden gedaan om de pijn en het aantal gebruikte dieren te minimaliseren.
1. adeno-geassocieerde virus injecties in de hippocampus
Opmerking: Wild type mannelijke muizen met gemengde achtergrond (B6/129 F1 hybride, 3 maanden oud) waren voor stereotaxically geïnjecte...

<ol>
	<li>Park, H. G., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Manipulation+of+Neural+Circuits.">Selective Manipulation of Neural Circuits.</a> Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).</li><li>Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+depressed+brain:+optogenetic+and+chemogenetic+circuit+interrogation+in+animal+models+of+depression.">Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression.</a> Neuropsychopharmacology. 1, (2018).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+Tools+with+Therapeutic+Utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellate+cells+drive+maturation+of+the+entorhinal-hippocampal+circuit.">Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit.</a> Science. 355 (6330), (2017).</li><li>Mahler, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+receptors+show+role+for+ventral+pallidum+input+to+ventral+tegmental+area+in+cocaine+seeking.">Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking.</a> Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).</li><li>Lichtenberg, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+Amygdala+to+Orbitofrontal+Cortex+Projections+Enable+Cue-Triggered+Reward+Expectations.">Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).</li><li>Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+stressful+procedures+as+ether+anesthesia+and+intracranial+injections+on+amino+acid+incorporation+into+brain+protein.">Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein.</a> Brain Research Bulletin. , (1977).</li><li>Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+behavioral+deficits+following+a+routine+surgical+procedure+in+rats.">Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats.</a> Brain Research. , (2007).</li><li>Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye-Drops+for+Activation+of+DREADDs.">Eye-Drops for Activation of DREADDs.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).</li><li>LeGates, T. A., Altimus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+circadian+and+acute+light+responses+in+mice+using+wheel+running+activity.">Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+hedonic+drinking+behavior+in+mice.">Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice.</a> Neuroscience. 349, 229-238 (2017).</li><li>Fernandez, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Affects+Mood+and+Learning+through+Distinct+Retina-Brain+Pathways.">Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways.</a> Cell. 175 (1), 71-84 (2018).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin&#8217;s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs):+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li><li>Urban, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+The+Behavioral+Program+and+Neuronal+Network+Encoded+by+Dorsal+Raphe+Serotonergic+Neurons.">Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons.</a> Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).</li><li>Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+of+a+designer+G+q-coupled+receptor+improves+&#946;+cell+function.">Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves &#946; cell function.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).</li><li>MacLaren, D. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+N-Oxide+Administration+Produces+Behavioral+Effects+in+Long-Evans+Rats:+Implications+for+Designing+DREADD+Experiments.">Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetics+revealed:+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine.">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li></ol>

DREADDs zijn ontstaan als een populaire en effectieve aanpak voor het op afstand manipuleren van neuronale activiteit17. Het ontwerp van alternatieve strategieën voor CNO-levering zal in grote lijnen het spectrum van beschikbare opties voor specifieke experimentele instellingen vergroten. Bovendien, niet-invasieve strategieën voor de levering van CNO minimaliseren van eventuele verkeerde interpretatie van de resultaten door het verminderen van nadelige bijwerkingen die rechtstreeks van invloed k...

Technische vooruitgang op het gebied van de neurowetenschappen hebben wetenschappers in staat om nauwkeurig identificeren en controleren van de activiteit van bepaalde neuronale populaties1. Dit heeft bijgedragen aan het beter begrijpen van de basis van neuronale circuits en hun invloed op dierlijk gedrag, evenals, herziening van gevestigde dogma's2,3. Onder deze nieuwe instrumenten, optogenetische en chemogenetische strategieën hebben een ingrijpende invloed niet alleen op de kwaliteit van de ontdekkingen, maar ook op de manier waarop experimenten worden bedacht en ontworpen4. In het huidige manuscript richten we ons op chemogenetische strategieën voor het beheersen van de activering van neuronen via engineered receptor-ligand-strategieën. Designer receptoren uitsluitend geactiveerd door designer drugs (DREADDs) vertegenwoordigen een van de meest populaire chemogenetische hulpmiddelen voor de afstandsbediening van neuronale activiteit, zoals beoordeeld door Roth 20165. DREADDs maken gebruik van gemodificeerde muscarinische acetylcholine-receptoren die specifiek worden geactiveerd door een inert ligand, Clozapine-N-oxide (CNO)6.
De meeste studies gebruiken CNO toegediend door intraperitoneale (i.p.) injecties, die effectief regelt de dosering en timing van engineered receptoren activering in een acute mode. Echter, wanneer repetitieve of chronische DREADD activering vereist is, het gebruik van meerdere i.p. injecties onhaalbaar worden. Om dit probleem op te lossen, zijn verschillende strategieën voor de chronische CNO-levering gemeld, waaronder geïmplanteerde minipumps7 en intracraniële canules8,9. In verschillende mate veroorzaken al deze strategieën de dieren stress en pijn10, en vereisen een chirurgische ingreep die ook een directe invloed kan hebben op de gedrags responsen die moeten worden getest11. Hier beschrijven we drie niet-invasieve strategieën voor de chronische CNO-levering.
Voor dit doel, muizen werden stereotaxically geïnjecteerd in de Hippocampus met een adeno-geassocieerde virus (Aav) coderen van een Engineered versie van de excitatory M3 muscarinerge receptor (hM3Dq) dat wanneer geactiveerd door de ligand CNO leidt tot de burst-achtige afvuren van neuronen6. Eerder werd aangetoond dat een enkele oogdruppel die CNO bevat, effectief een robuuste activatie van DREADD-uitdrukken van neuronen12kan opwekken. Hier beschrijven we een gemodificeerde methode voor de repetitieve levering van oogdruppels. Om chronische en aanhoudende controle van de ontwerpers receptoren te bereiken, beschrijven we volgende een niet-invasieve strategie om CNO aan muizen door het drinkwater te leveren. Ten slotte beschrijven we een alternatief paradigma voor het leveren van CNO in drinkwater tijdens een beperkt tijdsvenster. Muizen motorische activiteit, evenals het drinkgedrag en de consumptie van zoete calorie-oplossingen, zijn meestal beperkt tot het donkere gedeelte van de licht/donkere cyclus13,14. Daarom hebben we een protocol aangenomen dat gebaseerd is op de voorkeur van de muis voor sucrose. Door het meten van de inductie van de directe-vroege gen c-fos in Aav-geïnfecteerde cellen, als een uitlezen voor neuronale activering12,15, we vonden dat deze CNO levering strategieën krachtig activeren dreadd-gecontroleerde neuronen over uitgebreide Duur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

Chemogenetische strategieën zijn ontstaan als betrouwbare instrumenten voor de afstandsbediening van neuronale activiteit. Onder deze, Designer receptoren uitsluitend geactiveerd door designer drugs (DREADDs) zijn uitgegroeid tot de meest populaire chemogenetische aanpak gebruikt in de moderne neurowetenschappen. De meeste studies leveren de ligand Clozapine-N-oxide (CNO) met behulp van een enkele intraperitoneale injectie, die geschikt is voor de acute activering/remming van de beoogde neuronale populatie. Er zijn echter slechts enkele voorbeelden van strategieën voor chronische modulatie van DREADD-gecontroleerde neuronen, waarvan de meerderheid afhankelijk is van het gebruik van toedieningssystemen die chirurgische interventie vereisen. Hier breiden we uit op twee niet-invasieve strategieën voor het leveren van de ligand CNO om de neurale populatie in muizen chronisch te manipuleren. CNO werd toegediend hetzij door het gebruik van repetitieve (dagelijkse) oogdruppels, of chronisch door het drinkwater van het dier. Deze niet-invasieve paradigma's resulteren in een robuuste activering van de Designer receptoren die persistent gemaakt gedurende de CNO behandelingen. De hier beschreven methoden bieden alternatieven voor de chronische DREADD-gemedieerde controle van neuronale activiteit en kan nuttig zijn voor experimenten ontworpen om gedrag te evalueren in vrij bewegende dieren, gericht op minder invasieve CNO leveringsmethoden.

We observeerden dat repetitieve CNO-levering met oogdruppels een robuuste inductie van c-fos-expressie in de meeste geïnfecteerde neuronen (figuur 1c) opriep, wat aantoont dat de effectiviteit van CNO-levering tijdens de herhaalde blootstelling wordt gehandhaafd. Bovendien werd een significante inductie van c-fos waargenomen in monsters die 2 uur na CNO-behandeling werden verzameld, in vergelijking met monsters die 6 uur na CNO-blootstelling (figuren 1d-E) werden verkregen,...

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Hier beschrijven we twee niet-invasieve methoden om chronisch controle Neuronale activiteit met behulp van chemogenetica in muizen. Oogdruppels werden gebruikt om Clozapine-N-oxide (CNO) dagelijks te leveren. We beschrijven ook twee methoden voor langdurige toediening van CNO in drinkwater. Deze strategieën voor chronische neuronale controle vereisen minimale interventie vermindering van de stress van dieren.

Niet-invasieve strategieën voor chronische manipulatie van de DREADD-gecontroleerde Neuronale activiteit

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADD's zijn de meest populaire chemogenetische aanpak voor afstandsbediening van neuronale activiteit. Hier bieden we nieuwe alternatieven voor repetitieve of chronische DREADD controle, gericht op minder invasieve CNO leveringsmethoden. We beschrijven twee strategieën voor de langdurige CNO-levering bij muizen door herhaalde oogdruppels, of chronisch door het drinkwater van het dier.De hier beschreven protocollen zijn voorbeelden van chronische en niet-invasieve opties voor CNO-levering die kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid aan experimentele ontwerpen, waaronder verschillende DREADD-varianten, weefsels of zelfs soorten. Een belangrijk punt voor een CNO levering is stress en pijn van een dier. Deze protocollen minimaliseren dit probleem en zijn eenvoudig uit te voeren en aan te passen aan verschillende experimentele instellingen.Voor het uitvoeren van de operatie, reinigen en steriliseren van de stereotaxic frame en alle benodigde instrumenten. Wanneer het frame klaar is, bevestig dan een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofde gemengde achtergrond wilde type mannelijke muis, scheren de bovenkant van het hoofd, en bevestig het hoofd van de muis op het frame. Breng vervolgens oculair beschermend smeermiddel aan op de ogen en maak ten slotte de blootgestelde huid schoon met sequentiële povidonjodium en 70% ethanolscrubt.Gebruik een steriele scalpel om de schedel bloot te stellen en het frame te kalibreren tot het bregma-punt. Boor op een medialaterale coördinaat van 2,9 millimeter, en een voorste coördinaat van min 2,7 millimeter om de hippocampus te targeten. Wanneer de hersenen worden blootgesteld, gebruik maken van een micro-injector en getrokken microcapillaire pipetten om eenzijdig injecteren 90 nanoliters van de adenoassociated virus in de hippocampus op een dorsale ventrale diepte van min drie millimeter.Sluit vervolgens de incisie met nylon hechtingen en verwijder het dier uit het frame voor analgesieadministratie. Voor repetitieve CNO-levering, vanaf vier weken na de injectie, acclimatiseren de dieren aan de behandeling door scruffing elke muis drie minuten per dag gedurende drie tot vier dagen voorafgaand aan de toediening van de oogdruppels. Wanneer de muizen gewend zijn geraakt aan de behandeling, weegt elke muis om de juiste hoeveelheid CNO te bepalen die moet worden geleverd om een één milligram CNO per kilogram lichaamsgewichtconcentratie te bereiken.Twee uur voor het uitlichten tijdens de inactieve fase, laad een tot drie microliter van de voorbereide CNO-oplossing in een P10-micropipet en immobiliseer de muis via scruffing. Verdrijf de oplossing langzaam totdat zich een stabiele druppel vormt op de pipetpunt en breng de druppel voorzichtig dicht bij het hoornvlies totdat de oplossing wordt geleverd zonder de pipettepunt aan het oog van de muis aan te raken. Breng de muis vervolgens terug naar zijn thuiskooi voordat u de CNO-oogdruppel op het oog van het volgende dier brengt.In gevallen waarin CNO moet worden geleverd tijdens de muis actieve fase, zorgen voor de aanwezigheid van een zwak rood licht voor een goede behandeling van dieren en CNO levering. Voor chronische CNO behandeling, vanaf vier weken na injectie en drie dagen voor aanvang van de behandeling, vervang de reguliere flessen water met kleine flessen gestopt met rubberen tuiten en bedekt met aluminiumfolie met 10 milliliter regelmatig water. Zet de kooien vast met tape om muizen te laten acclimatiseren aan de flessen.Meet het dagelijkse waterverbruik voor elke muis en weeg elke muis. Test een reeks CNO-concentraties om de dosis te bepalen die de maximale effectiviteit weergeeft met de minimale CNO-concentratie. Vul vervolgens elke kleine fles met acht milliliter gewoon water plus de vereiste hoeveelheid CNO.Voor beperkte CNO-behandeling, vanaf vier weken na injectie en drie dagen voor aanvang van de behandeling, plaats een klein flesje met 10 milliliter water plus 1%sucrose op de kooi weg van de oorspronkelijke waterfles tijdens het laatste deel van de actieve fase van het dier. Verwijder aan het einde van de blootstelling het water plus sacharoseoplossingen uit elke kooi en meet het waterverbruik voor elk dier. Voor CNO levering, vul de flessen met vijf milliliter water plus 1%sucrose en een milligram per kilogram CNO.Plaats de fles in dezelfde positie als tijdens de suikerwateratcliatieperiode tijdens het laatste deel van de actieve fase, verwijder de flessen en meet de hoeveelheid water, sacharose en CNO verbruikt zoals aangetoond. Aan het einde van het experiment, oogst de behandelde dierlijke hersenen in verse fixatief. Na 9 tot 12 uur beschermt cryoprotect het hersenweefsel in een 30%sucroseoplossing.Wanneer de hersenen zinken, sectie het monster op een cryostat. Wanneer alle hersensecties zijn verkregen en de niet-specifieke binding is geblokkeerd, worden de weefselmonsters incubeer gemaakt met een anti-c-Fos-antilichaamoplossing bij vier graden Celsius 's nachts met constante agitatie. De volgende ochtend was je de monsters met drie wasbeurten van vijf minuten in verse PBS per wasbeurt voordat je de monsters uitbroedt met een passend fluorescentiegeconjugeerd secundair antilichaam.Na een uur bij kamertemperatuur en constante agitatie beschermd tegen licht, verkrijgen van digitale beelden van de gelabelde weefselsecties door fluorescentie confocale microcroscopie. Na het laden van de beelden in ImageJ, schets op meten van de gebieden van Adeno-geassocieerde geïnfecteerde mCherry positieve cellen en kwantificeren van het aantal C vals-positieve cellen binnen dit gebied om het aantal geactiveerde cellen per gebied te verkrijgen. Repetitive CNO delivery using eyedrops elicits a robust inductie of cFos expression in most infected neurons demonstrating that the effectiveness of CNO delivery is sustained during the repetitive exposure.Bovendien wordt een significante inductie van cFos waargenomen in monsters die twee uur na de CNO-behandeling zijn verzameld in vergelijking met monsters die zes uur na blootstelling aan CNO zijn verkregen, wat aangeeft dat veranderingen die door CNO worden veroorzaakt, tijdsafhankelijk zijn. Het dagelijkse waterverbruik plus CNO is niet significant anders in vergelijking met het totale volume van het regelmatige water verbruikt. Evenzo wordt de hoeveelheid water plus 1% sacharose verbruikt tijdens de nacht niet beïnvloed door de toevoeging van CNO, noch zijn verschillen in de dagelijkse consumptie van zowel water plus CNO, en water plus sacharose plus CNO waargenomen over een vijf-daagse experimentele periode.Vergelijkbaar met de toepassing van CNO-oogdruppels, wordt een robuuste inductie van cFos waargenomen na twee, maar niet zes uur toegang tot het drinkwater van CNO. Bovendien is er een duidelijke doeltreffendheidsdrempel voor CNO, aangezien een lage CNO-dosis geen cFos-activering uitlokt in vergelijking met een zoutbeheersingscontrole, terwijl hogere doses een robuuste en vergelijkbare cFos-inductie veroorzaken. We raden aan om een dosisresponsanalyse uit te voeren om de laagste CNO-dosis te definiëren die de neuronale activering niet significant vermindert en het gebruik clozapine als ligand overweegt.Hier hebben we aangetoond met behulp van CNO-gemedieerde cFos inductie als gevolg van neuronale activering. Echter, deze protocol kan gemakkelijk worden aangenomen om elektrofysiologische analyse of gedragstests. DREADD-technologie is een krachtig hulpmiddel voor de afstandsbediening van neuronale activiteit, en het ontwerpen van alternatieve strategieën voor CNO levering.We zullen het spectrum van opties voor experimentele instellingen en mogelijke klinische interventies vergroten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Chirurgische Implantatie van chronische neurale elektroden voor opname Single Unit Activiteit en electrocorticografische signalen

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Niet-invasieve Parenchymale, Vasculaire en Metabole Hoogfrequent Ultrasound en Fotoakoestisch Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

Niet-invasieve beoordeling van veranderingen in de corticomotoneuronale transmissie bij mensen

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Opname-temperatuur-geïnduceerde neuronale activiteit door middel van monitoring Calcium Veranderingen in de Olfactorische Bulb van<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Chronische Transcraniële elektrische stimulatie en Intracortical opname in ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Niet-invasieve modulatie en Robotic mapping van de motorische cortex in de ontwikkelende hersenen

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...