Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
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Ce travail a été appuyé par le programme de recherche intra-muros de l'Institut national de santé mentale (ZIA MH002964-02). Nous tenons à remercier le soutien du NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952).

Tous les animaux ont été manipulés conformément aux lignes directrices des Comités de soins et d'utilisation des animaux de l'Institut national de la santé mentale (NIMH). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la douleur et le nombre d'animaux utilisés.
1. Injections de virus associées à l'adéno dans l'hippocampe
REMARQUE: Des souris mâles sauvages de type de fond mélangé (B6/129 F1 hybride, 3 mois) étaient pour stéréotaxéme...

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DREADDs ont émergé comme une approche populaire et efficace pour manipuler à distance l'activité neuronale17. La conception de stratégies alternatives pour la livraison de CNO augmentera largement le spectre des options disponibles pour des paramètres expérimentaux spécifiques. En outre, les stratégies non invasives pour la livraison de CNO minimisent toute mauvaise interprétation potentielle des résultats en réduisant les effets secondaires indésirables qui peuvent avoir un impact di...

Les progrès techniques dans le domaine des neurosciences ont permis aux scientifiques d'identifier et de contrôler précisément l'activité de certaines populations neuronales1. Cela a contribué à mieux comprendre la base des circuits neuronaux et leur impact sur le comportement animal, ainsi que, la révision des dogmes établis2,3. Parmi ces nouveaux outils, les stratégies optogénétiques et chimiogénétiques ont eu un impact profond non seulement sur la qualité des découvertes, mais aussi sur la façon dont les expériences sont conçues et conçues4. Dans le présent manuscrit, nous nous concentrons sur les stratégies chimiogénétiques pour contrôler l'activation des neurones par l'intermédiaire de stratégies de récepteur-ligand modifiées. Les récepteurs de concepteur exclusivement activés par les drogues de concepteur (DREADDs) représentent l'un des outils chimiogènes les plus populaires pour le contrôle à distance de l'activité neuronale, tel qu'examiné par Roth 20165. Les DREADD utilisent des récepteurs d'acétylcholine muscarinique modifiés qui sont spécifiquement activés par un ligand inerte, clozapine-N-oxyde (CNO)6.
La plupart des études utilisent CNO administré par injections intrapéritonéales (i.p.), qui contrôle efficacement la posologie et le moment de l'activation des récepteurs modifiés d'une manière aigue. Cependant, lorsque l'activation dREADD répétitive ou chronique est nécessaire, l'utilisation de multiples injections i.p. devient irréalisable. Pour résoudre ce problème, différentes stratégies pour la livraison chronique de CNO ont été rapportées, y compris les minipompes implantées7 et les cannulas intracrâniennes8,9. À des degrés différents, toutes ces stratégies causent le stress et la douleur des animaux10, et nécessitent une intervention chirurgicale qui pourrait également avoir un impact direct sur les réponses comportementales à tester11. Ici, nous décrivons trois stratégies non-invasives pour l'administration chronique de CNO.
À cette fin, des souris ont été injectées stéréotaxiquement dans l'hippocampe avec un virus adéno-associé (AAV) codant une version machinée du récepteur muscarinique M3 excitateur (hM3Dq) qui, lorsqu'il est activé par le ligand CNO conduit à l'éclatement-comme le tir de neurones6. Il a été précédemment montré qu'une seule goutte d'oeil contenant CNO peut effectivement susciter une activation robuste des neurones DREADD-exprimant12. Ici nous décrivons une méthode modifiée pour la livraison répétitive des gouttes d'oeil. Pour obtenir un contrôle chronique et durable des récepteurs de concepteur, nous décrivons ensuite une stratégie non invasive pour livrer CNO aux souris par l'eau potable. Enfin, nous décrivons un paradigme alternatif pour la livraison de CNO dans l'eau potable au cours d'une fenêtre de temps restreint. L'activité locomotrice des souris, ainsi que le comportement de consommation et la consommation de solutions caloriques douces, sont la plupart du temps limitées à la partie foncée du cycle lumière/obscurité13,14. Par conséquent, nous avons adopté un protocole basé sur la préférence de la souris pour le saccharose. En mesurant l'induction du gène c-Fos immédiat-précoce dans les cellules infectées par l'AAV, comme une lecture pour l'activation neuronale12,15, nous avons constaté que ces stratégies de livraison CNO activent vigoureusement les neurones contrôlés par DREADD sur étendu Durées.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

Les stratégies chimiogénétiques sont apparues comme des outils fiables pour le contrôle à distance de l'activité neuronale. Parmi ceux-ci, les récepteurs de concepteur exclusivement activés par les drogues de concepteur (DREADDs) sont devenus l'approche chimiogénétique la plus populaire utilisée dans les neurosciences modernes. La plupart des études fournissent le ligand clozapine-N-oxyde (CNO) à l'aide d'une seule injection intrapéritonéale, qui convient à l'activation/inhibition aigue de la population neuronale ciblée. Il n'existe cependant que quelques exemples de stratégies de modulation chronique des neurones contrôlés par DREADD, dont la majorité reposent sur l'utilisation de systèmes d'administration nécessitant une intervention chirurgicale. Ici, nous élargissons sur deux stratégies non-invasives pour fournir le CNO ligand pour manipuler chroniquement la population neurale chez les souris. CNO a été administré soit en utilisant répétitif (quotidiennement) des gouttes oculaires, ou chroniquement à travers l'eau potable de l'animal. Ces paradigmes non invasifs se traduisent par une activation robuste des récepteurs de concepteur qui ont persisté tout au long des traitements CNO. Les méthodes décrites ici offrent des alternatives pour le contrôle chronique DREADD-négocié de l'activité neuronale et peuvent être utiles pour des expériences conçues pour évaluer le comportement chez les animaux en mouvement libre, en se concentrant sur les méthodes de livraison CNO moins invasives.

Nous avons observé que la livraison répétitive de CNO utilisant des gouttes d'oeil a suscité une induction robuste de l'expression de c-Fos dans la plupart des neurones infectés (figure 1C),montrant que l'efficacité de la livraison de CNO est soutenue pendant l'exposition répétitive. En outre, une induction significative de c-Fos a été observée dans les échantillons prélevés 2 h après le traitement CNO, par rapport aux échantillons obtenus 6 h après l'exposition au CNO (<str...

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Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Ici nous décrivons deux méthodes non-invasives pour commander chroniquement l'activité neuronale utilisant la chimiogénétique chez les souris. Des gouttes d'oeil ont été employées pour livrer le clozapine-N-oxyde (CNO) quotidiennement. Nous décrivons également deux méthodes pour l'administration prolongée de CNO dans l'eau potable. Ces stratégies de contrôle neuronal chronique nécessitent une intervention minimale réduisant le stress des animaux.

Stratégies non invasives pour la manipulation chronique de l'activité neuronale contrôlée par DREADD

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

Dreadds sont l’approche chimiogénétique la plus populaire pour la télécommande de l’activité neuronale. Ici, nous offrons de nouvelles alternatives pour le contrôle répétitif ou chronique dreadd, en mettant l’accent sur les méthodes d’administration moins invasives CNO. Nous décrivons deux stratégies pour la livraison prolongée de CNO chez les souris par des gouttes oculaires répétitives, ou chroniquement par l’eau potable de l’animal.Les protocoles décrits ici sont des exemples d’options chroniques et non invasives pour la livraison de CNO qui peuvent être adaptées à une variété de conceptions expérimentales, y compris différentes variantes DREADD, tissus, ou même des espèces. Un problème clé pour une livraison de CNO est le stress et la douleur d’un animal. Ces protocoles minimisent ce problème et sont faciles à exécuter et à adapter aux différents paramètres expérimentaux.Avant d’effectuer la chirurgie, nettoyez et stérilisez le cadre stéréotaxique et tous les instruments nécessaires. Lorsque le cadre est prêt, confirmer un manque de réponse au pincement des pieds dans un fond mixte anesthésié souris mâle de type sauvage, raser le haut de la tête, et fixer la tête de la souris au cadre. Appliquez ensuite un lubrifiant protecteur oculaire sur les yeux et, enfin, nettoyez la peau exposée avec de l’iode séquentiel de povidone et des gommages à 70 % d’éthanol.Utilisez un scalpel stérile pour exposer le crâne et calibrer le cadre jusqu’au point de bregma. Forez à une coordonnée médialatérale de 2,9 millimètres, et une coordonnée postérieure antérieure de moins 2,7 millimètres pour cibler l’hippocampe. Lorsque le cerveau est exposé, utilisez un micro-injecteur et des pipettes microcapillaires tirées pour injecter unilatéralement 90 nanolitres du virus adénoassocié dans l’hippocampe à une profondeur ventrale dorsale de moins trois millimètres.Ensuite, fermez l’incision avec des sutures de nylon, et retirez l’animal du cadre pour l’administration d’analgésie. Pour l’accouchement répétitif par CNO, à partir de quatre semaines après l’injection, acclimatez les animaux à la manipulation en débraillant chaque souris trois minutes par jour pendant trois à quatre jours avant l’administration des gouttes oculaires. Lorsque les souris se sont acclimatées à la manipulation, peser chaque souris pour déterminer la quantité appropriée de CNO à livrer pour atteindre un milligramme de CNO par kilogramme de concentration de poids corporel.Deux heures avant l’arrêt des lumières pendant la phase inactive, chargez un à trois microlitres de la solution CNO préparée dans une micropipette P10 et immobilisez la souris par scruffing. Expulsez lentement la solution jusqu’à ce qu’une gouttelette stable se forme sur la pointe de la pipette et amenez soigneusement la gouttelette près de la cornée jusqu’à ce que la solution soit livrée sans toucher la pointe de la pipette à l’œil de la souris. Ensuite, retournez la souris dans sa cage avant d’appliquer la goutte oculaire CNO à l’œil de l’animal suivant.Dans les cas où le CNO doit être livré pendant la phase active de la souris, assurer la présence d’une faible lumière rouge pour une manipulation adéquate des animaux et la livraison du CNO. Pour le traitement chronique par CNO, à partir de quatre semaines après l’injection et trois jours avant le début du traitement, remplacer les bouteilles d’eau régulières par de petites bouteilles arrêtées par des becs en caoutchouc et recouvertes de papier d’aluminium contenant 10 millilitres d’eau ordinaire. Fixer les cages avec du ruban adhésif pour permettre aux souris de s’acclimater aux bouteilles.Mesurez la consommation quotidienne d’eau pour chaque souris et pesez chaque souris. Testez une gamme de concentrations de CNO pour déterminer la dose qui affiche l’efficacité maximale avec la concentration minimale de CNO. Remplissez ensuite chaque petite bouteille de huit millilitres d’eau ordinaire plus la quantité requise de CNO.Pour un traitement restreint par CNO, commençant quatre semaines après l’injection et trois jours avant le début du traitement, placez une petite bouteille contenant 10 millilitres d’eau plus 1 % de saccharose sur la cage loin de la bouteille d’eau d’origine pendant la dernière partie de la phase active de l’animal. À la fin de l’exposition, retirez l’eau et les solutions de saccharose de chaque cage et mesurez la consommation d’eau saccharose pour chaque animal. Pour la livraison du CNO, remplissez les bouteilles de cinq millilitres d’eau plus 1 % de saccharose et un milligramme par kilogramme de CNO.Placez la bouteille dans la même position que pendant la période d’acclimation de l’eau sucrée pendant la dernière partie de la phase active, en enlevant les bouteilles et en mesurant la quantité d’eau, de saccharose et de CNO consommée comme démontré. À la fin de l’expérience, récolter le cerveau animal traité en fixatif frais. Après 9 à 12 heures, cryoprotect le tissu cérébral dans une solution de saccharose de 30%.Lorsque le cerveau coule, sectionner l’échantillon sur un cryostat. Lorsque toutes les sections du cerveau ont été obtenues et que la liaison non spécifique est bloquée, incuber les échantillons de tissus avec une solution anticorps anti-c-Fos à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec agitation constante. Le lendemain matin, lavez les échantillons avec trois lavages de cinq minutes en PBS frais par lavage avant d’incuber les échantillons avec un anticorps secondaire conjugué à fluorescence approprié.Après une heure à température ambiante et une agitation constante à l’abri de la lumière, obtenez des images numériques des sections de tissus étiquetés par microcroscopie confoccale de fluorescence. Après le chargement des images dans ImageJ, décrire à mesure les zones des cellules mCherry positives infectées associées à Adeno et quantifier le nombre de cellules C faussement positives dans cette région pour obtenir le nombre de cellules activées par zone. La livraison répétitive de CNO utilisant des gouttes d’oeil obtient une induction robuste de l’expression de cFos dans la plupart des neurones infectés démontrant que l’efficacité de la livraison de CNO est soutenue pendant l’exposition répétitive.De plus, une induction significative de cFos est observée dans les échantillons prélevés deux heures après le traitement par CNO par rapport aux échantillons obtenus six heures après l’exposition au CNO, ce qui indique que les changements induits par le CNO dépendent du temps. La consommation quotidienne d’eau plus cno n’est pas significativement différente par rapport au volume total d’eau ordinaire consommée. De même, la quantité d’eau plus 1 % de saccharose consommée pendant la nuit n’est pas affectée par l’ajout de CNO, pas plus les différences dans la consommation quotidienne d’eau plus le CNO, et l’eau plus le saccharose plus le CNO observées sur une période expérimentale de cinq jours.Semblable à l’application des gouttes oculaires de CNO, une induction robuste de cFos est observée après deux, mais pas six heures d’accès à l’eau potable de CNO. En outre, il y a un seuil clair d’efficacité pour CNO car une faible dose de CNO n’obtient pas l’activation de cFos comparée à un contrôle salin, tandis que des doses plus élevées induisent une induction robuste et semblable de cFos. Nous recommandons d’effectuer une analyse de la réponse à la dose pour définir la dose de CNO la plus faible qui ne réduit pas significativement l’activation neuronale, et en considérant l’utilisation de la clozapine comme ligand.Ici nous avons démontré utilisant l’induction cfos CNO-médiée à la suite de l’activation neuronale. Cependant, ces protocoles peuvent être facilement adoptés à l’analyse électrophysiologique ou aux tests comportementaux. La technologie DREADD est un outil puissant pour la télécommande de l’activité neuronale, et la conception de stratégies alternatives pour la livraison de CNO.Nous allons augmenter le spectre des options pour les milieux expérimentaux et les interventions cliniques potentielles.

Research

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Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

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