Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch das intramurale Forschungsprogramm am National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02) unterstützt. Wir danken der Unterstützung des NIMH IRP Nagetier Behavioral Core (ZIC MH002952).

Alle Tiere wurden nach den Richtlinien der Tierpflege- und Einsatzausschüsse des National Institute of Mental Health (NIMH) behandelt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um den Schmerz und die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren.
1. Adeno-assoziierte Virusinjektionen im Hippocampus
HINWEIS: Wilde männliche Mäuse mit gemischtem Hintergrund (B6/129 F1 Hybrid, 3 Monate alt) wurden für stereotaxisch mit einem AAV injiziert, der den M3-Muska...

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DREADDs haben sich als ein beliebter und effektiver Ansatzzur Fernmanipulation neuronaler Aktivität 17 herauskristallisiert. Die Entwicklung alternativer Strategien für die CNO-Bereitstellung wird das Spektrum der verfügbaren Optionen für spezifische experimentelle Einstellungen weitgehend erweitern. Darüber hinaus minimieren nicht-invasive Strategien für die Bereitstellung von CNO mögliche Fehlinterpretationen von Ergebnissen, indem sie nebenwirkungen, die sich direkt auf die Gesundheit de...

Technische Fortschritte auf dem Gebiet der Neurowissenschaften haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die Aktivität bestimmter neuronaler Populationen genau zu identifizieren und zu kontrollieren1. Dies hat dazu beigetragen, die Grundlagen der neuronalen Schaltkreise und ihre Auswirkungen auf das Verhalten von Tieren besser zu verstehen, sowie die Überarbeitung etablierter Dogmen2,3. Unter diesen neuartigen Werkzeugen haben optogenetische und chemogenetische Strategien nicht nur die Qualität der Entdeckungen, sondern auch die Art und Weise, wie Experimente konzipiert und gestaltet werden, tiefgreifend beeinflusst4. Im vorliegenden Manuskript konzentrieren wir uns auf chemogenetische Strategien zur Steuerung der Aktivierung von Neuronen über entwickelte Rezeptor-Ligand-Strategien. Designerrezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADDs) aktiviert werden, stellen eines der beliebtesten chemogenetischen Werkzeuge für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität dar, wie von Roth 20165überprüft. DREADDs verwenden modifizierte muscarinische Acetylcholin-Rezeptoren, die speziell durch eine inerte Liganligande aktiviert werden, Clozapin-N-Oxid (CNO)6.
Die meisten Studien verwenden CNO durch intraperitoneale (i.p.) Injektionen verabreicht, die effektiv steuert die Dosierung und Timing der technischen Rezeptoren Aktivierung in akuter Weise. Wenn jedoch eine repetitive oder chronische DREADD-Aktivierung erforderlich ist, wird die Verwendung mehrerer i.p.-Injektionen nicht mehr möglich. Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Strategien für die chronische CNO-Lieferung berichtet, einschließlich implantierter Minipumpen7 und intrakraniellen Kanülen8,9. In unterschiedlichem Ausmaß verursachen all diese Strategien Stress und Schmerzen10, und erfordern einen chirurgischen Eingriff, der auch einen direkten Einfluss auf die Zutest-Verhaltensreaktionen haben könnte11. Hier beschreiben wir drei nicht-invasive Strategien für die chronische CNO-Entbindung.
Zu diesem Zweck wurden Mäuse stereotaxisch in den Hippocampus mit einem Adeno-assoziierten Virus (AAV) injiziert, der eine technische Version des exzitatorischen M3-Muskarinrezeptors (hM3Dq) kodiert, der bei Aktivierung durch den Liganden CNO zum burstartigen Abfeuern von Neuronen6. Es wurde zuvor gezeigt, dass ein einzelner Augentropfen, der CNO enthält, effektiv eine robuste Aktivierung der DREADD-exemitten Neuronen12auslösen kann. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode zur wiederholten Abgabe von Augentropfen. Um eine chronische und nachhaltige Kontrolle der Designerrezeptoren zu erreichen, beschreiben wir als nächstes eine nicht-invasive Strategie, Um cNO an Mäuse durch das Trinkwasser zu liefern. Schließlich beschreiben wir ein alternatives Paradigma für die Bereitstellung von CNO im Trinkwasser während eines begrenzten Zeitfensters. Die Motoraktivität der Mäuse sowie das Trinkverhalten und der Konsum von süßen Kalorienlösungen beschränken sich meist auf den dunklen Teil des Hellen/Dunkel-Zyklus13,14. Daher haben wir ein Protokoll angenommen, das auf der Vorliebe der Maus für Saccharose basiert. Durch die Messung der Induktion des unmittelbar-frühen Gens c-Fos in AAV-infizierten Zellen, als Auslese für neuronale Aktivierung12,15, fanden wir heraus, dass diese CNO-Lieferstrategien DREADD-kontrollierte Neuronen über erweiterte Dauer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

Chemogenetische Strategien haben sich als zuverlässige Werkzeuge für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität herauskristallisiert. Unter diesen, Designer-Rezeptoren ausschließlich durch Designer-Medikamente aktiviert (DREADDs) haben sich die beliebtesten chemogenetischen Ansatz in der modernen Neurowissenschaft verwendet. Die meisten Studien liefern das Ligand Clozapin-N-Oxid (CNO) mit einer einzigen intraperitonealen Injektion, die für die akute Aktivierung/Hemmung der gezielten neuronalen Population geeignet ist. Es gibt jedoch nur wenige Beispiele für Strategien zur chronischen Modulation von DREADD-kontrollierten Neuronen, von denen die meisten auf den Einsatz von Trägersystemen angewiesen sind, die einen chirurgischen Eingriff erfordern. Hier erweitern wir zwei nicht-invasive Strategien zur Bereitstellung des Liganden-CNO zur chronischen Manipulation der neuronalen Population bei Mäusen. CNO wurde entweder mit repetitiven (täglichen) Augentropfen oder chronisch durch das Trinkwasser des Tieres verabreicht. Diese nicht-invasiven Paradigmen führen zu einer robusten Aktivierung der Designerrezeptoren, die während der gesamten CNO-Behandlungen fortbestehen. Die hier beschriebenen Methoden bieten Alternativen zur chronischen DREADD-vermittelten Kontrolle der neuronalen Aktivität und können für Experimente nützlich sein, die entwickelt wurden, um das Verhalten bei frei beweglichen Tieren zu bewerten, wobei der Schwerpunkt auf weniger invasiven CNO-Bereitstellungsmethoden liegt.

Wir beobachteten, dass eine wiederholte CNO-Lieferung mit Augentropfen eine robuste Induktion der c-Fos-Expression in den meisten infizierten Neuronen hervorrief (Abbildung 1C), was zeigt, dass die Wirksamkeit der CNO-Bereitstellung während der wiederholten Exposition aufrechterhalten wird. Darüber hinaus wurde eine signifikante Induktion von c-Fos in Proben beobachtet, die 2 h nach der CNO-Behandlung entnommen wurden, verglichen mit Proben, die 6 h nach CNO-Exposition(Abbildungen ...

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Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Hier beschreiben wir zwei nicht-invasive Methoden zur chronischen Kontrolle der neuronalen Aktivität mit Chemogenetik bei Mäusen. Augentropfen wurden verwendet, um Clozapin-N-Oxid (CNO) täglich zu liefern. Wir beschreiben auch zwei Methoden für die längere Verabreichung von CNO im Trinkwasser. Diese Strategien zur chronischen neuronalen Kontrolle erfordern minimale Eingriffe, um den Stress der Tiere zu reduzieren.

Nicht-invasive Strategien zur chronischen Manipulation der DREADD-kontrollierten neuronalen Aktivität

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDs sind der beliebteste chemogenetische Ansatz für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität. Hier bieten wir neue Alternativen zur repetitiven oder chronischen DREADD-Steuerung, die sich auf weniger invasive CNO-Liefermethoden konzentrieren. Wir beschreiben zwei Strategien für die verlängerte CNO-Entbindung bei Mäusen durch sich wiederholende Augentropfen oder chronisch durch das Trinkwasser des Tieres.Die hier beschriebenen Protokolle sind Beispiele für chronische und nichtinvasive Optionen für die CNO-Bereitstellung, die an eine Vielzahl von experimentellen Designs angepasst werden können, einschließlich verschiedener DREADD-Varianten, Gewebe oder sogar Arten. Ein zentrales Thema für eine CNO-Lieferung ist der Stress und der Schmerz eines Tieres. Diese Protokolle minimieren dieses Problem und sind einfach durchzuführen und an verschiedene experimentelle Einstellungen anzupassen.Vor der Durchführung der Operation, reinigen und sterilisieren Sie den stereotaxic Rahmen und alle notwendigen Instrumente. Wenn der Rahmen bereit ist, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in einem anästhesierten gemischten Hintergrund wilde Typ männliche Maus, rasieren Sie die Oberseite des Kopfes, und fixieren Sie den Kopf der Maus auf den Rahmen. Dann okulares Schutzschmiermittel auf die Augen auftragen und schließlich die exponierte Haut mit sequentiellem Povidonjod und 70% Ethanolpeelings reinigen.Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Schädel freizulegen und den Rahmen auf den Bregma-Punkt zu kalibrieren. Bohren Sie an einer medialateralen Koordinate von 2,9 Millimetern und einer vorderen hinteren Koordinate von minus 2,7 Millimetern, um den Hippocampus anzugreifen. Wenn das Gehirn exponiert ist, verwenden Sie einen Mikroinjektor und gezogene Mikrokapillarpipetten, um einseitig 90 Nanoliter des adenoassoziierten Virus in den Hippocampus mit einer dorsalen ventralen Tiefe von minus drei Millimetern zu injizieren.Schließen Sie dann den Schnitt mit Nylonnähten, und entfernen Sie das Tier aus dem Rahmen für die Analgesie-Verabreichung. Für eine wiederholte CNO-Lieferung, beginnend vier Wochen nach der Injektion, akklimatisieren Sie die Tiere zu behandeln, indem Sie jede Maus drei Minuten täglich für drei bis vier Tage vor der Verabreichung der Augentropfen scruffing. Wenn die Mäuse sich an die Handhabung gewöhnt haben, wiegen Sie jede Maus, um die entsprechende Menge an CNO zu bestimmen, die geliefert werden soll, um ein Milligramm CNO pro Kilogramm Körpergewichtskonzentration zu erreichen.Zwei Stunden vor dem Ausleuchten während der inaktiven Phase ein bis drei Mikroliter der vorbereiteten CNO-Lösung in eine P10-Mikropipette laden und die Maus durch Scruffing immobilisieren. Die Lösung langsam austreiben, bis sich ein stabiles Tröpfchen auf der Pipettenspitze bildet, und das Tröpfchen vorsichtig in die Nähe der Hornhaut bringen, bis die Lösung geliefert wird, ohne die Pipettenspitze an das Auge der Maus zu berühren. Dann kehren Sie die Maus in ihren Hauskäfig zurück, bevor Sie die CNO-Augenkeinedes auf das Auge des nächsten Tieres auftragen.In Fällen, in denen CNO während der aktiven Mausphase geliefert werden muss, stellen Sie sicher, dass ein dim rotes Licht für die ordnungsgemäße Handhabung von Tieren und die CNO-Lieferung auftritt. Für die chronische CNO-Behandlung, beginnend vier Wochen nach der Injektion und drei Tage vor Beginn der Behandlung, ersetzen Sie die regulären Wasserflaschen mit kleinen Flaschen gestoppt mit Gummiausläufen und bedeckt mit Aluminiumfolie mit 10 Milliliter normales Wasser bedeckt. Sichern Sie die Käfige mit Klebeband, damit sich Mäuse an die Flaschen akklimatisieren können.Messen Sie den täglichen Wasserverbrauch für jede Maus und wiegen Sie jede Maus. Testen Sie eine Reihe von CNO-Konzentrationen, um die Dosis zu bestimmen, die die maximale Wirksamkeit mit der minimalen CNO-Konzentration anzeigt. Dann füllen Sie jede kleine Flasche mit acht Milliliter n. Wasser zuzüglich der erforderlichen Menge CNO.Für eine eingeschränkte CNO-Behandlung, beginnend vier Wochen nach der Injektion und drei Tage vor Beginn der Behandlung, legen Sie eine kleine Flasche mit 10 Milliliter Wasser plus 1%Saccharose auf den Käfig weg von der ursprünglichen Wasserflasche während der letzten Portion der aktiven Phase des Tieres. Am Ende der Exposition entfernen Sie das Wasser plus Saccharoselösungen aus jedem Käfig und messen Sie den Saccharosewasserverbrauch für jedes Tier. Für die CNO-Lieferung die Flaschen mit fünf Milliliter Wasser plus 1%Saccharose und einem Milligramm pro Kilogramm CNO füllen.Stellen Sie die Flasche während der Zeit während der Zuckerwasserakklimatisierungwährend während der letzten Phase der aktiven Phase in die gleiche Position wie während der Zuckerwasserakklimatisierungsphase, entfernen Sie die Flaschen und messen Sie die Menge an Wasser, Saccharose und CNO, wie gezeigt. Am Ende des Experiments, ernten Sie das behandelte Tier Gehirn in frische Fixierung. Nach 9 bis 12 Stunden, kryoprotect das Gehirngewebe in einer 30%Saccharose-Lösung.Wenn das Gehirn sinkt, abschnitt die Probe auf einem Kryostat. Wenn alle Hirnabschnitte erhalten und die unspezifische Bindung blockiert sind, inkubieren Sie die Gewebeproben mit einer Anti-c-Fos-Antikörperlösung bei vier Grad Celsius über Nacht mit ständiger Erregung. Am nächsten Morgen die Proben mit drei fünfminütigen Waschungen in frischem PBS pro Waschgang waschen, bevor sie die Proben mit einem geeigneten fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper inkubieren.Nach einer Stunde bei Raumtemperatur und ständiger, lichtgeschützter Rührung erhalten Sie digitale Bilder der beschrifteten Gewebeabschnitte durch fluoreszenzkonfokokale Mikroskopie. Nach dem Laden der Bilder in ImageJ, umreißen Sie die Bereiche der Adeno-assoziierten infizierten mCherry-positiven Zellen und quantifizieren die Anzahl der C falsch positiven Zellen innerhalb dieses Bereichs, um die Anzahl der aktivierten Zellen pro Fläche zu erhalten. Eine wiederholte CNO-Abgabe mit Augentropfen führt zu einer robusten Induktion der cFos-Expression in den meisten infizierten Neuronen, die zeigen, dass die Wirksamkeit der CNO-Abgabe während der wiederholten Exposition aufrechterhalten wird.Darüber hinaus wird eine signifikante Induktion von cFos in Proben beobachtet, die zwei Stunden nach der CNO-Behandlung entnommen wurden, verglichen mit Proben, die sechs Stunden nach Der CNO-Exposition erhalten wurden, was darauf hindeutet, dass durch CNO induzierte Veränderungen zeitabhängig sind. Der tägliche Verbrauch von Wasser plus CNO unterscheidet sich nicht wesentlich von der Gesamtmenge des regulären Wasserverbrauchs. Ebenso wird die Menge an Wasser plus 1%Saccharose, die in der Nacht verbraucht wird, nicht durch die Zugabe von CNO beeinflusst, ebenso wenig wie Unterschiede im täglichen Verbrauch von Wasser plus CNO und Wasser plus Saccharose plus CNO, die während eines fünftägigen Versuchszeitraums beobachtet wurden.Ähnlich wie bei der Anwendung von CNO-Augentropfen wird eine robuste Induktion von cFos nach zwei, aber nicht sechs Stunden CNO-Trinkwasserzugang beobachtet. Darüber hinaus gibt es eine klare Wirksamkeitsschwelle für CNO, da eine niedrige CNO-Dosis keine cFos-Aktivierung im Vergleich zu einer Saline-Kontrolle hervorruft, während höhere Dosen eine robuste und ähnliche cFos-Induktion induzieren. Wir empfehlen, eine Dosis-Wirkungsanalyse durchzuführen, um die niedrigste CNO-Dosis zu definieren, die die neuronale Aktivierung nicht signifikant reduziert, und die Verwendung von Clozapin als Liganden zu berücksichtigen.Hier demonstrierten wir die Verwendung von CNO-vermittelter cFos-Induktion als Ergebnis der neuronalen Aktivierung. Diese Protokolle können jedoch leicht für elektrophysiologische Analysen oder Verhaltenstests übernommen werden. Die DREADD-Technologie ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Fernsteuerung neuronaler Aktivität und zur Entwicklung alternativer Strategien für die CNO-Bereitstellung.Wir werden das Spektrum der Optionen für experimentelle Einstellungen und potenzielle klinische Interventionen erweitern.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Chirurgische Implantation von Elektroden für die Neural Chronische Aufnahme Single Unit Activity und Electrocorticographic Signale

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Forschung

Neurowissenschaften

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Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

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Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

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Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Nicht-invasive Parenchymale, Gefäß- und Stoffwechselhochfrequenz-Ultraschall und Photoakustische Rat Deep Brain Imaging

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Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

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Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Chronische Transkraniellen Elektrostimulation und Intracortical Aufnahme bei Ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Nicht-invasive Modulation und Robotik-Mapping von Motor Cortex im sich entwickelnden Gehirn

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...