Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי תוכנית המחקר התוך-ציור במכון הלאומי לבריאות הנפש (ZIA MH002964-02). היינו רוצים להודות לתמיכה של הליבה התנהגותית מכרסם NIMH (ZIC MH002952).

כל החיות טופלו בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בוועדות הלאומיות של המכון הלאומי לבריאות הנפש (NIMH). כל המאמצים נעשו כדי למזער את הכאב ואת מספר החיות ששימשו.
1. adeno-הקשורים וירוס זריקות ההיפוקמפוס
הערה: סוג פראי עכברים זכרים של רקע מעורב (B6/129 F1 היב...

<ol>
	<li>Park, H. G., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Manipulation+of+Neural+Circuits.">Selective Manipulation of Neural Circuits.</a> Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).</li><li>Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+depressed+brain:+optogenetic+and+chemogenetic+circuit+interrogation+in+animal+models+of+depression.">Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression.</a> Neuropsychopharmacology. 1, (2018).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+Tools+with+Therapeutic+Utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellate+cells+drive+maturation+of+the+entorhinal-hippocampal+circuit.">Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit.</a> Science. 355 (6330), (2017).</li><li>Mahler, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+receptors+show+role+for+ventral+pallidum+input+to+ventral+tegmental+area+in+cocaine+seeking.">Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking.</a> Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).</li><li>Lichtenberg, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+Amygdala+to+Orbitofrontal+Cortex+Projections+Enable+Cue-Triggered+Reward+Expectations.">Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).</li><li>Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+stressful+procedures+as+ether+anesthesia+and+intracranial+injections+on+amino+acid+incorporation+into+brain+protein.">Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein.</a> Brain Research Bulletin. , (1977).</li><li>Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+behavioral+deficits+following+a+routine+surgical+procedure+in+rats.">Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats.</a> Brain Research. , (2007).</li><li>Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye-Drops+for+Activation+of+DREADDs.">Eye-Drops for Activation of DREADDs.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).</li><li>LeGates, T. A., Altimus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+circadian+and+acute+light+responses+in+mice+using+wheel+running+activity.">Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+hedonic+drinking+behavior+in+mice.">Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice.</a> Neuroscience. 349, 229-238 (2017).</li><li>Fernandez, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Affects+Mood+and+Learning+through+Distinct+Retina-Brain+Pathways.">Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways.</a> Cell. 175 (1), 71-84 (2018).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin&#8217;s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs):+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li><li>Urban, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+The+Behavioral+Program+and+Neuronal+Network+Encoded+by+Dorsal+Raphe+Serotonergic+Neurons.">Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons.</a> Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).</li><li>Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+of+a+designer+G+q-coupled+receptor+improves+&#946;+cell+function.">Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves &#946; cell function.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).</li><li>MacLaren, D. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+N-Oxide+Administration+Produces+Behavioral+Effects+in+Long-Evans+Rats:+Implications+for+Designing+DREADD+Experiments.">Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetics+revealed:+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine.">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li></ol>

הדרדים התפתחה כגישה פופולרית ואפקטיבית לתפעול מרחוק פעילות עצבית17. העיצוב של אסטרטגיות חלופיות עבור מסירת CNO יהיה להגדיל בהרחבה את הספקטרום של אפשרויות הזמינות עבור הגדרות נסיוניות ספציפיות. בנוסף, אסטרטגיות שאינן פולשנית עבור המסירה של CNO למזער את כל הפרשנות הפוטנציאלית של...

פיתוחים טכניים בתחום מדעי המוח אפשרו למדענים לזהות ולשלוט באופן מדויק על הפעילות של אוכלוסיות נוירואליות מסוימות1. זה תרם כדי להבין טוב יותר את הבסיס של מעגלים עצביים והשפעתם על התנהגות בעלי חיים, כמו גם, תיקון הקימו דוגמות2,3. בין הכלים הללו רומן, אלקטרואופטיקה השיטות הגנטיות כימוגנטיות היו השפעה עמוקה לא רק על איכות של תגליות, אלא גם על הדרך ניסויים הם תוכנן ועוצב4. בכתב היד הנוכחי, אנו מתמקדים אסטרטגיות כימוגנטיות עבור שליטה על הפעלת הנוירונים באמצעות הנדסה קולטן-ligand אסטרטגיות. קולטני מעצבים המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) מייצגים את אחד הכלים הפופולריים כימוגנטי השלט רחוק של פעילות עצבית, כפי שנבדקו על ידי רוט 20165. הראסטות לנצל השתנה קולטני אצטילכולין שונה מופעלים במיוחד על ידי אינרטי, clozapine N-תחמוצת (CNO)6.
רוב המחקרים משתמשים ב-CNO על ידי זריקות הצפק (כותרת), אשר שולטת ביעילות על המינון והתזמון של הפעלת קולטנים מהונדסים בצורה חריפה. עם זאת, כאשר הפעלה חוזרת או כרונית של ראסטות נדרש, השימוש בזריקות כאלה מרובות להפוך לבלתי אפשרי. כדי לענות על בעיה זו, אסטרטגיות שונות עבור משלוח cno כרונית דווחו, כולל משאבות מושתלים7 ו בתוך הצינורית בתוך הבית8,9. על הרחבות שונות, כל האסטרטגיות האלה גורמות החיות מתח וכאב10, ודורשים התערבות כירורגית כי יכול להיות גם השפעה ישירה על התגובות התנהגותיות להיבדק11. כאן, אנו מתארים שלוש אסטרטגיות לא פולשני עבור משלוח CNO כרונית.
למטרה זו, עכברים היו stereotaxically הוזרק בהיפוקמפוס עם וירוס הקשורים adeno (AAV) קידוד גרסה מהונדסים של קולטן המוסקריאית M3 (hM3Dq) כי כאשר מופעל על ידי ליגו CNO מוביל את הירי כמו פרץ של נוירונים6. בעבר הוכח כי עין טיפה אחת המכילה CNO יכול לעורר ביעילות הפעלה חזקה של מעורר הנוירונים ביטוי12. כאן אנו מתארים שיטה שונה למסירה חוזרת של טיפות עיניים. כדי להשיג שליטה כרונית ומתמשכת של קולטני מעצבים, אנחנו הבאים לתאר אסטרטגיה לא פולשנית לספק CNO לעכברים דרך מי השתייה. לבסוף, אנו מתארים פרדיגמה חלופית לאספקת CNO במים לשתייה במהלך חלון זמן מוגבל. עכברים locomotor פעילות, כמו גם התנהגות השתייה ואת הצריכה של פתרונות קלוריק מתוק, מוגבלים בעיקר לחלק האפל של מחזור אור/כהה13,14. לכן, אימצנו פרוטוקול המבוסס על העדפת העכבר על סוכרוז. על ידי מדידת אינדוקציה של המוקדם מוקדם הגן c-Fos בתאים שנדבקו aav, כבדיקה עבור הפעלה עצבית12,15, מצאנו כי אלה cno אסטרטגיות מסירה מכבש להפעיל מבוקרת ראסטות הנוירונים על המורחבת שכים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

אסטרטגיות כימוגנטיות התפתחה ככלי אמין עבור שליטה מרחוק של פעילות עצבית. בין אלה, קולטני מעצב המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) הפכו את הגישה הפופולרית ביותר כימוגנטית בשימוש במדעי המוח המודרנית. רוב המחקרים מספקים את ליגו clozapine-N-תחמוצת (CNO) באמצעות הזרקת הצפק יחיד, אשר מתאים הפעלה חריפה/עיכוב של האוכלוסייה העצבית המיועד. יש, עם זאת, רק כמה דוגמאות של אסטרטגיות עבור אפנון כרונית של נוירונים מבוקרת ראסטות, רוב אשר מסתמכים על השימוש במערכות המסירה הדורשות התערבות כירורגית. כאן, אנו להרחיב על שתי אסטרטגיות שאינן פולשני עבור אספקת ליגו CNO כדי כרוני לתמרן את האוכלוסייה העצבית בעכברים. לא ניתן להשתמש ב-CNO באמצעות טיפות עיניים חוזרות (יומיות), או באופן כרוני דרך מי השתייה של בעל החיים. אלה שאינם פולשני התוצאה הפעלה איתנה של קולטני המעצב כי התעקש במהלך טיפולים CNO. השיטות המתוארות כאן מציעות חלופות עבור שליטה מתווכת כרונית של הפעילות העצבית ועשויה להיות שימושית עבור ניסויים שנועדו להעריך את ההתנהגות בחיות נעות בחופשיות, התמקדות בשיטות מסירה פחות פולשנית של CNO.

הבחנו כי משלוח CNO חוזרים באמצעות טיפות עיניים מעורר אינדוקציה חזקה של ביטוי c-Fos בנוירונים הנגועים ביותר (איור 1C), מראה כי האפקטיביות של משלוח cno מתמשכת במהלך החשיפה חוזרים. יתר על כן, אינדוקציה משמעותית של c-Fos נצפתה דגימות שנאספו 2 h לאחר טיפול CNO, לעומת דגימות שהתקבלו 6 h לאחר ח?...

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

כאן אנו מתארים שתי שיטות שאינן פולשני לשלוט כרוניות בפעילות עצבית באמצעות כימוגנטיקה בעכברים. טיפות עיניים שימשו כדי לספק clozapine N-תחמוצת (CNO) מדי יום. אנו מתארים גם שתי שיטות לניהול ממושך של CNO ב שתיית מים. מחייב התערבות מינימלית. בהפחתת הלחץ של בעלי החיים

שאינם פולשנית אסטרטגיות עבור מניפולציה כרונית של פעילות עצבית מבוקרת של הראסטות

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDs הם הגישה הכימתוגנטית הפופולרית ביותר עבור שליטה מרחוק של פעילות עצבית. כאן אנו מציעים חלופות חדשות לבקרת DREADD חוזרת או כרונית, תוך התמקדות בשיטות אספקה פחות פולשניות של CNO. אנו מתארים שתי אסטרטגיות למסירה ממושכת של CNO בעכברים על ידי טיפות עיניים חוזרות ונשנות, או באופן כרוני דרך מי השתייה של החיה.הפרוטוקולים המתוארים כאן הם דוגמאות לאפשרויות כרוניות ולא פולשניות לאספקת CNO שניתן להתאים למגוון עיצובים ניסיוניים כולל גרסאות DREADD שונות, רקמות או אפילו מינים. נושא מפתח עבור משלוח CNO הוא מתח וכאב של בעל חיים. פרוטוקולים אלה ממזערים בעיה זו וקלים לביצוע והתאמה להגדרות ניסיוניות שונות.לפני ביצוע הניתוח, לנקות ולעקר את המסגרת הסטריאוטוקסית ואת כל המכשירים הדרושים. כאשר המסגרת מוכנה, אשר חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר זכר מסוג בר מעורב עם הרדמה, גילח את החלק העליון של הראש ותקן את ראש העכבר למסגרת. לאחר מכן להחיל חומר סיכה מגן עינית על העיניים ולבסוף, לנקות את העור החשוף עם יוד povidone רציף 70% קרצוף אתנול.השתמש אזמל סטרילי לחשוף את הגולגולת ולכייל את המסגרת לנקודת bregma. מקדחים במתאם צבאי של 2.9 מילימטרים, וקואורדינטת אחורית של מינוס 2.7 מילימטרים כדי למקד את ההיפוקמפוס. כאשר המוח נחשף, השתמש במזרק מיקרו ומשך פיפטים מיקרו-אפילריים כדי להזריק באופן חד צדדי 90 ננוליטרים של הנגיף אדנושה לתוך ההיפוקמפוס בעומק הגחון הגבי של מינוס שלושה מילימטרים.לאחר מכן לסגור את החתך עם תפרים ניילון, ולהסיר את החיה מהמסגרת עבור ניהול משכך כאבים. עבור משלוח CNO חוזר, החל מארבעה שבועות לאחר הזרקת, להתאקלם את בעלי החיים לטיפול על ידי scruffing כל עכבר שלוש דקות ביום במשך שלושה עד ארבעה ימים לפני הממשל של טיפות עיניים. כאשר העכברים התאקלמו לטיפול, לשקול כל עכבר כדי לקבוע את הכמות המתאימה של CNO להימסר כדי להשיג מיליגרם אחד של CNO לקילוגרם של ריכוז משקל הגוף.שעתיים לפני כיבוי האורות במהלך השלב הלא פעיל, העמיסו 1-3 מיקרוליטרים של פתרון CNO המוכן למיקרופיגט P10 ושתקו את העכבר באמצעות קרלינג. לאט לגרש את הפתרון עד טיפה יציבה צורות על קצה פיפטה בזהירות להביא את הטיפה קרוב הקרנית עד הפתרון מועבר מבלי לגעת קצה פיפטה לעין העכבר. ואז להחזיר את העכבר לכלוב הבית שלה לפני החלת טיפת עיניים CNO על העין של החיה הבאה.במקרים שבהם CNO צריך להיות מועבר במהלך השלב הפעיל של העכבר, להבטיח נוכחות של אור אדום עמום לטיפול נכון בבעלי חיים ומשלוח CNO. לטיפול CNO כרוני, החל מארבעה שבועות לאחר הזרקת ושלושה ימים לפני תחילת הטיפול, החלף את בקבוקי המים הרגילים בבקבוקים קטנים שנעצרו עם זרבוביות גומי ומכסים בנייר אלומיניום המכיל 10 מיליליטר מים רגילים. מאובטח לכלובים עם סרט הדבקה כדי לאפשר לעכברים להסתגל לבקבוקים.למדוד את צריכת המים היומית עבור כל עכבר, ולשקול כל עכבר. בדוק מגוון של ריכוזי CNO כדי לקבוע את המינון המציג את האפקטיביות המרבית עם ריכוז CNO מינימלי. לאחר מכן מלאו כל בקבוק קטן בשמונה מיליליטר מים רגילים בתוספת הכמות הנדרשת של CNO.לטיפול CNO מוגבל, החל מארבעה שבועות לאחר הזרקת ושלושה ימים לפני תחילת הטיפול, מניחים בקבוק קטן המכיל 10 מיליליטר מים בתוספת 1% סוכרוז על הכלוב הרחק מבקבוק המים המקורי בחלק האחרון של השלב הפעיל של החיה. בסוף החשיפה, להסיר את המים בתוספת פתרונות סוכרוז מכלוב ולמדוד את צריכת המים סוכרוז עבור כל בעל חיים. למשלוח CNO, מלאו את הבקבוקים בחמישה מיליליטר מים בתוספת 1% סוכרוז ומיליגרם אחד לקילוגרם של CNO.מניחים את הבקבוק באותה תנוחה כמו במהלך תקופת התאקלמות מי הסוכר בחלק האחרון של השלב הפעיל, מסירים את הבקבוקים ומודדים את כמות המים, הסוכרוז וה- CNO הנצרכת כפי שהוכח. בסוף הניסוי, לקצור את המוח החייתי המטופל לתוך תיקון טרי. לאחר 9 עד 12 שעות, cryoprotect רקמת המוח בתסכום סוכרוז 30%.כשהמוח שוקע, תקטע את הדגימה על קריוסטט. כאשר כל חלקי המוח הושגו והכריכה הלא ספציפית נחסמה, דגירה דגימות הרקמה עם פתרון נוגדנים נגד c-Fos בארבע מעלות צלזיוס לילה עם תסיסה מתמדת. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם שלוש שטיפות של חמש דקות PBS טרי לכל לשטוף לפני הדגירה את הדגימות עם פלואורסצנטיות מתאימה הצטייד נוגדן משני.לאחר שעה בטמפרטורת החדר ותסיסה מתמדת המוגנת מפני אור, השג תמונות דיגיטליות של מקטעי הרקמה המסומן על ידי מיקרוקרוסקופיה קונפוקנטית פלואורסצנטית. לאחר טעינת התמונות לתוך ImageJ, חלוקה לרמות למדוד את האזורים של תאים חיוביים mCherry נגוע Adeno הקשורים לכמת את מספר C תאים חיוביים כוזבים בתוך אזור זה כדי לקבל את מספר התאים הפעילים לכל אזור. משלוח CNO חוזר באמצעות טיפות עיניים מעורר אינדוקציה חזקה של ביטוי cFos ברוב הנוירונים הנגועים המוכיחים כי האפקטיביות של משלוח CNO מתמשכת במהלך החשיפה החוזרת ונשנית.יתר על כן, אינדוקציה משמעותית של cFos נצפתה בדגימות שנאספו שעתיים לאחר טיפול CNO בהשוואה לדגימות שהושגו שש שעות לאחר חשיפת CNO, מה שמצביע על כך ששינויים הנגרמים על ידי CNO תלויים בזמן. הצריכה היומית של מים בתוספת CNO אינה שונה באופן משמעותי בהשוואה לנפח הכולל של מים רגילים הנצרכים. באופן דומה, כמות המים בתוספת 1% סוכרוז הנצרכת במהלך הלילה אינה מושפעת מהתוספת של CNO, וגם לא הבדלים בצריכה היומית של מים פלוס CNO, ומים בתוספת סוכרוז בתוספת CNO שנצפו במשך תקופה ניסיונית של חמישה ימים.בדומה ליישום של טיפות עיניים CNO, אינדוקציה חזקה של cFos נצפתה לאחר שעתיים, אבל לא שש שעות של גישה למי שתייה CNO. בנוסף, יש סף ברור של יעילות עבור CNO כמו מינון CNO נמוך אינו מעורר הפעלת cFos לעומת שליטה מלוחים, ואילו מינונים גבוהים יותר לגרום אינדוקציה cFos חזק דומה. אנו ממליצים לבצע ניתוח תגובת מינון כדי להגדיר את המינון הנמוך ביותר CNO שאינו מפחית באופן משמעותי את ההפעלה העצבית, ובהתחשב בשימוש clozapine כמו ligand.כאן הדגמנו באמצעות אינדוקציה cFos מתווך CNO כתוצאה של הפעלה עצבית. עם זאת, פרוטוקולים אלה ניתן לאמץ בקלות ניתוח אלקטרופיזיולוגי או בדיקות התנהגותיות. טכנולוגיית DREADD היא כלי רב עוצמה לשליטה מרחוק בפעילות העצבית, ועיצוב אסטרטגיות חלופיות לאספקת CNO.נגדביר את קשת האפשרויות להגדרות ניסיוניות והתערבויות קליניות אפשריות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

השרשה כירורגית של אלקטרודות עצביות כרוניות להקלטת פעילות יחידה אחת אותות Electrocorticographic

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

רקמת ריאה, כלי דם וחילוף חומרים בתדר גבוהים לא פולשני אולטראסאונד וphotoacoustic עכברוש Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

הערכה לא פולשנית של שינויים בתמסורת קורטיקומוטונורונאלית בבני אדם

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

אפנון לא פולשני ומיפוי רובוטי של קליפת מנוע במוח המתפתח

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...