Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
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この研究は、国立精神衛生研究所(ZIA MH002964-02)の内部研究プログラムによって支援されました。NIMH IRPげっ歯類行動コア(ZIC MH002952)のサポートに感謝します。

全ての動物は、国立精神衛生研究所(NIMH)の動物ケア・使用委員会のガイドラインに従って取り扱われました。痛みと使用される動物の数を最小限に抑えるためにすべての努力がなされました。
1. 海馬におけるアデノ関連ウイルス注射
注:混合背景の野生型雄マウス(B6/129 F1ハイブリッド、生後3ヶ月)は、海馬にM3ムスカリン受容体(hM3Dq)をコ?...

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	<li>Park, H. G., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Manipulation+of+Neural+Circuits.">Selective Manipulation of Neural Circuits.</a> Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).</li><li>Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+depressed+brain:+optogenetic+and+chemogenetic+circuit+interrogation+in+animal+models+of+depression.">Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression.</a> Neuropsychopharmacology. 1, (2018).</li><li>Wiegert, J. 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DREADDsは、ニューロン活動を遠隔操作する一般的で効果的なアプローチとして登場しました 17.CNO 配信の代替戦略の設計は、特定の実験設定で使用できるオプションのスペクトルを大幅に増加します。さらに、CNOの配信のための非侵襲的な戦略は、動物の健康に直接影響を与えることができる有害な副作用を減らすことによって、結果の潜在的な誤解を最小限に抑えます。こ?...

神経科学の分野における技術的進歩により、科学者は特定の神経集団の活動を正確に特定し、制御することができました 1.これは、ニューロン回路の基礎と動物の行動への影響をよりよく理解するのに貢献しているだけでなく、確立されたドグマ2、3を改訂する。これらの新しいツールの中で、光遺伝学的および化学遺伝学的戦略は、発見の質だけでなく、実験が考案され、設計される方法にも大きな影響を与えました 4.本原稿では、工学的受容体リガンド戦略を用いてニューロンの活性化を制御するための化学遺伝学的戦略に焦点を当てる。デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、Roth 20165によってレビューされたニューロン活動の遠隔制御のための最も人気のある化学遺伝学的ツールの1つを表します。DREADDsは、不活性リガンド、クロザピン-N-オキシド(CNO)6によって特異的に活性化される修飾されたムスカリン性アセチルコリン受容体を利用する。
ほとんどの研究は、急性の方法でエンジニアリングされた受容体の活性化の投与量とタイミングを効果的に制御する経皮内注射(i.p.)注射によって投与されるCNOを使用します。しかし、反復的または慢性的なDREADD活性化が必要な場合、複数のi.p.注射の使用は不可能になる。この問題に対処するために、移植されたミニポンプ7および頭蓋内カニューラス8、9を含む慢性CNO送達のための異なった戦略が報告されている。異なる範囲に、これらすべての戦略は、動物のストレスおよび痛みを引き起こし、また、テストされる行動応答に直接影響を与えることができる外科的介入を必要とする11。ここでは、慢性CNO送達に対する3つの非侵襲的戦略について述述する。
この目的のために、マウスは、リガンドCNOによって活性化されると、破裂状の発射につながる興奮性M3ムスカリン受容体(hM3Dq)の工学バージョンをコードするアデノ関連ウイルス(AAV)を海馬に立体的に注入した。ニューロン6.CNOを含む単一の点眼剤が効果的にDREADD発現ニューロン12の堅牢な活性化を引き出すことができることが以前に示された。ここでは、点眼薬の反復的な送達のための改変方法について説明する。デザイナー受容体の慢性的かつ持続的な制御を達成するために、次に飲料水を介してマウスにCNOを提供する非侵襲的な戦略について説明する。最後に、制限された時間枠の間に飲料水でCNOを提供するための代替パラダイムについて説明します。マウスの運動活性は、飲酒行動および甘いカロリー溶液の消費と同様に、主に光/暗いサイクル13、14の暗い部分に制限される。そこで、スクロースに対するマウスの好みに基づくプロトコルを採用した。AAV感染細胞における即時早期遺伝子c-Fosの誘導を測定することにより、ニューロン活性化12、15の読み出しとして、これらのCNO送達戦略がDREADD制御ニューロンを長期間にわたって強く活性化することがわかった。期間。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

化学遺伝学的戦略は、神経活動の遠隔制御のための信頼性の高いツールとして登場しています。これらの中で、デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、現代の神経科学で使用される最も人気のある化学遺伝学的アプローチとなっています。ほとんどの研究は、単一の食後性注射を使用してリガンドクロザピン-N-オキシド(CNO)を提供します, これは、標的ニューロン集団の急性活性化/阻害に適しています.しかし、DREADD制御ニューロンの慢性変調のための戦略のほんの一例は、その大半は外科的介入を必要とする送達システムの使用に依存している。ここでは、ライガンドCNOを送り出してマウスの神経集団を慢性的に操作するための2つの非侵襲的な戦略について展開する。CNOは、反復的な(毎日)点眼薬を使用するか、または動物の飲料水を通して慢性的に投与した。これらの非侵襲的なパラダイムは、CNO治療全体を通じて持続するデザイナー受容体の堅牢な活性化をもたらす。ここで説明する方法は、神経活動の慢性DREADD媒介制御の代替手段を提供し、侵襲性の低いCNO送達方法に焦点を当てて、自由に動く動物の行動を評価するように設計された実験に役立つ可能性がある。

点眼薬を用いた反復的なCNO送達は、ほとんどの感染ニューロンにおけるc-Fos発現の強い誘導を引き起こし(図1C)、CNO送達の有効性が反復的暴露中に持続することを示した。さらに、CNO処理後2時間に採取した試料においてc-Fosの有意な誘導が観察され、CNO曝露後6時間で得られた試料(図1D-E)と比較して、CNOによって誘導される変化が時間依存であることを実証し?...

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Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

ここでは、マウスの化学遺伝学を用いて神経活動を慢性的に制御する2つの非侵襲的方法について説明する。点眼剤は、クロザピン-N-酸化物(CNO)を毎日提供するために使用されました。また、飲料水中のCNOの長期投与のための2つの方法についても述べた。慢性神経制御のためのこれらの戦略は、動物のストレスを軽減する最小限の介入を必要とします。

DREADD制御神経活動の慢性操作に対する非侵襲的戦略

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDsは、神経活動の遠隔制御のための最も人気のある化学遺伝学的アプローチです。ここでは、より低侵襲のCNO送達方法に焦点を当てて、反復または慢性DREADD制御のための新しい選択肢を提供します。我々は、マウスにおける反復点眼薬による、または動物の飲料水を介して慢性的に長期にわたるCNO送達のための2つの戦略を説明する。ここで説明するプロトコルは、異なるDREADD変異体、組織、あるいは種を含む様々な実験設計に適応することができるCNO送達のための慢性的および非侵襲的なオプションの例である。CNOの出産のための重要な問題は、動物のストレスと痛みです。これらのプロトコルは、この問題を最小限に抑え、さまざまな実験設定に簡単に適応できます。手術を行う前に、ステレオタックスフレームと必要なすべての器具を清潔にして滅菌してください。フレームの準備ができたら、麻酔された混合背景野生型雄マウスでつまみつまみへの応答の欠如を確認し、頭の上を剃り、フレームにマウスの頭を固定します。次に眼保護潤滑剤を眼に塗布し、最後に、露出した皮膚をシーケンシャルなポビドンヨウ素と70%エタノールスクラブで洗浄します。滅菌メスを使用して頭蓋骨を露出させ、フレームをブレグマポイントにキャリブレーションします。2.9ミリメートルの内側座標でドリルし、海馬を標的にするためにマイナス2.7ミリメートルの前後方座標で掘削します。脳が露出したら、マイクロインジェクターを使用し、マイクロキャピラリーピペットを引っ張って、過誤関連ウイルスの90ナノリットルをマイナス3ミリメートルの下側腹側深さで海馬に一方的に注入する。次いでナイロン縫合糸で切開を閉じ、鎮痛投与用のフレームから動物を取り除く。反復的なCNO送達のために、注射後4週間開始、各マウスを眼球の投与の3〜4日間毎日3分をスクラフすることによって取り扱いに動物を順応させる。マウスが取り扱いに慣れてきたら、各マウスの重量を量って、体重濃度の1キログラム当たり1ミリグラムのCNOを達成するために送達されるCNOの適切な量を決定する。不活性段階で消灯する2時間前に、調製したCNO溶液の1~3マイクロリットルをP10マイクロピペットにロードし、スクラッフィンを介してマウスを固定化します。ピペットチップに安定した液滴が形成されるまでゆっくりと溶液を排出し、ピペットチップに触れることなく溶液が送達されるまで慎重に液滴を角膜に近づけます。次に、マウスをホームケージに戻してから、次の動物の目にCNOのスポイトを塗布します。マウスの活性段階でCNOを送達する必要がある場合は、適切な動物の取り扱いとCNOの送達のために薄暗い赤色光の存在を確認してください。慢性CNO治療の場合、注射後4週間、治療開始3日前に、通常の水筒をゴムスパウトで止め、通常の水10ミリリットルを含むアルミニウム箔で覆った小さなボトルに交換してください。マウスがボトルに順応できるようにテープでケージに固定します。各マウスの毎日の水消費量を測定し、各マウスの重量を量ります。CNO濃度の範囲をテストして、最小のCNO濃度で最大の効果を表示する用量を決定します。その後、各小さなボトルに8ミリリットルの通常の水と必要な量のCNOを充填します。制限付きCNO治療の場合、注射後4週間、治療開始の3日前に、動物の活動期の最後の部分で、10ミリリットルの水と1%スクロースを含む小さなボトルをケージに置きます。露光の終わりに、各ケージから水とスクロース溶液を取り除き、各動物のスクロース水消費量を測定します。CNOの配達のために、5ミリリットルの水に加えて1%スクロースとCNOのキログラムあたり1ミリグラムでボトルを満たします。活性相の最後の部分の間に砂糖水の順応期間中と同じ位置にボトルを置き、ボトルを取り除き、実証したように水、スクロースおよびCNOの消費量を測定する。実験の終わりに、処理された動物の脳を新鮮な固定剤に収穫する。9~12時間後、30%スクロース溶液で脳組織を凍結保護する。脳が沈んだら、クライオスタットのサンプルを切り離します。すべての脳切片が得られ、非特異的結合がブロックされたら、一定の攪拌で一晩摂氏4度で抗c-Fos抗体溶液で組織サンプルをインキュベートする。翌朝、適切な蛍光共役二次抗体でサンプルをインキュベートする前に、洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の5分間の洗浄でサンプルを洗浄します。光から保護された室温および一定の撹拌で1時間後、蛍光共焦点顕微鏡により標識された組織切片のデジタル画像を得る。ImageJに画像をロードした後、アデノ関連感染したmCherry陽性細胞の領域を測定し、この領域内のC偽陽性細胞の数を定量化して、領域あたりの活性化細胞数を得る。点眼薬を用いた反復的CNO送達は、ほとんどの感染ニューロンにおけるcFos発現の強い誘導を引き起こす。さらに、CNO照射後6時間で得られたサンプルと比較して、CNO処理の2時間後に採取したサンプルにおいてcFosの有意な誘導が観察され、CNOによって誘発される変化が時間依存であることを示す。水とCNOの毎日の消費量は、通常の水の総量と比較して有意に異なっていません。同様に、夜間に消費される水の量に1%のスクロースを加えた量は、CNOの添加によって影響を受けず、また、水とCNOの両方の毎日の消費の違いはなく、水プラススクロースとCNOの5日間の実験期間にわたって観察された。CNO点眼薬の適用と同様に、cFosの堅牢な誘導は2時間後に観察されるが、CNO飲料水へのアクセスの6時間は観察されない。さらに、CNOの有効性の明確な閾値は、低いCNO用量が生理食類対照と比較してcFos活性化を引き起こすのではなく、より高い用量は堅牢で類似したcFos誘導を誘発する。ニューロンの活性化を有意に低下させない最も低いCNO用量を定義するために用量応答分析を行い、リガンドとしてクロザピンを使用することを検討することをお勧めします。ここでは、ニューロン活性化の結果としてCNO媒介cFos誘導を用いて実証した。しかし、これらのプロトコルは、電気生理学的解析や行動試験に容易に採用することができる。DREADD技術は、ニューロン活動の遠隔制御、およびCNO配信のための代替戦略を設計するための強力なツールです。実験的な設定と潜在的な臨床介入のためのオプションのスペクトルを増やします。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

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Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

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Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

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Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

慢性的な経頭蓋電気刺激およびラットの皮質内の記録

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

発達中の脳における運動皮質の非侵襲的変調とロボットマッピング

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