Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av intramural forskningsprogram ved nasjonalt Institutt for psykisk helse (ZIA MH002964-02). Vi vil gjerne takke støtte fra NIMH IRP gnagere Behavioral Core (ZIC MH002952).

Alle dyrene var håndterte i overensstemmelse med retningslinjene av det dyr bekymre og bruk komiteer av det nasjonal off av mental sunnhet (NIMH). Alle anstrengelser var innrettet til minimere lidelsen og antallet av dyrene anvendt.
1. Adeno-assosiert virus injeksjoner i hippocampus
Merk: Wild type mannlige mus av blandet bakgrunn (B6/129 F1 hybrid, 3 måneder gammel) var for stereotaktiskt injisert med en AAV koding M3 muskarine reseptor (hM3Dq) i h...

<ol>
	<li>Park, H. G., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Manipulation+of+Neural+Circuits.">Selective Manipulation of Neural Circuits.</a> Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).</li><li>Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+depressed+brain:+optogenetic+and+chemogenetic+circuit+interrogation+in+animal+models+of+depression.">Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression.</a> Neuropsychopharmacology. 1, (2018).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+Tools+with+Therapeutic+Utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellate+cells+drive+maturation+of+the+entorhinal-hippocampal+circuit.">Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit.</a> Science. 355 (6330), (2017).</li><li>Mahler, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+receptors+show+role+for+ventral+pallidum+input+to+ventral+tegmental+area+in+cocaine+seeking.">Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking.</a> Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).</li><li>Lichtenberg, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+Amygdala+to+Orbitofrontal+Cortex+Projections+Enable+Cue-Triggered+Reward+Expectations.">Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).</li><li>Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+stressful+procedures+as+ether+anesthesia+and+intracranial+injections+on+amino+acid+incorporation+into+brain+protein.">Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein.</a> Brain Research Bulletin. , (1977).</li><li>Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+behavioral+deficits+following+a+routine+surgical+procedure+in+rats.">Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats.</a> Brain Research. , (2007).</li><li>Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye-Drops+for+Activation+of+DREADDs.">Eye-Drops for Activation of DREADDs.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).</li><li>LeGates, T. A., Altimus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+circadian+and+acute+light+responses+in+mice+using+wheel+running+activity.">Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+hedonic+drinking+behavior+in+mice.">Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice.</a> Neuroscience. 349, 229-238 (2017).</li><li>Fernandez, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Affects+Mood+and+Learning+through+Distinct+Retina-Brain+Pathways.">Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways.</a> Cell. 175 (1), 71-84 (2018).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin&#8217;s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs):+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li><li>Urban, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+The+Behavioral+Program+and+Neuronal+Network+Encoded+by+Dorsal+Raphe+Serotonergic+Neurons.">Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons.</a> Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).</li><li>Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+of+a+designer+G+q-coupled+receptor+improves+&#946;+cell+function.">Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves &#946; cell function.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).</li><li>MacLaren, D. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+N-Oxide+Administration+Produces+Behavioral+Effects+in+Long-Evans+Rats:+Implications+for+Designing+DREADD+Experiments.">Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetics+revealed:+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine.">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li></ol>

DREADDs har dukket opp som en populær og effektiv tilnærming til eksternt manipulere neuronal aktivitet17. Utformingen av alternative strategier for CNO levering vil bredt øke spekteret av tilgjengelige alternativer for spesifikke eksperimentelle innstillinger. I tillegg ikke-invasiv strategier for levering av CNO minimere eventuelle feil tolkning av resultatene ved å redusere ugunstige bivirkninger som kan direkte påvirke dyrets helse. Her har vi beskrevet to ikke-invasiv strategier for CNO ...

Tekniske fremskritt innen nevrovitenskap har tillatt forskerne å presist identifisere og kontrollere aktiviteten til bestemte neuronal populasjoner1. Dette har bidratt til å bedre forstå grunnlaget for neuronal kretser og deres innvirkning på dyr atferd, samt revidere etablerte dogmer2,3. Blant disse romanen verktøy, optogenetic og chemogenetic strategier har hatt en dyp innvirkning ikke bare på kvaliteten av funn, men også på vei eksperimenter er unnfanget og designet4. I dagens manuskript fokuserer vi på chemogenetic strategier for å kontrollere aktiveringen av neurons via konstruerte reseptor-ligand strategier. Designer reseptorer utelukkende aktiveres av designer narkotika (DREADDs) representerer en av de mest populære chemogenetic verktøy for fjernkontroll av neuronal aktivitet, som gjennomgått av Roth 20165. DREADDs utnytte modifiserte muskarine acetylkolin reseptorer som er spesielt aktivert av en inert ligand, Clozapine-N-oksid (CNO)6.
De fleste studier bruker CNO administreres av intraperitoneal (IP) injeksjoner, som effektivt styrer dosering og timing av konstruerte reseptorer aktivering i en akutt måte. Imidlertid, når repeterende eller kronisk DREADD aktivisering er krevde, bruken av mangfoldig IP injeksjoner bli unfeasible. For å løse dette problemet, har ulike strategier for kronisk CNO levering er rapportert, inkludert implantert minipumps7 ogintrakraniell kanyler. Til ulike utvidelser, alle disse strategiene føre til at dyrene stress og smerte10, og krever en kirurgisk inngrep som kan også ha en direkte innvirkning på atferdsdata tiltak for å bli testet11. Her beskriver vi tre ikke-invasiv strategier for kronisk CNO levering.
For dette formålet, mus ble stereotaktiskt injisert i hippocampus med en adeno-assosiert virus (AAV) koding en utviklet versjon av eksitatoriske M3 muskarine reseptor (hM3Dq) at når den aktiveres av ligand CNO fører til burst-like avfyring av neurons6. Det ble tidligere vist at en enkelt øye-drop som inneholder CNO kan effektivt lokke fram en robust aktivering av DREADD-uttrykker neurons12. Her beskriver vi en modifisert metode for repeterende levering av øyedråper. For å oppnå kroniske og vedvarende kontroll av designeren reseptorer, vi neste beskriver en ikke-invasiv strategi for å levere CNO til mus gjennom drikkevannet. Til slutt beskriver vi et alternativ paradigme for å levere CNO i drikkevann i et begrenset tidsrom vindu. Mus Locomotor aktivitet, samt drikking atferd og inntak av Sweet kalori løsninger, er stort sett begrenset til den mørke delen av lys/mørk syklus13,14. Derfor vedtok vi en protokoll basert på musen preferanse for sukrose. Ved å måle induksjon av det umiddelbare genet c-Fos i AAV-infiserte celler, som en avlesning for neuronal aktivering12,15, fant vi ut at disse CNO leverings strategier robust aktivere DREADD-kontrollerte neurons over Extended Varigheter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

Chemogenetic strategier har dukket opp som pålitelige verktøy for fjernkontroll av neuronal aktivitet. Blant disse, designer reseptorer utelukkende aktiveres av designer narkotika (DREADDs) har blitt den mest populære chemogenetic tilnærming som brukes i moderne nevrovitenskap. De fleste studier leverer ligand Clozapine-N-oksid (CNO) ved hjelp av en enkelt intraperitoneal injeksjon, som er egnet for akutt aktivering/hemming av den målrettede neuronal befolkningen. Det er imidlertid bare noen få eksempler på strategier for kronisk modulering av DREADD-kontrollerte neurons, de fleste som er avhengige av bruk av leveringssystemer som krever kirurgisk inngrep. Her utvider vi på to ikke-invasiv strategier for å levere ligand CNO å kronisk manipulere neural befolkningen i mus. CNO ble administrert enten ved hjelp av repeterende (daglig) øyedråper, eller kronisk gjennom dyrets drikkevann. Disse ikke-invasiv paradigmer resultere i robust aktivering av designer reseptorer som holdt gjennom CNO behandlinger. Metodene som er beskrevet her tilbyr alternativer for kronisk DREADD-mediert kontroll av neuronal aktivitet og kan være nyttig for eksperimenter utformet for å evaluere atferd i fritt bevegelige dyr, med fokus på mindre invasive CNO leveringsmetoder.

Vi observerte at repeterende CNO-levering ved hjelp av øyedråper elicited en robust induksjon av c-Fos-uttrykk i de fleste infiserte neurons (figur 1C), som viser at effektiviteten av CNO-leveringen opprettholdes under gjentatt eksponering. Videre ble det observert en signifikant induksjon av c-Fos i prøver som ble samlet inn 2 timer etter CNO behandling, sammenlignet med prøver som fikk 6 timer etter CNO eksponering (figur 1d-E), noe som viser at endringer indusert av C...

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Her beskriver vi to ikke-invasive metoder for å kronisk kontrollere neuronal aktivitet ved hjelp av chemogenetics i mus. Eye-DROPS ble brukt til å levere Clozapine-N-oksid (CNO) daglig. Vi beskriver også to metoder for langvarig administrering av CNO i drikkevann. Disse strategiene for kronisk neuronal kontroll krever minimalt inngrep redusere dyrs stress.

Ikke-invasiv strategier for kronisk manipulering av DREADD-kontrollerte neuronal aktivitet

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDs er den mest populære chemogenetic tilnærming for fjernstyring av nevronal aktivitet. Her tilbyr vi nye alternativer for repeterende eller kronisk DREADD-kontroll, med fokus på mindre invasive CNO-leveringsmetoder. Vi beskriver to strategier for langvarig CNO-levering hos mus ved repeterende øyedråper, eller kronisk gjennom dyrets drikkevann.Protokollene som er beskrevet her er eksempler på kroniske og ikke-invasive alternativer for CNO-levering som kan tilpasses en rekke eksperimentelle design, inkludert forskjellige DREADD-varianter, vev eller til og med arter. Et sentralt problem for en CNO levering er et dyrs stress og smerte. Disse protokollene minimerer dette problemet og er enkle å utføre og tilpasse seg forskjellige eksperimentelle innstillinger.Før operasjonen utfører operasjonen, rengjør og steriliser stereotoksisk ramme og alle nødvendige instrumenter. Når rammen er klar, bekrefter du mangel på respons på tåklemme i en bedøvet blandet bakgrunn vill type mannlig mus, barbere toppen av hodet, og fest musens hode til rammen. Påfør deretter okulært beskyttende smøremiddel på øynene og til slutt, rengjør den eksponerte huden med sekvensiell povidonjod og 70% etanolskrubb.Bruk en steril skalpell for å eksponere skallen og kalibrere rammen til bregmapunktet. Bor ved en medialateral koordinat på 2,9 millimeter, og en fremre bakre koordinat på minus 2,7 millimeter for å målrette hippocampus. Når hjernen blir utsatt, bruk en mikroinjektor og trukket mikrokapillærpipetter for å ensidig injisere 90 nanoliter av det adenoassociated viruset i hippocampus på en dorsal ventral dybde på minus tre millimeter.Lukk deretter snittet med nylonsuturer, og fjern dyret fra rammen for analgesiadministrasjon. For repeterende CNO levering, begynner fire uker etter injeksjon, akklimatisere dyrene til håndtering ved å scruffing hver mus tre minutter daglig i tre til fire dager før administrering av øyedråpene. Når musene har blitt akklimatisert til håndtering, veie hver mus for å bestemme riktig mengde CNO som skal leveres for å oppnå en ett mg CNO per kilo kroppsvekt konsentrasjon.To timer før lysene slås av i den inaktive fasen, laster du en til tre mikroliter av den tilberedte CNO-løsningen inn i en P10-mikropipette og immobiliserer musen via scruffing. Utvis sakte løsningen til en stabil dråpe dannes på pipettespissen og ta forsiktig dråpen nær hornhinnen til løsningen leveres uten å berøre pipettespissen til musens øye. Deretter returnerer du musen til sitt hjem bur før du bruker CNO øyedråpen til øyet til neste dyr.I tilfeller der CNO må leveres i den aktive musefasen, må du sørge for at det er et svakt rødt lys for riktig dyrehåndtering og CNO-levering. For kronisk CNO-behandling, som begynner fire uker etter injeksjon og tre dager før behandlingen startes, erstatter du de vanlige vannflaskene med små flasker stoppet med gummituter og dekket med aluminiumsfolie som inneholder 10 milliliter vanlig vann. Fest til burene med tape for å tillate mus å akklimatisere seg til flaskene.Mål det daglige vannforbruket for hver mus, og vei hver mus. Test en rekke CNO-konsentrasjoner for å bestemme dosen som viser maksimal effektivitet med den minimale CNO-konsentrasjonen. Fyll deretter hver lille flaske med åtte milliliter vanlig vann pluss den nødvendige mengden CNO.For begrenset CNO-behandling, som begynner fire uker etter injeksjon og tre dager før behandlingen startes, plasserer du en liten flaske som inneholder 10 milliliter vann pluss 1% sukrose på buret vekk fra den opprinnelige vannflasken under den siste delen av dyrets aktive fase. På slutten av eksponeringen fjerner du vann pluss sukroseløsninger fra hvert bur og måler sukrosevannforbruket for hvert dyr. For CNO levering, fyll flaskene med fem milliliter vann pluss 1% sukrose og ett mg per kilo CNO.Plasser flasken i samme posisjon som i akklimatiseringsperioden for sukkervann i den siste delen av den aktive fasen, fjern flaskene og måle mengden vann, sukrose og CNO som forbrukes som vist. På slutten av eksperimentet høster den behandlede dyrehjernen inn i frisk fikseringsmiddel. Etter 9 til 12 timer, kryobeskytte hjernevevet i en 30% sukrose løsning.Når hjernen synker, del prøven på en kryostat. Når alle hjerneseksjonene er oppnådd og den uspesifikke bindingen er blokkert, inkubere vevsprøvene med en anti-c-Fos antistoffløsning ved fire grader Celsius over natten med konstant agitasjon. Neste morgen vask prøvene med tre fem minutters vasker i fersk PBS per vask før du inkuberer prøvene med et passende fluorescenskonjugert sekundært antistoff.Etter en time ved romtemperatur og konstant agitasjon beskyttet mot lys, få digitale bilder av de merkede vevsseksjonene ved fluorescenskonokal mikroskopi. Etter lasting av bildene i ImageJ, skissere på måle områdene av Adeno-tilknyttede infiserte mCherry positive celler og kvantifisere antall C falske positive celler i dette området for å få antall aktiverte celler per område. Repeterende CNO-levering ved hjelp av øyedråper fremkaller en robust induksjon av cFos-uttrykk i de fleste infiserte nevroner som viser at effektiviteten av CNO-levering opprettholdes under den repeterende eksponeringen.Videre observeres en signifikant induksjon av cFos i prøver som samles inn to timer etter CNO-behandling sammenlignet med prøver oppnådd seks timer etter CNO-eksponering, noe som indikerer at endringer indusert av CNO er tidsavhengige. Det daglige forbruket av vann pluss CNO er ikke signifikant forskjellig i forhold til det totale volumet av vanlig vann som forbrukes. Tilsvarende påvirkes ikke mengden vann pluss 1% sukrose som forbrukes om natten av tilsetning av CNO, og det er heller ikke forskjeller i det daglige forbruket av både vann pluss CNO, og vann pluss sukrose pluss CNO observert over en fem-dagers eksperimentell periode.I likhet med anvendelsen av CNO-øyedråper observeres en robust induksjon av cFos etter to, men ikke seks timer med CNO drikkevannstilgang. I tillegg er det en klar terskel for effektivitet for CNO som en lav CNO dose ikke fremkalle cFos aktivering sammenlignet med en saltvannskontroll, mens høyere doser indusere en robust og lignende cFos induksjon. Vi anbefaler at du utfører en doseresponsanalyse for å definere den laveste CNO-dosen som ikke reduserer nevronal aktivering betydelig, og vurderer bruk av klozapin som en ligand.Her demonstrerte vi ved hjelp av CNO-mediert cFos induksjon som følge av nevronal aktivering. Imidlertid kan disse protokollen lett vedtas til elektrofysiologiske analyser eller atferdstester. DREADD-teknologi er et kraftig verktøy for fjernstyring av nevronal aktivitet, og design av alternative strategier for CNO-levering.Vi vil øke spekteret av alternativer for eksperimentelle innstillinger og potensielle kliniske intervensjoner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Kirurgisk Implantasjon av kroniske Neural Elektroder for innspilling med enkel enhet Aktivitet og Electrocorticographic Signaler

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Electroencephalography, Real-time Måling av laktat Konsentrasjon og Optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em&gt; Å studere nevrale morfologi og migrasjon

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducing Plasticity av astrocytic Reseptorer av Manipulering av nevronal utløsning priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Non-invasiv Parenkymalt, Vaskulær og metabolske Høyfrekvente Ultralyd og Foto-akustisk Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

Ikke-invasiv vurdering av endringer i kortikomotonuronal overføring hos mennesker

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Ekstracellulære opptak av neuronal aktivitet kombinert med Microiontophoretic Bruk av neuroaktive stoffer i Awake Mus

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Opptak Temperatur-indusert neuronal aktivitet gjennom Overvåking Kalsium endringer i luktelappen av<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk Transkraniell elektrisk stimulering og Intracortical opptak i rotter

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Ikke-invasiv modulering og Robotic kartlegging av motor cortex i utviklingsland Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...