Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo programa de pesquisa intramural do Instituto Nacional de saúde mental (ZIA MH002964-02). Gostaríamos de agradecer o apoio do núcleo comportamental de roedores NIMH IRP (ZIC MH002952).

Todos os animais foram manuseados de acordo com as diretrizes dos comitês de cuidado e uso do animal do Instituto Nacional de saúde mental (NIMH). Todos os esforços foram feitos para minimizar a dor e o número de animais utilizados.
1. injeções de vírus associadas ao adeno no hipocampo
Nota: O tipo selvagem ratos masculinos do fundo misturado (híbrido B6/129 F1, 3 meses velho) era para injetado estereotaxicamente com um AAV que codifica o rece...

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DREADDs surgiram como uma abordagem popular e eficaz para manipular remotamente a atividade neuronal17. O projeto de estratégias alternativas para a entrega CNO aumentará amplamente o espectro de opções disponíveis para configurações experimentais específicas. Além disso, estratégias não invasivas para a entrega da CNO minimizam qualquer potencial interpretação errónea dos resultados, reduzindo os efeitos colaterais adversos que podem impactar diretamente a saúde do animal. Aqui, n?...

Os avanços técnicos no campo da neurociência permitiram aos cientistas identificar e controlar com precisão a atividade de populações neuronais particulares1. Isso contribuiu para melhor compreender a base dos circuitos neuronais e seu impacto no comportamento animal, bem como, revisando dogmas estabelecidos2,3. Entre essas novas ferramentas, as estratégias optogenéticas e quimiogenéticas tiveram um impacto profundo não só na qualidade das descobertas, mas também na forma como os experimentos são concebidos e projetados4. No presente manuscrito, focamos em estratégias quimiogenéticas para o controle da ativação de neurônios por meio de estratégias de receptores-ligantes projetados. Os receptores do desenhador ativados exclusivamente por drogas do desenhador (DREADDs) representam uma das ferramentas chemogenetic as mais populares para o controle remoto da atividade neuronal, como revisto por Roth 20165. DREADDs utilizam receptores de acetilcolina muscarínicos modificados que são especificamente ativados por um ligand inerte, Clozapine-N-óxido (CNO)6.
A maioria dos estudos utiliza o CNO administrado por injeções intraperitoneal (i.p.), que efetivamente controla a dosagem e o tempo de ativação de receptores projetados de forma aguda. No entanto, quando a ativação de DREADD repetitiva ou crônica é necessária, o uso de múltiplas injeções i.p. se torna inviável. Para abordar esse problema, foram relatadas diferentes estratégias para o parto crônico de CNO, incluindo os minipumps implantados7 e as cânulas intracranianas8,9. Para diferentes extensões, todas essas estratégias causam o estresse e a dor dos animais10, e necessitam de uma intervenção cirúrgica que também possa ter um impacto direto nas respostas comportamentais a serem testadas11. Aqui, nós descrevemos três estratégias não invasoras para a entrega crônica de CNO.
Para esta finalidade, os ratos foram injetados estereotaxicamente no hipocampo com um vírus adeno-associado (AAV) que codifica uma versão projetada do receptor muscarínicos do excitatórios m3 (hM3Dq) que quando ativado pelo ligante CNO conduz à explosão-como o acendimento de neurônios6. Mostrou-se anteriormente que um único olho-gota contendo CNO pode efetivamente provocar uma ativação robusta de DREADD-expressando neurônios12. Aqui nós descrevemos um método modificado para a entrega repetitiva de gotas de olho. Para alcançar o controle crônico e sustentado dos receptores do desenhador, nós descrevemos em seguida uma estratégia não invasora para entregar CNO aos ratos através da água bebendo. Finalmente, nós descrevemos um paradigma alternativo para entregar CNO na água bebendo durante uma janela restrita do tempo. A atividade locomotora de camundongos, bem como o comportamento de beber e o consumo de soluções calórica doces, são, na sua maioria, restritas à porção escura do ciclo claro/escuro13,14. Por isso, adotou-se um protocolo baseado na preferência do camundongo pela sacarose. Medindo a indução do gene imediato-cedo c-fos em pilhas AAV-infectadas, como um leitura para a ativação neuronal12,15, nós encontramos que estas estratégias da entrega de CNO robustamente ativam neurônios dreadd-controlados sobre prolongado Durações.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

Estratégias quimiogenéticas surgiram como ferramentas confiáveis para o controle remoto da atividade neuronal. Entre estes, os receptores do desenhador ativados exclusivamente por drogas do desenhador (DREADDs) tornaram-se a aproximação chemogenetic a mais popular usada na neurociência moderna. A maioria de estudos entregam o ligante Clozapine-N-óxido (CNO) usando uma única injeção intraperitoneal, que seja apropriada para a ativação/inibição aguda da população neuronal alvejada. Há, no entanto, apenas alguns exemplos de estratégias para a modulação crônica de neurônios controlados por DREADD, a maioria dos quais dependem do uso de sistemas de parto que necessitam de intervenção cirúrgica. Aqui, nós expandimos em duas estratégias não invasoras para entregar o ligante CNO para manipular cronicamente a população neural nos ratos. O CNO foi administrado por meio de gotas oculares repetitivas (diárias), ou cronicamente através da água potável do animal. Estes paradigmas não invasivos resultam em uma ativação robusta dos receptores de designers que persistiram ao longo dos tratamentos CNO. Os métodos descritos aqui oferecem alternativas para o controle crônico de atividade neuronal de DREADD-negociado e podem ser úteis para experimentos projetados para avaliar o comportamento em animais em movimento livre, com foco em métodos de entrega de CNO menos invasivos.

Observou-se que a entrega repetitiva de CNO utilizando colírio provocou uma indução robusta da expressão de c-fos na maioria dos neurônios infectados (Figura 1C), demonstrando que a efetividade da entrega de CNO é sustentada durante a exposição repetitiva. Além disso, uma indução significativa de c-fos foi observada em amostras coletadas 2 h após o tratamento com CNO, em comparação com as amostras obtidas 6 h após a exposição à CNO (figuras 1D-E), demonstra...

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Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Aqui nós descrevemos dois métodos não-invasores para controlar cronicamente a atividade neuronal usando a quimiogenética nos ratos. Os Eye-gotas foram usados para entregar o Clozapine-N-óxido (CNO) diário. Nós igualmente descrevemos dois métodos para a Administração prolongada de CNO na água bebendo. Estas estratégias para o controle neuronal crônico exigem a intervenção mínima que reduz o stress dos animais.

Estratégias não invasivas para manipulação crônica da atividade neuronal controlada por DREADD

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDs são a abordagem quimiógena mais popular para controle remoto da atividade neuronal. Aqui oferecemos novas alternativas para controle dreadd repetitivo ou crônico, com foco em métodos de entrega CNO menos invasivos. Descrevemos duas estratégias para a entrega prolongada de CNO em camundongos por colírios repetitivos, ou cronicamente através da água potável do animal.Os protocolos descritos aqui são exemplos de opções crônicas e não invasivas para a entrega de CNO que podem ser adaptadas a uma variedade de desenhos experimentais, incluindo diferentes variantes dreadd, tecidos ou mesmo espécies. Uma questão fundamental para um parto de CNO é o estresse e a dor de um animal. Esses protocolos minimizam esse problema e são fáceis de executar e se adaptar a diferentes configurações experimentais.Antes de realizar a cirurgia, limpe e esterilize o quadro estereotax e todos os instrumentos necessários. Quando o quadro estiver pronto, confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do dedo em um rato macho tipo macho de fundo misto anestesiado, raspar a parte superior da cabeça e fixar a cabeça do mouse no quadro. Em seguida, aplique lubrificante protetor ocular nos olhos e, finalmente, limpe a pele exposta com iodo povidone sequencial e esfoliantes de 70% de etanol.Use um bisturi estéril para expor o crânio e calibrar a estrutura até o ponto de bregma. Perfurar em uma coordenada mediallateral de 2,9 milímetros, e uma coordenada posterior anterior de menos 2,7 milímetros para atingir o hipocampo. Quando o cérebro for exposto, use um micro injetor e puxe pipetas microcapilares para injetar unilateralmente 90 nanoliters do vírus adenoassociado no hipocampo a uma profundidade ventral dorsal de menos três milímetros.Em seguida, feche a incisão com suturas de nylon, e remova o animal da moldura para administração de analgesia. Para a entrega repetitiva de CNO, a partir de quatro semanas após a injeção, aclimatar os animais ao manuseio, esmagando cada rato três minutos por dia durante três a quatro dias antes da administração dos colírios. Quando os camundongos se acostumarem com o manuseio, pese cada rato para determinar a quantidade apropriada de CNO a ser entregue para alcançar um miligrama de CNO por quilograma de concentração de peso corporal.Duas horas antes de apagar as luzes durante a fase inativa, carregue de um a três microlitadores da solução CNO preparada em uma micropipette P10 e imobilize o mouse através de scruffing. Expela lentamente a solução até que uma gota estável se forme na ponta da pipeta e leve cuidadosamente a gota perto da córnea até que a solução seja entregue sem tocar na ponta da pipeta no olho do mouse. Em seguida, devolva o rato para sua gaiola doméstica antes de aplicar o colírio CNO aos olhos do próximo animal.Nos casos em que o CNO precisa ser entregue durante a fase ativa do mouse, certifique-se da presença de uma luz vermelha fraca para o manuseio adequado de animais e a entrega de CNO. Para o tratamento crônico de CNO, começando quatro semanas após a injeção e três dias antes de iniciar o tratamento, substitua as garrafas de água regulares por garrafas pequenas paradas com bicos de borracha e cobertas com papel alumínio contendo 10 mililitros de água regular. Fixar nas gaiolas com fita adesiva para permitir que os ratos se aclimatar às garrafas.Meça o consumo diário de água para cada rato e pese cada rato. Teste uma série de concentrações de CNO para determinar a dose que exibe a eficácia máxima com a concentração mínima de CNO. Em seguida, encha cada pequena garrafa com oito mililitros de água regular mais a quantidade necessária de CNO.Para tratamento CNO restrito, começando quatro semanas após a injeção e três dias antes de iniciar o tratamento, coloque uma pequena garrafa contendo 10 mililitros de água mais 1% de sacarose na gaiola longe da garrafa de água original durante a última porção da fase ativa do animal. Ao final da exposição, remova a água mais as soluções de sacarose de cada gaiola e meça o consumo de água de sacarose para cada animal. Para entrega CNO, encha as garrafas com cinco mililitros de água mais 1% de sacarose e um miligrama por quilograma de CNO.Coloque a garrafa na mesma posição do período de aclimatação da água açucarada durante a última porção da fase ativa, removendo as garrafas e medindo a quantidade de água, sacarose e CNO consumida conforme demonstrado. No final do experimento, colhia o cérebro animal tratado em fixação fresca. Após 9 a 12 horas, crioprotetor o tecido cerebral em uma solução de 30% de sacarose.Quando o cérebro afundar, sele a amostra em um criostat. Quando todas as seções cerebrais tiverem sido obtidas e a ligação inespecífica bloqueada, incubar as amostras de tecido com uma solução de anticorpos anti-c-Fos a quatro graus Celsius durante a noite com agitação constante. Na manhã seguinte, lave as amostras com três lavagens de cinco minutos em PBS fresco por lavagem antes de incubar as amostras com um anticorpo secundário conjugado fluorescência apropriado.Após uma hora em temperatura ambiente e agitação constante protegida da luz, obtenha imagens digitais das seções de tecido rotulados por microcroscopia confocal de fluorescência. Depois de carregar as imagens no ImageJ, delineie medir as áreas de células positivas infectadas por Adeno e quantificar o número de células C falsas positivas nesta região para obter o número de células ativadas por área. A entrega repetitiva de CNO usando colírios provoca uma indução robusta da expressão de cFos na maioria dos neurônios infectados demonstrando que a eficácia do parto de CNO é sustentada durante a exposição repetitiva.Além disso, observa-se uma indução significativa de cFos em amostras coletadas duas horas após o tratamento com CNO em comparação com amostras obtidas seis horas após a exposição ao CNO, indicando que as alterações induzidas pelo CNO são dependentes do tempo. O consumo diário de água mais CNO não é significativamente diferente em relação ao volume total de água consumida regularmente. Da mesma forma, a quantidade de água mais 1% de sacarose consumida durante a noite não é afetada pela adição de CNO, nem diferenças no consumo diário de água mais CNO, e água mais sacarose mais CNO observada durante um período experimental de cinco dias.Semelhante à aplicação de colírios CNO, uma indução robusta de cFos é observada após duas, mas não seis horas de acesso à água potável CNO. Além disso, há um claro limiar de eficácia para cNO, uma vez que uma dose CNO baixa não provoca ativação de cFos em comparação com um controle salino, enquanto doses mais altas induzem uma indução de cFos robusta e semelhante. Recomendamos a realização de uma análise de resposta de dose para definir a menor dose de CNO que não reduz significativamente a ativação neuronal, e considerando o uso de clozapina como um ligante.Aqui demonstramos usando a indução de cFos mediada por CNO como resultado da ativação neuronal. No entanto, esses protocolos podem ser facilmente adotados para análise eletrofisiológica ou testes comportamentais. A tecnologia DREADD é uma poderosa ferramenta para controle remoto da atividade neuronal e projeta estratégias alternativas para a entrega de CNO.Aumentaremos o espectro de opções para configurações experimentais e possíveis intervenções clínicas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Implante cirúrgico de crônicas Eletrodos Neurais para registrar a atividade única Unidade e Sinais eletrocorticográfica

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Neurociência

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

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Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Parênquima não-invasivo, Vascular e Metabólica alta freqüência ultra-som e Fotoacústica Rat Cerebral Profunda Imagem

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Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

Avaliação Não-invasiva de Alterações na Transmissão Corticomotoneuronal em Humanos

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Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Estimulação elétrica transcraniana crônica e gravação Intracortical em ratos

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Modulação não invasiva e mapeamento robótico do córtex motor no cérebro em desenvolvimento

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...