Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramuros del Instituto Nacional de Salud Mental (ZIA MH002964-02). Nos gustaría agradecer el apoyo del NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952).

Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las directrices de los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor y el número de animales utilizados.
1. Inyecciones de virus asociados a los adenos en el hipocampo
NOTA: Los ratones machos de tipo salvaje de fondo mixto (híbrido B6/129 F1, de 3 meses de edad) fueron inyectados estereotaxically con un A...

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Los DREADD han surgido como un enfoque popular y eficaz para manipular remotamente la actividad neuronal17. El diseño de estrategias alternativas para la entrega de CNO aumentará ampliamente el espectro de opciones disponibles para configuraciones experimentales específicas. Además, las estrategias no invasivas para la entrega de CNO minimizan cualquier posible interpretación errónea de los resultados mediante la reducción de los efectos secundarios adversos que pueden afectar directamente ...

Los avances técnicos en el campo de la neurociencia han permitido a los científicos identificar y controlar con precisión la actividad de determinadas poblaciones neuronales1. Esto ha contribuido a entender mejor la base de los circuitos neuronales ysu impacto en el comportamiento animal, así como, la revisión de dogmas establecidos 2,3. Entre estas nuevas herramientas, las estrategias optogenéticas y quimiogenéticas han tenido un profundo impacto no sólo en la calidad de los descubrimientos, sino también en la forma en que se conciben y diseñanlosexperimentos 4. En el presente manuscrito, nos centramos en estrategias quimiogenéticas para controlar la activación de las neuronas a través de estrategias de receptor-ligand diseñadas. Los receptores de diseño activados exclusivamente por los medicamentos de diseño (DREADD) representan una de las herramientas quimiogenéticas más populares para el control remoto de la actividad neuronal, según lo revisado por Roth 20165. Los DREADD utilizan receptores de acetilcolina muscarínicos modificados que son activados específicamente por un ligando inerte, clozapina-N-óxido (CNO)6.
La mayoría de los estudios utilizan CNO administrado por inyecciones intraperitoneales (i.p.), que controla eficazmente la dosis y el momento de la activación de receptores diseñados de una manera aguda. Sin embargo, cuando se requiere activación repetitiva o crónica DREADD, el uso de múltiples inyecciones de i.p. se vuelve inviable. Para abordar este problema, se han reportado diferentes estrategias para la entrega crónica de CNO, incluyendo minibombas implantadas7 y cánulas intracraneales8,9. En diferentes grados, todas estas estrategias causan el estrés y el dolor de los animales10,y requieren una intervención quirúrgica que también podría tener un impacto directo en las respuestas conductuales que se probarán11. Aquí, describimos tres estrategias no invasivas para el parto crónico de CNO.
Para ello, los ratones fueron inyectados estereotaxicamente en el hipocampo con un virus asociado a adeno (AAV) que codifica una versión de ingeniería del receptor muscarínico M3 excitatorio (hM3Dq) que cuando se activa por el ligando CNO conduce a la cocción en forma de ráfaga de neuronas6. Anteriormente se demostró que una sola gota ocular que contiene CNO puede efectivamente obtener una activación robusta de las neuronas que expresan DREADD12. Aquí describimos un método modificado para la entrega repetitiva de gotas para los ojos. Para lograr un control crónico y sostenido de los receptores de diseño, a continuación describimos una estrategia no invasiva para entregar CNO a ratones a través del agua potable. Por último, describimos un paradigma alternativo para la entrega de CNO en agua potable durante una ventana de tiempo restringida. La actividad locomotora de los ratones, así como el comportamiento de beber y el consumo de soluciones calóricas dulces, se limitan principalmente a la porción oscura del ciclo de luz/oscuridad13,14. Por lo tanto, adoptamos un protocolo basado en la preferencia del ratón por la sacarosa. Mediante la medición de la inducción del gen inmediato-temprano c-Fos en células infectadas por AAV, como una lectura para la activación neuronal12,15, encontramos que estas estrategias de administración de CNO activan de forma robusta las neuronas controladas por DREADD en Duraciones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

Las estrategias quimiogenéticas han surgido como herramientas fiables para el control remoto de la actividad neuronal. Entre ellos, los receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) se han convertido en el enfoque quimiogenético más popular utilizado en la neurociencia moderna. La mayoría de los estudios suministran el ligando clozapina-N-óxido (CNO) utilizando una única inyección intraperitoneal, que es adecuada para la activación/inhibición aguda de la población neuronal objetivo. Sin embargo, sólo hay algunos ejemplos de estrategias para la modulación crónica de las neuronas controladas por DREADD, la mayoría de las cuales se basan en el uso de sistemas de administración que requieren intervención quirúrgica. Aquí, ampliamos dos estrategias no invasivas para entregar el ligando CNO para manipular crónicamente la población neuronal en ratones. CNO se administró mediante el uso de gotas para los ojos repetitivas (diarias) o crónicamente a través del agua potable del animal. Estos paradigmas no invasivos dan como resultado una activación robusta de los receptores de diseño que persistieron a lo largo de los tratamientos de CNO. Los métodos descritos aquí ofrecen alternativas para el control crónico mediado por DREADD de la actividad neuronal y pueden ser útiles para experimentos diseñados para evaluar el comportamiento en animales en movimiento libre, centrándose en métodos de entrega de CNO menos invasivos.

Observamos que la administración repetitiva de CNO utilizando gotas para los ojos provocó una inducción robusta de la expresión c-Fos en la mayoría de las neuronas infectadas (Figura1C),lo que muestra que la eficacia de la administración de CNO se mantiene durante la exposición repetitiva. Además, se observó una inducción significativa de c-Fos en muestras recogidas 2 h después del tratamiento con CNO, en comparación con las muestras obtenidas 6 h después de la exposición a CNO...

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Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Aquí describimos dos métodos no invasivos para controlar crónicamente la actividad neuronal utilizando quimiogenética en ratones. Se utilizaron gotas para los ojos para administrar clozapina-N-óxido (CNO) diariamente. También describimos dos métodos para la administración prolongada de CNO en agua potable. Estas estrategias para el control neuronal crónico requieren una intervención mínima reduciendo el estrés de los animales.

Estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por DREADD

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

Los DREADD son el enfoque quimiogenético más popular para el control remoto de la actividad neuronal. Aquí ofrecemos nuevas alternativas para el control repetitivo o crónico de DREADD, centrándonos en métodos de administración de CNO menos invasivos. Describimos dos estrategias para el parto prolongado de CNO en ratones por gotas repetitivas, o crónicamente a través del agua potable del animal.Los protocolos descritos aquí son ejemplos de opciones crónicas y no invasivas para el parto CNO que se pueden adaptar a una variedad de diseños experimentales, incluyendo diferentes variantes DE DREADD, tejidos, o incluso especies. Un problema clave para un parto con CNO es el estrés y el dolor de un animal. Estos protocolos minimizan este problema y son fáciles de realizar y adaptar a diferentes configuraciones experimentales.Antes de realizar la cirugía, limpie y esterilizar el marco estereotaxico y todos los instrumentos necesarios. Cuando el marco esté listo, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo en un ratón macho de tipo salvaje de fondo mezclado anestesiado, afeite la parte superior de la cabeza y fije la cabeza del ratón al marco. A continuación, aplique lubricante protector ocular en los ojos y, finalmente, limpie la piel expuesta con yodo povidona secuencial y exfoliantes de etanol al 70%.Usa un bisturí estéril para exponer el cráneo y calibrar el marco hasta el punto de bregma. Taladre en una coordenada medialateral de 2,9 milímetros, y una coordenada posterior anterior de menos 2,7 milímetros para apuntar al hipocampo. Cuando el cerebro esté expuesto, utilice un micro inyector y pipetas microcapilares para inyectar unilateralmente 90 nanolitros del virus adenoociado en el hipocampo a una profundidad ventral dorsal de menos tres milímetros.A continuación, cierre la incisión con suturas de nylon y retire al animal del marco para la administración de analgesia. Para el parto repetitivo de CNO, comenzando cuatro semanas después de la inyección, aclimatar a los animales a la manipulación desaliñando cada ratón tres minutos al día durante tres a cuatro días antes de la administración de las gotas para los ojos. Cuando los ratones se han aclimatado a la manipulación, pesar cada ratón para determinar la cantidad adecuada de CNO para ser entregado para lograr un un miligramo de CNO por kilogramo de concentración de peso corporal.Dos horas antes de apagar las luces durante la fase inactiva, cargue de una a tres microlitros de la solución CNO preparada en una micropipeta P10 e inmovilice el ratón a través de la desaliñada. Expulse lentamente la solución hasta que se forme una gota estable en la punta de la pipeta y lleve cuidadosamente la gota cerca de la córnea hasta que la solución se entregue sin tocar la punta de la pipeta al ojo del ratón. A continuación, devuelva el ratón a su jaula de origen antes de aplicar la gota de CNO en el ojo del siguiente animal.En los casos en que el CNO deba entregarse durante la fase activa del ratón, asegúrese de que se haya atenuado la luz roja para una manipulación adecuada del animal y la entrega de CNO. Para el tratamiento crónico de CNO, a partir de cuatro semanas después de la inyección y tres días antes de comenzar el tratamiento, sustituya las botellas de agua regulares por botellas pequeñas detenidas con boquillas de goma y cubiertas con papel de aluminio que contenga 10 mililitros de agua regular. Asegure a las jaulas con cinta adhesiva para permitir que los ratones se aclimaten a las botellas.Mida el consumo diario de agua para cada ratón y pese cada ratón. Pruebe un rango de concentraciones de CNO para determinar la dosis que muestra la máxima eficacia con la concentración mínima de CNO. A continuación, llene cada botella pequeña con ocho mililitros de agua regular más la cantidad requerida de CNO.Para el tratamiento restringido de CNO, comenzando cuatro semanas después de la inyección y tres días antes de comenzar el tratamiento, coloque un frasco pequeño que contenga 10 mililitros de agua más 1% sacarosa en la jaula lejos de la botella de agua original durante la última porción de la fase activa del animal. Al final de la exposición, retire el agua más las soluciones de sacarosa de cada jaula y mida el consumo de agua de sacarosa para cada animal. Para la entrega de CNO, llene las botellas con cinco mililitros de agua más 1%sacarosa y un miligramo por kilogramo de CNO.Coloque el frasco en la misma posición que durante el período de aclimatación del agua azucarada durante la última parte de la fase activa, retirando las botellas y midiendo la cantidad de agua, sacarosa y CNO consumida como se ha demostrado. Al final del experimento, cosecha el cerebro animal tratado en un fijador fresco. Después de 9 a 12 horas, crioproteger el tejido cerebral en una solución de 30%sacarosa.Cuando el cerebro se hunde, secciona la muestra en un criostato. Cuando se hayan obtenido todas las secciones cerebrales y se haya bloqueado la unión inespecífica, incubar las muestras de tejido con una solución de anticuerpos anti-c-Fos a cuatro grados Celsius durante la noche con agitación constante. A la mañana siguiente, lave las muestras con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco por lavado antes de incubar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado.Después de una hora a temperatura ambiente y agitación constante protegida de la luz, obtenga imágenes digitales de las secciones tisulares etiquetadas mediante microcroscopia confocal de fluorescencia. Después de cargar las imágenes en ImageJ, describa al medir las áreas de las células positivas mCherry infectadas asociadas a Adeno y cuantifique el número de celdas falsas positivas de C dentro de esta región para obtener el número de celdas activadas por área. La entrega repetitiva de CNO con gotas para los ojos provoca una sólida inducción de la expresión de cFos en la mayoría de las neuronas infectadas que demuestra que la eficacia del parto con CNO se mantiene durante la exposición repetitiva.Además, se observa una inducción significativa de cFos en muestras recogidas dos horas después del tratamiento con CNO en comparación con las muestras obtenidas seis horas después de la exposición a CNO, lo que indica que los cambios inducidos por CNO dependen del tiempo. El consumo diario de agua más CNO no es significativamente diferente en comparación con el volumen total de agua regular consumida. Del mismo modo, la cantidad de agua más el 1% de sacarosa consumida durante la noche no se ve afectada por la adición de CNO, ni las diferencias en el consumo diario de agua más CNO, y el agua más sacarosa más CNO se observan durante un período experimental de cinco días.Al igual que la aplicación de gotas para los ojos CNO, se observa una inducción robusta de cFos después de dos, pero no seis horas de acceso al agua potable CNO. Además, existe un umbral claro de eficacia para el CNO, ya que una dosis baja de CNO no provoca la activación de cFos en comparación con un control salino, mientras que dosis más altas inducen una inducción de cFos robusta y similar. Recomendamos realizar un análisis de respuesta a la dosis para definir la dosis más baja de CNO que no reduce significativamente la activación neuronal, y teniendo en cuenta el uso de clozapina como un ligando.Aquí demostramos el uso de la inducción de cFos mediada por CNO como resultado de la activación neuronal. Sin embargo, estos protocolos se pueden adoptar fácilmente para análisis electrofisiológicos o pruebas de comportamiento. La tecnología DREADD es una poderosa herramienta para el control remoto de la actividad neuronal y el diseño de estrategias alternativas para la entrega de CNO.Aumentaremos el espectro de opciones para entornos experimentales e intervenciones clínicas potenciales.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Investigación

Neurociencias

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Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

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