Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Detta arbete stöddes av interna forskningsprogram vid National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02). Vi skulle vilja tacka stöd av NIMH IRP gnagare beteendemässiga kärna (ZIC MH002952).

Alla djur sköttes i enlighet med riktlinjerna från det nationella institutet för psykisk hälsa (NIMH). Alla ansträngningar gjordes för att minimera smärtan och antalet djur som används.
1. Adeno-associerade virus injektioner i hippocampus
Anmärkning: Vild typ hanmöss med blandad bakgrund (B6/129 F1 hybrid, 3 månader gamla) var för stereotaxically injiceras med en AAV kodning M3 muskarina receptor (hM3Dq) i hippocampus. Under hela experimen...

<ol>
	<li>Park, H. G., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Manipulation+of+Neural+Circuits.">Selective Manipulation of Neural Circuits.</a> Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).</li><li>Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+depressed+brain:+optogenetic+and+chemogenetic+circuit+interrogation+in+animal+models+of+depression.">Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression.</a> Neuropsychopharmacology. 1, (2018).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+Tools+with+Therapeutic+Utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellate+cells+drive+maturation+of+the+entorhinal-hippocampal+circuit.">Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit.</a> Science. 355 (6330), (2017).</li><li>Mahler, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+receptors+show+role+for+ventral+pallidum+input+to+ventral+tegmental+area+in+cocaine+seeking.">Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking.</a> Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).</li><li>Lichtenberg, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+Amygdala+to+Orbitofrontal+Cortex+Projections+Enable+Cue-Triggered+Reward+Expectations.">Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).</li><li>Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+stressful+procedures+as+ether+anesthesia+and+intracranial+injections+on+amino+acid+incorporation+into+brain+protein.">Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein.</a> Brain Research Bulletin. , (1977).</li><li>Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+behavioral+deficits+following+a+routine+surgical+procedure+in+rats.">Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats.</a> Brain Research. , (2007).</li><li>Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye-Drops+for+Activation+of+DREADDs.">Eye-Drops for Activation of DREADDs.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).</li><li>LeGates, T. A., Altimus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+circadian+and+acute+light+responses+in+mice+using+wheel+running+activity.">Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+hedonic+drinking+behavior+in+mice.">Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice.</a> Neuroscience. 349, 229-238 (2017).</li><li>Fernandez, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Affects+Mood+and+Learning+through+Distinct+Retina-Brain+Pathways.">Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways.</a> Cell. 175 (1), 71-84 (2018).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin&#8217;s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs):+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li><li>Urban, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+The+Behavioral+Program+and+Neuronal+Network+Encoded+by+Dorsal+Raphe+Serotonergic+Neurons.">Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons.</a> Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).</li><li>Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+of+a+designer+G+q-coupled+receptor+improves+&#946;+cell+function.">Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves &#946; cell function.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).</li><li>MacLaren, D. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+N-Oxide+Administration+Produces+Behavioral+Effects+in+Long-Evans+Rats:+Implications+for+Designing+DREADD+Experiments.">Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetics+revealed:+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine.">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li></ol>

DREADDs har vuxit fram som en populär och effektiv strategi för att på distans manipulera neuronala aktivitet17. Utformningen av alternativa strategier för CNO leverans kommer i stort sett öka spektrumet av alternativ tillgängliga för specifika experimentella inställningar. Dessutom, icke-invasiva strategier för leverans av CNO minimera eventuella feltolkningar av resultaten genom att minska negativa biverkningar som direkt kan påverka djurens hälsa. Här beskrev vi två icke-invasiva s...

Tekniska framsteg inom neurovetenskap har gjort det möjligt för forskarna att exakt identifiera och kontrollera aktiviteten hos vissa neuronala populationer1. Detta har bidragit till att bättre förstå grunden för neuronala kretsar och deras inverkan på djurens beteende, samt, revidera etablerade dogmer2,3. Bland dessa nya verktyg, optogenetiska och kemogenetiska strategier har haft en djupgående inverkan inte bara på kvaliteten på upptäckter utan också på hur experiment utformas och utformas4. I det nuvarande manuskriptet fokuserar vi på chemogenetiska strategier för att kontrollera aktiveringen av nervceller via konstruerade receptor-ligand-strategier. Designer receptorer uteslutande aktiveras av designer drugs (DREADDs) utgör en av de mest populära kemogenetiska verktyg för fjärrstyrning av neuronala aktivitet, som granskats av Roth 20165. DREADDs utnyttja modifierade muskarinacetylkolinreceptorer som är specifikt aktiveras av en inert ligand, klozapin-N-oxid (CNO)6.
De flesta studier använder CNO administreras av intraperitoneal (i.p.) injektioner, som effektivt styr doseringen och tidpunkten för konstruerade receptorer aktivering på ett akut sätt. Men när repetitiva eller kronisk DREADD aktivering krävs, användning av flera i.p. injektioner blir omöjlig. För att lösa detta problem, olika strategier för kronisk CNO leverans har rapporterats, inklusive implanterade minipumpar7 och intrakraniella kanyl8,9. Till olika grader, alla dessa strategier orsakar djuren stress och smärta10, och kräver en kirurgisk intervention som också kan ha en direkt inverkan på beteendemässiga svar som ska testas11. Här beskriver vi tre icke-invasiva strategier för kronisk CNO-leverans.
För detta ändamål var möss stereotaxically injiceras i hippocampus med en Adeno-associerade virus (AAV) kodning en konstruerad version av excitatoriska M3 muskarina receptor (hM3Dq) som när den aktiveras av ligand CNO leder till burst-liknande bränning av nervceller6. Det visades tidigare att en enda ögondroppe som innehåller CNO effektivt kan framkalla en robust aktivering av DREADD-uttrycker nervceller12. Här beskriver vi en modifierad metod för repetitiv leverans av ögondroppar. För att uppnå kronisk och varaktig kontroll av designerreceptorer, beskriver vi nästa en icke-invasiv strategi för att leverera CNO till möss genom dricksvattnet. Slutligen beskriver vi ett alternativt paradigm för att leverera CNO i dricksvatten under ett begränsat tidsfönster. Möss rörelseaktivitet, liksom dryckesbeteende och konsumtionen av söta kalori lösningar, är oftast begränsade till den mörka delen av ljus/mörker cykel13,14. Därför antog vi ett protokoll baserat på musens preferens för sackaros. Genom att mäta induktionen av den omedelbara tidiga genen c-FOS i AAV-infekterade celler, som en avläsning för neuronala aktivering12,15, fann vi att dessa CNO leverans strategier kraftfullt aktivera dreadd-kontrollerade neuroner över utökade Varaktigheter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

Kemogenetiska strategier har vuxit fram som pålitliga verktyg för fjärrstyrning av neuronala aktivitet. Bland dessa, designer receptorer uteslutande aktiveras av designer drugs (DREADDs) har blivit den mest populära kemogenetiska metod som används i modern neurovetenskap. De flesta studier levererar ligand klozapin-N-oxid (CNO) med hjälp av en enda intraperitoneal injektion, som är lämplig för akut aktivering/hämning av den riktade neuronala befolkningen. Det finns dock bara några exempel på strategier för kronisk modulering av DREADD-kontrollerade nervceller, varav de flesta förlitar sig på användning av leveranssystem som kräver kirurgiska ingrepp. Här expanderar vi på två icke-invasiva strategier för att leverera ligand CNO att kroniskt manipulera neurala befolkningen i möss. CNO administrerades antingen genom att använda repetitiva (dagligen) ögondroppar, eller kroniskt genom djurets dricksvatten. Dessa icke-invasiva paradigm resultera i robust aktivering av de designer receptorer som kvarstod i hela CNO behandlingar. De metoder som beskrivs här erbjuder alternativ för kronisk DREADD-medierad kontroll av neuronala aktivitet och kan vara användbart för experiment som syftar till att utvärdera beteendet i fritt rörliga djur, med fokus på mindre invasiva CNO leveransmetoder.

Vi observerade att upprepad CNO leverans med ögondroppar framkallade en robust induktion av c-FOS uttryck i de flesta infekterade nervceller (figur 1c), visar att effektiviteten av CNO leverans upprätthålls under upprepad exponering. Dessutom observerades en signifikant induktion av c-FOS i prover som samlats in 2 timmar efter CNO-behandling, jämfört med prover som erhållits 6 h efter CNO-exponering (figurerna 1d-E), vilket visar att förändringar som induceras av CNO...

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Här beskriver vi två icke-invasiva metoder för att kroniskt kontrollera neuronala aktivitet med hjälp av chemogenetik hos möss. Ögondroppar användes för att leverera klozapin-N-oxid (CNO) dagligen. Vi beskriver också två metoder för långvarig administrering av CNO i dricksvatten. Dessa strategier för kronisk neuronala kontroll kräver minimal intervention minska djurens stress.

Icke-invasiva strategier för kronisk manipulation av DREADD-kontrollerad neuronal aktivitet

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDs är den mest populära kemogenetiska metoden för fjärrstyrning av neuronal aktivitet. Här erbjuder vi nya alternativ för repetitiva eller kroniska DREADD kontroll, med fokus på mindre invasiva CNO leveransmetoder. Vi beskriver två strategier för den långvariga CNO leveransen i möss av repetitiva ögondroppar, eller kroniskt genom djurets dricksvatten.De protokoll som beskrivs här är exempel på kroniska och noninvasive alternativ för CNO leverans som kan anpassas till en mängd olika experimentella mönster inklusive olika DREADD varianter, vävnader, eller ens arter. En viktig fråga för en CNO leverans är ett djurs stress och smärta. Dessa protokoll minimerar detta problem och är enkla att utföra och anpassa sig till olika experimentella inställningar.Innan du utför operationen, rengör och sterilisera stereotaxic ramen och alla nödvändiga instrument. När ramen är klar, bekräfta en brist på svar på tå nypa i en sövd blandad bakgrund vild typ manlig mus, raka toppen av huvudet, och fixa huvudet på musen till ramen. Applicera sedan okulärt skyddande smörjmedel på ögonen och slutligen, rengör den exponerade huden med sekventiell povidon jod och 70%etanolskrubbs.Använd en steril skalpell för att exponera skallen och kalibrera ramen till bregma-punkten. Borra på en medialateral koordinat på 2,9 millimeter, och en främre bakre koordinat på minus 2,7 millimeter för att rikta hippocampus. När hjärnan exponeras, använd en mikroinjektor och drog mikrokapillärpipetter för att ensidigt injicera 90 nanoliter av det adenoassocierade viruset i hippocampus på ett dorsal ventralt djup av tre minus millimeter.Stäng sedan snittet med nylonsuturer, och ta bort djuret från ramen för analgesi administration. För repetitiv CNO leverans, börjar fyra veckor efter injektion, acklimatisera djuren till hantering genom scruffing varje mus tre minuter dagligen i tre till fyra dagar före administrering av ögondroppar. När mössen har blivit acklimatiserade till hantering, väga varje mus för att bestämma lämplig mängd CNO som ska levereras för att uppnå en ett milligram CNO per kilo kroppsvikt koncentration.Två timmar innan lamporna släcks under den inaktiva fasen, ladda en till tre mikroliter av den beredda CNO-lösningen i en P10-mikropipette och immobilisera musen via scruffing. Utvisa långsamt lösningen tills en stabil droppe bildas på pipettspetsen och ta försiktigt med droppen nära hornhinnan tills lösningen levereras utan att pipetten rörs till musens öga. Sedan tillbaka musen till sitt hem bur innan du applicerar CNO ögondroppe till ögat av nästa djur.I de fall där CNO behöver levereras under musens aktiva fas, säkerställa förekomsten av ett svagt rött ljus för korrekt djurhantering och CNO leverans. För kronisk CNO behandling, med början fyra veckor efter injektion och tre dagar innan behandlingen, ersätta den vanliga vattenflaskor med små flaskor stoppas med gummi pipar och täckt med aluminiumfolie som innehåller 10 milliliter regelbundet vatten. Säkra till burarna med tejp så att möss kan acklimatisera sig till flaskorna.Mät den dagliga vattenförbrukningen för varje mus, och väg varje mus. Testa en rad CNO-koncentrationer för att bestämma den dos som visar den maximala effektiviteten med den minimala CNO-koncentrationen. Fyll sedan varje liten flaska med åtta milliliter vanligt vatten plus den erforderliga mängden CNO.För begränsad behandling med CNO, med början fyra veckor efter injektionen och tre dagar innan behandlingen påbörjas, placera en liten flaska som innehåller 10 milliliter vatten plus 1%sackaros på buren bort från den ursprungliga vattenflaskan under den sista delen av djurets aktiva fas. I slutet av exponeringen, ta bort vattnet plus sackaroslösningar från varje bur och mät sackarosvattenförbrukningen för varje djur. För CNO leverans, fyll flaskorna med fem milliliter vatten plus 1%sackaros och ett milligram per kilo CNO.Placera flaskan i samma läge som under sockervattenacklimatiseringsperioden under den sista delen av den aktiva fasen, ta ut flaskorna och mäta mängden vatten, sackaros och CNO som förbrukas enligt påvis. I slutet av experimentet, skörda den behandlade djurhjärnan till färskt fixativ. Efter 9 till 12 timmar, cryoprotect hjärnvävnaden i en 30%sackaros lösning.När hjärnan sjunker, dela upp provet på en kryostat. När alla hjärnsektioner har erhållits och den ospecifika bindningen blockerats, inkubera vävnadsproverna med en anti-c-Fos-antikroppslösning vid fyra grader Celsius över natten med ständig agitation. Nästa morgon, tvätta proverna med tre fem minuters tvättar i färska PBS per tvätt innan inkubering av proverna med en lämplig fluorescens konjugerad sekundär antikropp.Efter en timme i rumstemperatur och konstant agitation skyddad från ljus, erhålla digitala bilder av den märkta vävnad sektioner genom fluorescens confocal microcroscopy. Efter att ha laddat bilderna i ImageJ, disposition på mäta områdena av Adeno-associerade infekterade mCherry positiva celler och kvantifiera antalet C falska positiva celler inom denna region för att få antalet aktiverade celler per område. Repetitiva CNO leverans med ögondroppar framkallar en robust induktion av cFos uttryck i de flesta infekterade nervceller visar att effektiviteten av CNO leverans är ihållande under repetitiva exponering.Vidare observeras en betydande induktion av cFos i prover som samlats in två timmar efter CNO-behandling jämfört med prover som erhållits sex timmar efter CNO-exponering, vilket indikerar att förändringar som induceras av CNO är tidsberoende. Den dagliga förbrukningen av vatten plus CNO är inte signifikant annorlunda jämfört med den totala volymen vanligt vatten som förbrukas. På samma sätt påverkas inte den mängd vatten plus 1 %sackaros som förbrukas under natten av tillsats av CNO, och inte heller skillnader i den dagliga förbrukningen av både vatten plus CNO, och vatten plus sackaros plus CNO observerats under en experimentperiod på fem dagar.I likhet med tillämpningen av CNO ögondroppar, en robust induktion av cFos observeras efter två, men inte sex timmar av CNO dricksvatten tillgång. Dessutom finns det en tydlig tröskel för effektivitet för CNO som en låg CNO dos inte framkalla cFos aktivering jämfört med en saltlösning kontroll, medan högre doser inducerar en robust och liknande cFos induktion. Vi rekommenderar att du utför en dos respons analys för att definiera den lägsta CNO dos som inte avsevärt minska neuronal aktivering, och med tanke på användningen klozapin som en ligand.Här visade vi med CNO-medierad cFos induktion som ett resultat av neuronal aktivering. Dessa protokoll kan dock enkelt antas till elektrofysiologisk analys eller beteendetester. DREADD-tekniken är ett kraftfullt verktyg för fjärrstyrning av neuronal aktivitet, och utforma alternativa strategier för CNO leverans.Vi kommer att öka spektrumet av alternativ för experimentella inställningar och potentiella kliniska interventioner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Kirurgisk implantation av kroniska neurala elektroder för inspelning Single Unit aktivitet och Electrocorticographic signaler

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, realtidsmätning av laktat koncentration och optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet hos gnagare Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Att studera neuronal morfologi och migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Icke-invasiv parenkyma, Vascular och Metabolic Högfrekventa Ultraljud och Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

Icke-invasiv bedömning av förändringar i kortikomotonuronal överföring hos människor

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Extracellulär inspelning av nervaktiviteten Kombinerat med Microiontophoretic Tillämpning av neuroaktiva ämnen i Vakna möss

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Inspelning Temperatur-inducerad neuronal aktivitet genom att övervaka Kalcium Förändringar i luktbulben av<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk transkraniell elektrisk stimulering och Intracortical inspelning hos råttor

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Icke-invasiv modulering och robot kartläggning av motoriska cortex i hjärnans utveckling

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...