Name: non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü 'ndeki intramural araştırma programı (ZIA MH002964-02) tarafından desteklenmiştir. Biz NIMH IRP Kemirgen Davranış Çekirdek (ZIC MH002952) desteğine teşekkür etmek istiyorum.

Tüm hayvanlar, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü 'nün (NIMH) Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri yönergelerine uygun olarak ele alındı. Kullanılan hayvan sayısını ve acısını en aza indirmek için tüm çabalar sarf edildi.
1. Hipokampus adeno ilişkili virüs enjeksiyonları
NOT: Karışık arka plan (B6/129 F1 hibrid, 3 aylık) yabani tip erkek fareler stereotaksik hipokampus içine M3 muskarinik reseptör (hM3Dq) kodlama bir AAV ile e...

<ol>
	<li>Park, H. G., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Manipulation+of+Neural+Circuits.">Selective Manipulation of Neural Circuits.</a> Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).</li><li>Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+depressed+brain:+optogenetic+and+chemogenetic+circuit+interrogation+in+animal+models+of+depression.">Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression.</a> Neuropsychopharmacology. 1, (2018).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+Tools+with+Therapeutic+Utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellate+cells+drive+maturation+of+the+entorhinal-hippocampal+circuit.">Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit.</a> Science. 355 (6330), (2017).</li><li>Mahler, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+receptors+show+role+for+ventral+pallidum+input+to+ventral+tegmental+area+in+cocaine+seeking.">Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking.</a> Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).</li><li>Lichtenberg, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+Amygdala+to+Orbitofrontal+Cortex+Projections+Enable+Cue-Triggered+Reward+Expectations.">Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).</li><li>Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+stressful+procedures+as+ether+anesthesia+and+intracranial+injections+on+amino+acid+incorporation+into+brain+protein.">Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein.</a> Brain Research Bulletin. , (1977).</li><li>Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+behavioral+deficits+following+a+routine+surgical+procedure+in+rats.">Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats.</a> Brain Research. , (2007).</li><li>Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye-Drops+for+Activation+of+DREADDs.">Eye-Drops for Activation of DREADDs.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).</li><li>LeGates, T. A., Altimus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+circadian+and+acute+light+responses+in+mice+using+wheel+running+activity.">Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+hedonic+drinking+behavior+in+mice.">Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice.</a> Neuroscience. 349, 229-238 (2017).</li><li>Fernandez, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Affects+Mood+and+Learning+through+Distinct+Retina-Brain+Pathways.">Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways.</a> Cell. 175 (1), 71-84 (2018).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin&#8217;s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs):+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li><li>Urban, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+The+Behavioral+Program+and+Neuronal+Network+Encoded+by+Dorsal+Raphe+Serotonergic+Neurons.">Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons.</a> Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).</li><li>Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+of+a+designer+G+q-coupled+receptor+improves+&#946;+cell+function.">Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves &#946; cell function.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).</li><li>MacLaren, D. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+N-Oxide+Administration+Produces+Behavioral+Effects+in+Long-Evans+Rats:+Implications+for+Designing+DREADD+Experiments.">Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetics+revealed:+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine.">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li></ol>

DREADDs uzaktan nöronal aktivite17işlemek için popüler ve etkili bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. CNO teslimatı için alternatif stratejilerin tasarımı, belirli deneysel ayarlar için mevcut seçeneklerin yelpazesini geniş ölçüde artıracaktır. Buna ek olarak, CNO teslimi için non-invaziv stratejiler doğrudan hayvan Sağlığını etkileyebilir yan etkileri azaltarak sonuçların herhangi bir potansiyel yanlış yorumlanmasını en aza indirmek. Burada, CNO teslimatı iç...

Nöroloji alanındaki teknik gelişmeler, bilim adamlarının belirli nöronal popülasyonların aktivitesini tamolarak belirlemelerine ve kontrol etmelerine olanak sağlamıştır 1. Bu daha iyi nöronal devrelerin temelini ve hayvan davranışı üzerindeki etkilerini anlamak için katkıda bulunmuştur, yanı sıra, kurulan dogmalar revize2,3. Bu yeni araçlar arasında, optogenetik ve kemogenetik stratejiler keşiflerin kalitesi üzerinde değil, aynı zamanda deneylerin tasarlanıptasarlanmabiçimi üzerinde de derin bir etkiye sahiptir 4. Bu yazıda, nöronların aktivasyonunu mühendislik reseptör-ligand stratejileri ile kontrol etmek için kemogenetik stratejilere odaklanıyoruz. Tasarımcı reseptörleri sadece tasarımcı ilaçlar tarafından aktive (DREADDs) nöronal aktiviteuzaktan kontrol için en popüler kemogenetik araçlardan birini temsil, Roth tarafından gözden olarak 20165. DREADDs özellikle bir inert ligand tarafından aktive modifiye muskcarinik asetilkolin reseptörleri kullanmak, klozapin-N-oksit (CNO)6.
Çoğu çalışmada, akut bir şekilde mühendislik reseptörlerinin aktivasyonunun dozajını ve zamanlamasını etkili bir şekilde kontrol eden intraperitoneal (yani) enjeksiyonlar tarafından uygulanan CNO kullanılır. Ancak, tekrarlayan veya kronik DREADD aktivasyonu gerektiğinde, birden fazla i.p. enjeksiyonunun kullanımı mümkün değildir. Bu sorunu gidermek için, kronik CNO doğum için farklı stratejiler bildirilmiştir, implante minipumpsdahil 7 ve intrakranial kanüller8,9. Farklı ölçüde, tüm bu stratejiler hayvanların stres ve ağrıneden 10, ve aynı zamanda test edilecek davranışsal tepkiler üzerinde doğrudan bir etkisi olabilir cerrahi bir müdahale gerektirir11. Burada kronik CNO doğumu için üç non-invaziv strateji açıklıyoruz.
Bu amaçla, fareler stereotaksik bir adeno-ilişkili virüs ile hipokampus enjekte edildi (AAV) uyarıcı M3 muscarinic reseptörü (hM3Dq) bir mühendislik sürümünü kodlama ligand CNO tarafından aktive patlama gibi ateş yol açar nöronlar6. Daha önce CNO içeren tek bir göz damlası etkili DREADD ifade nöronların sağlam bir aktivasyon ortaya olabilir gösterilmiştir12. Burada göz damlalarının tekrarlayan teslimatı için değiştirilmiş bir yöntem açıklıyoruz. Tasarımcı reseptörlerinin kronik ve sürekli kontrolünü sağlamak için, daha sonra içme suyu aracılığıyla farelere CNO sunmak için non-invaziv bir strateji açıklar. Son olarak, sınırlı bir zaman dilimi içinde içme suyunda CNO teslim etmek için alternatif bir paradigma açıklar. Fareler lokomotor aktivitesi, yanı sıra içme davranışı ve tatlı kalori çözeltileri tüketimi, çoğunlukla ışık / karanlık döngüsü13,14karanlık kısmı ile sınırlıdır. Bu nedenle farenin sakaroz tercihine dayalı bir protokol uyguladık. AAV-enfekte hücrelerde hemen erken gen c-Fos indüksiyon ölçerek, nöronal aktivasyon için bir okuma olarak12,15, Biz bu CNO dağıtım stratejileri sağlam dreadd kontrollü nöronlar üzerinde genişletilmiş etkinleştirmek bulundu Süre.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>#A2153-100G</td>
			<td>Lyophilized powder &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>male mice, 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter: 1.14 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C0832</td>
			<td>5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>#NDC 10019-360-60</td>
			<td>Isoflurane, USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector III</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>#3-000-207</td>
			<td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#15710</td>
			<td>16% aqueous solution (methanol free), 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary c-Fos Antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>#2250S</td>
			<td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV5/hSyn-mCherry</td>
			<td>UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>Titer: ~3x10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A21206</td>
			<td>Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>americanbio.com</td>
			<td>#AB02025-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive strategies for chronic manipulation of dreadd-controlled neuronal activity

Kemogenetik stratejiler nöronal aktivitenin uzaktan kontrolü için güvenilir araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Bunlar arasında, tasarımcı reseptörleri sadece tasarımcı ilaçlar tarafından aktive (DREADDs) modern nörolojik kullanılan en popüler kemogenetik yaklaşım haline gelmiştir. Çoğu çalışma, hedeflenen nöronal popülasyonun akut aktivasyonu/inhibisyonu için uygun olan tek bir intraperitoneal enjeksiyon kullanarak ligand klozapin-N-oksit (CNO) sunar. Bununla birlikte, DREADD kontrollü nöronların kronik modülasyonu için stratejilersadece birkaç örnek vardır, bunların çoğunluğu cerrahi müdahale gerektiren dağıtım sistemlerinin kullanımına dayanır. Burada, ligand CNO'yu farelerdeki nöral popülasyonu kronik olarak manipüle etmek için teslim etmek için iki non-invaziv stratejiyi genişletiyoruz. CNO ya tekrarlayan (günlük) göz damlaları kullanılarak ya da kronik olarak hayvanın içme suyu yoluyla uygulandı. Bu non-invaziv paradigmalar CNO tedavileri boyunca devam tasarımcı reseptörlerinin sağlam aktivasyonu ile sonuçlanır. Burada açıklanan yöntemler nöronal aktivitenin kronik DREADD aracılı kontrolü için alternatifler sunmakta ve serbestçe hareket eden hayvanlardaki davranışları değerlendirmek için tasarlanmış deneylerde, daha az invaziv CNO dağıtım yöntemlerine odaklanarak yararlı olabilir.

Göz damlası kullanılarak tekrarlayan CNO doğumunun enfekte olan nöronların çoğunda (Şekil1C)c-Fos ekspresyonunun sağlam bir indüksiyonuna yol açtığını gözlemledik ve tekrarlayan maruziyet sırasında CNO doğumunun etkinliğinin devam ettiğini gösterdik. Ayrıca CNO tedavisinden 2 saat sonra toplanan örneklerde c-Fos'un önemli bir indüksiyonu gözlenirken, CNO maruziyetinden sonra 6 saat (Şekil1D-E)alınan örneklere göre CNO tarafından indüklenen d...

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity at JoVE.com

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Burada farelerde kemogenetik kullanarak nöronal aktiviteyi kronik olarak kontrol etmek için iki non-invaziv yöntem açıklanmıştır. Göz damlaları günlük klozapin-N-oksit (CNO) sunmak için kullanıldı. Ayrıca içme suyunda CNO uzun süreli uygulanması için iki yöntem açıklar. Kronik nöronal kontrol için bu stratejiler hayvanların stresini azaltarak minimal müdahale gerektirir.

DREADD kontrollü Nöronal Aktivitekronik Manipülasyon için Non-invaziv Stratejiler

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDs nöronal aktiviteuzaktan kontrol için en popüler kemogenetik yaklaşımdır. Burada tekrarlayan veya kronik DREADD kontrolü için yeni alternatifler sunuyoruz, daha az invaziv CNO doğum yöntemleri odaklanarak. Farelerde uzun süreli CNO teslimatı için tekrarlayan göz damlaları veya hayvanın içme suyu yoluyla kronik olarak iki strateji tanımlıyoruz.Burada açıklanan protokoller, farklı DREADD varyantları, dokular ve hatta türler de dahil olmak üzere çeşitli deneysel tasarımlara uyarlanabilen CNO teslimatı için kronik ve noninvaziv seçeneklere örneklerdir. Bir CNO teslimat için önemli bir konu bir hayvanın stres ve ağrı. Bu protokoller bu sorunu en aza indirir ve farklı deneysel ayarlara kolayca uyarlanır.Ameliyatı gerçekleştirmeden önce stereotaksik çerçeveyi ve gerekli tüm aletleri temizleyin ve sterilize edin. Çerçeve hazır olduğunda, anestezik karışık arka plan vahşi tip erkek fare de parmak ucu çimdik yanıt eksikliği onaylamak, başın üst tıraş ve çerçeve ye fare nin başını düzeltmek. Daha sonra gözlere göz koruyucu yağlayıcı uygulayın ve son olarak, sıralı povione iyot ve% 70 etanol scrubs ile maruz kalan cilt temizleyin.Kafatası ortaya çıkarmak ve bregma noktasına çerçeve kalibre etmek için steril bir neşter kullanın. 2.9 milimetrelik bir medialateral koordinatta sondaj ve hipokampusu hedeflemek için eksi 2.7 milimetrelik bir ön arka koordinat. Beyin maruz kaldığında, bir mikro enjektör kullanın ve tek taraflı eksi üç milimetre bir dorsal ventral derinlikte hipokampusa adenoilişkili virüsün 90 nanolitre enjekte mikrokapiller pipetler çekti.Sonra naylon dikişile kesi kapatın ve analjezi yönetimi için çerçeve hayvan çıkarın. Tekrarlayan CNO teslimatı için, enjeksiyondan dört hafta sonra başlayarak, göz damlalarının uygulanmasından önce her fareyi günde üç ila dört gün boyunca üç ila dört dakika boyunca her fareyi scruffing yaparak hayvanları işlemeye alıştırın. Fareler işleme alıştıkğınızda, vücut ağırlığı konsantrasyonu kilogram başına CNO bir miligram elde etmek için teslim edilecek CNO uygun miktarda belirlemek için her fare tartMak.İnaktif faz sırasında ışıklar sönmeden iki saat önce, hazırlanan CNO çözeltisinin 1-3 mikrolitresini P10 mikropipetine yükleyin ve fareyi paslandırma yoluyla etkisiz hale getirin. Pipet ucunda sabit bir damlacık oluşana kadar çözeltiyi yavaşça dışarı atın ve damlacıkları farenin gözüne pipet ucuna dokunmadan solüsyona gelene kadar dikkatlice korneaya yakın bir şekilde getirin. Sonra bir sonraki hayvanın gözüne CNO göz damlası uygulamadan önce ev kafesi için fare dönün.CNO'nun fare etkin fazı sırasında teslim edilmesi gereken durumlarda, uygun hayvan taşıma ve CNO teslimatı için loş kırmızı Bir ışık olduğundan emin olun. Kronik CNO tedavisi için, dört hafta sonrası enjeksiyon başlayan ve tedaviye başlamadan üç gün önce, küçük şişeler kauçuk pouts ile durdu ve düzenli su 10 mililitre içeren alüminyum folyo ile kaplı ile düzenli su şişeleri değiştirin. Farelerin şişelere alışmasını sağlamak için kafeslere bantla sabitleyin.Her fare için günlük su tüketimini ölçün ve her fareyi tartının. Minimum CNO konsantrasyonu ile maksimum etkinliği gösteren dozu belirlemek için bir dizi CNO konsantrasyonu test edin. Sonra düzenli su artı CNO gerekli miktarda sekiz mililitre ile her küçük şişe doldurun.Sınırlı CNO tedavisi için, enjeksiyondan dört hafta sonra başlayan ve tedaviye başlamadan üç gün önce, hayvanın aktif evresinin son kısmında orijinal su şişesinden uzakta kafese 10 mililitre su artı %1 sakaroz içeren küçük bir şişe yerleştirin. Pozlama sonunda, her kafesten su artı sakaroz çözeltilerini çıkarın ve her hayvan için sakaroz su tüketimini ölçün. CNO teslimatı için, şişeleri beş mililitre su artı %1 sakaroz ve kilogram başına bir miligram CNO ile doldurun.Şişeyi aktif fazın son kısmında şekerli su alışma döneminde aynı pozisyonda yerleştirin, şişeleri çıkararak ve tüketilen su miktarını ölçerek, sakaroz ve CNO'yu gösterdiği gibi. Deneyin sonunda, tedavi edilen hayvan beynini taze fiksatif olarak hasat edin. 9 ila 12 saat sonra, kriyoprotect beyin dokusu bir 30% sakaroz çözeltisi.Beyin battığında, örneği kriyostat'a böl. Tüm beyin bölümleri elde edildiğinde ve nonspesifik bağlanma bloke edildiğinde, doku örneklerini bir anti-c-Fos antikor solüsyonu ile bir gecede sürekli ajitasyonla dört derece yekpiz. Ertesi sabah, numuneleri uygun bir floresan konjuge ikincil antikorile kuluçkaya yatırmadan önce numuneleri yıkama başına taze PBS'de üç beş dakikalık yıkama ile yıkayın.Oda sıcaklığında bir saat ve ışıktan korunan sürekli ajitasyondan sonra floresan konfokal mikrokroskopi ile etiketlenmiş doku bölümlerinin dijital görüntülerini elde edin. Görüntüleri ImageJ'e yükledikten sonra, Adeno ile ilişkili enfekte mCherry pozitif hücrelerin alanlarını ölçmek ve alan başına aktif hücre sayısını elde etmek için bu bölgedeki C yanlış pozitif hücrelerin sayısını ölçmek için anahat. Göz damlası kullanılarak tekrarlayan CNO teslimi, çoğu enfekte nöronda cFOS ekspresyonunun sağlam bir indüksiyonunu ortaya çıkarır ve tekrarlayan maruziyet sırasında CNO doğumunun etkinliğinin devam ettiğini gösterir.Ayrıca CNO tedavisinden iki saat sonra alınan örneklerde CNO maruziyetinden altı saat sonra alınan örneklere göre cfos indüksiyonunun önemli bir indüksiyonu gözlenir ve CNO tarafından indüklenen değişikliklerin zamana bağlı olduğunu gösterir. Günlük su tüketimi artı CNO tüketilen düzenli su toplam hacmi ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde farklı değildir. Benzer şekilde, gece boyunca tüketilen su miktarı artı%1 sakaroz CNO eklenmesinden etkilenmez, ne de her iki su artı CNO günlük tüketiminde farklılıklar, ve su artı sakaroz artı CNO beş günlük bir deneysel dönemde gözlenen.CNO göz damlası uygulamasına benzer şekilde, cFos sağlam bir indüksiyon iki sonra gözlenir, ancak CNO içme suyu erişim altı saat değil. Buna ek olarak, düşük Bir CNO dozu bir tuzlu kontrol ile karşılaştırıldığında cFos aktivasyonu ortaya çıkarmaz gibi CNO için etkinlik açık bir eşik vardır, yüksek dozlarda sağlam ve benzer cFos indüksiyon neden ise. Biz önemli ölçüde nöronal aktivasyonu azaltmaz en düşük CNO dozu tanımlamak için bir doz yanıt analizi yapmanızı öneririz, ve bir ligand olarak klozapin kullanımı dikkate.Burada nöronal aktivasyon sonucu CNO aracılı cFos indüksiyonu kullanılarak gösterilmiştir. Ancak, bu protokol kolayca elektrofizyolojik analiz veya davranış testleri için kabul edilebilir. DREADD teknolojisi nöronal aktivite uzaktan kontrol için güçlü bir araçtır, ve CNO teslimat için alternatif stratejiler tasarımı.Deneysel ayarlar ve potansiyel klinik müdahaleler için seçenekler yelpazesini artıracağız.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Tek Birim Faaliyet ve elektrokortikografik Sinyalleri Kayıt için Kronik Sinir Elektrotların Cerrahi İmplantasyonu

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Non-invaziv parankim, Vasküler ve Metabolik Yüksek frekanslı ultrason ve foto akustik Sıçan Derin Beyin Görüntüleme

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

İnsanlarda Corticomotoneuronal İletimde Değişikliklerin İnvaziv Olmayan Değerlendirilmesi

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Uyanık Farelerde Nöroaktif Maddelerin Microiontophoretic Uygulaması ile birlikte Nöronal Faaliyet dışı Kaydı

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronik Transkraniyal elektriksel stimülasyon ve Sıçanlarda Intracortical kayıt

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Gelişmekte olan beyin motor Cortex non-Invaziv modülasyon ve robotik haritalama

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...