Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

هذا العمل معتمد من قبل "المعاهد الوطنية للصحة" عن طريق التعاقد # R01 AI132413-01.

1-تجميع جسيمات نانوية مسامية السيليكون (بسينبس)
تنبيه: كن حذراً دائماً عند العمل مع حمض الهيدروفلوريك (HF). اتبع جميع أدلة الأمان وفقا لورقة بيانات السلامة به (SDS) والتعامل مع أي المواد الكيميائية التي تحتوي على التردد في غطاء دخان، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات ...

<ol>
	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications.">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li><li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+gene+editing:+delivery+and+regulatory+perspectives.">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).</li><li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs.">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li><li>Dai, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

ويرد توليف لجسيمات نانوية مسامية السليكون في الشكل 5. الخطوة الحاسمة في تركيب بسينبس فوسوجينيك في تحميل الخطوة (الخطوة 3). إذا كان يتم تجميع جسيمات نانوية فوسوجينيك بعد توليف (الشكل 3)، والسبب قد يكون بسبب ما يلي: (1) كلوريد الكالسيوم المخزون لم يعد المتجانس، و?...

العلاج الجيني ينظم التعبير الجيني محددة الحصول على نتيجة العلاج. تم اكتشاف العديد من أدوات للتحوير الجيني ودراستها، بما في ذلك الحمض النووي الريبي التدخل ([رني]) باستخدام النوكليوتيد (مثلاً، قصيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)1،2، ميكرورنا (ميرنا)3،4 )، الحمض النووي والبلازميدات5،6، نوكليسيس (مثلاً، إصبع الزنك، تالينس)7،8، ونظم كريسبر/Cas99،10. بينما يختلف إليه كل أداة عمل، جميع الأدوات يجب أن تصل إلى السيتوبلازم للخلية أو النواة تكون نشطة. على هذا النحو، بينما أثبتت هذه الأدوات للحث على تأثير كبير على تحوير الجينات في المختبر، ونجاعة المجراة في تعاني من عقبات خارج الخلية وداخل الخلية. يرجع ذلك إلى حقيقة أن الأدوات التي من أصل بيولوجي، العديد من الإنزيمات ونظم إزالة الألغام موجودة في الجسم التي لها القدرة على تخفيض أو إزالة الجزيئات الأجنبية11. حتى في الحالة أن الأدوات التي تصل إلى الخلية المستهدفة، وأنهم يعانون من الالتقام؛ طريقة لامتصاص الخلوية التي تقوم بتغليف والفخاخ الأدوات الموجودة في حويصلات تشبه المعدة الحمضية التي تتحلل أو طرد أدوات الخروج من الزنزانة. في الواقع، لقد أظهرت الدراسات أن الدهون جسيمات نانوية المبتلعة عن طريق ماكروبينوسيتوسيس، التي هي اكسوسيتوسيد حوالي 70% من siRNA من الخلايا ضمن ح 24 لاستيعاب12،13. غالبية siRNA المتبقية هي المتدهورة من خلال المسار الليزوزومية، وفي نهاية المطاف تحقيق فقط 1-2% من siRNA في البداية يدخل الخلية التي تحتوي جسيمات نانوية الهروب اندوسومال الخضوع يحتمل أن تكون [رني]13،14 .
وقد وضعنا مؤخرا فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية (F-بسينبس) التي أساسية محملة siRNA تتألف من جسيمات نانوية السيليكون المليئة بالثغرات، و شل دهن فوسوجينيك15. واو-بسينبس يقدم ثلاث مزايا رئيسية على أنظمة إيصال اليغنوكليوتيد التقليدية الأخرى: (1) دهن فوسوجينيك الطلاء التي تمكن الجسيمات تجاوز الالتقام وتسليم الحمولة كاملة مباشرة في السيتوبلازم الخلية (مقابل % 1-2 يتحقق بالجسيمات المبتلعة13،14) (الشكل 1)؛ (2) تحميل siRNA في بسينبس أسلحة عالية (> 20 و % مقارنة بوزن 1-15% من النظم التقليدية)15، والتي تتحلل سريعاً في السيتوبلازم (بمجرد إلقاء الجسيمات الأساسية للطلاء الدهني عن طريق امتصاص فوسوجينيك) لإطلاق سراح siRNA؛ و (3) استهداف تصريف الببتيد لاستضافة أكثر انتقائية للمطلوب أنواع الخلايا الحية في.
وقد أثبت نظام بسينب و الجينات كبيرة إسكات فعالية (> 95% في المختبر؛ > 80% المجراة في) وتأثير العلاجية اللاحقة في طراز ماوس قاتلة من الالتهاب الرئوي في المذهبة س. ؛ النتائج التي تم نشرها سابقا15. ومع ذلك، يتطلب البنية المعقدة للنظام و بسينب معالجة دقيقة وصقل الأمثل لتوليد جسيمات نانوية موحدة ومستقرة. وهكذا، والغرض من هذا العمل تقديم بروتوكول شامل، فضلا عن استراتيجيات التحسين للتوليف والروغان، ووصف واو-بسينبس لاستخدامها في إيصال المستهدفة من سيرناس لتأثير إسكات الجينات القوية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

ومع ظهور العلاج الجيني، أصبح تطوير نظام التسليم الفعال المجراة في النوكليوتيدات-حمولة الاستيراد الموازي. مؤخرا أظهرت فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية (F-بسينبس) عالية الجيني المجراة في إسكات فعاليتها بسبب ما اليغنوكليوتيد عالية تحميل القدرات ومسار امتصاص الخلوية الفريدة التي تتجنب الالتقام. توليف بسينبس و هو عملية متعددة الخطوات تتضمن: (1) تحميل وختم حمولات اليغنوكليوتيد في المسام السليكون؛ (2) المتزامنة طلاء والتحجيم من الدهون فوسوجينيك حول النوى سليكون المليئة بالثغرات؛ والتصريف (3) استهداف الببتيدات والغسيل لإزالة اليغنوكليوتيد الزائدة والحطام السليكون الببتيد. التوحيد حجم الجسيمات تتسم بالديناميكية ونثر الضوء، ومن الممكن التحقق من بنيتها الأساسية-شل مجهر إلكتروني. يتم التحقق من امتصاص فوسوجينيك بتحميل محبتين صبغ، 1, 1 '-ديوكتاديسيل-3,3، 3', بيركلورات 3 '--تيتراميثيليندوكاربوسيانيني (دي)، إلى بلير دهن فوسوجينيك وعلاجها بالخلايا في المختبر لمراقبة لغشاء البلازما تلطيخ مقابل تعريب اندوسيتيك. تم قياس كمية بلغت إسكات الجينات الاستهداف والمجراه في سابقا في نموذج ماوس للالتهاب الرئوي من المكوّرات العنقودية الذهبية ، التي يتوقع الببتيد الاستهداف للمساعدة وبسينبس للصفحة الرئيسية لموقع الإصابة. بعد تطبيقه في المذهبة س. العدوى، يمكن استخدام النظام و بسينب لتسليم أي اليغنوكليوتيد للعلاج الجيني لمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك العدوى الفيروسية، والسرطان، وأمراض المناعة الذاتية.

توليفة ناجحة من بسينبس فوسوجينيك وينبغي التوصل إلى حل متجانسة، مبهمة بعض الشيء (الشكل 3a). الفشل في تحسين نسبة وتركيز بسينبس: siRNA: كاكل2 قد يؤدي إلى التراكم عند تحميل (الشكل 3b). كما هي مقذوف الجسيمات من خلال 200 نانومتر الأغشية، قطر بسينبس...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

علينا أن نظهر توليف فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية لتسليم اليغنوكليوتيد في المختبر والمجراه في فعالية. جسيمات نانوية مسامية السليكون هي محملة siRNA النموذج الأساسية، التي هي مغلفة بالدهون فوسوجينيك عن طريق البثق لتشكيل shell. يتم تضمين استهداف مجموعة الروغان وتوصيف الجسيمات.

توليف، الروغان، وتوصيف جسيمات نانوية مسامية السليكون فوسوجينيك لإيصال اليغنوكليوتيد

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

يصف هذا البروتوكول تركيب نظام الجسيمات النانوية القادر على إسكات الجينات في الجسم الحي عن طريق تقديم الـ siRNAs بكفاءة عالية. بمجرد تبادل الببتيد المستهدف وحمولة الـ siRNA ، يمكن استخدام الجسيمات النانوية الفوسوجينية كصياح علاجي محتمل للأمراض التي تتطلب في تعديل الجينات الحية. لقد نشرنا النتائج سابقا باستخدام نانوفورم fusogenic ضد الالتهابات البكتيرية إيجابية الجرام عن طريق إسكات الجين الذي يشفّر لالتهاب في الضامة لإنهاء الالتهاب المزمن.قبل تنفيذ هذا الإجراء، قم بتجميع خلية تفلون حفر تحتوي على رقاقة سيليكون في محلول حمض هيدروفلوريك ثلاثة إلى واحد. تشغيل تيار متناوب من شكل موجي مربع مع كثافة تيار منخفض من 50 مللي امبير في سنتيمتر مربع لمدة 0.6 ثانية وكثافة تيار عالية من 400 مللي امبير في سنتيمتر مربع لمدة 0.36 ثانية تتكرر لدورات 500. بمجرد الانتهاء من الحفر ، قم بإزالة الخلية من الدائرة ، وشطف محلول حمض الهيدروفلوريك بعناية باستخدام حقنة.ثم شطف ثلاث مرات مع الإيثانول. لرفع قبالة طبقة مسامية من رقاقة السيليكون، أولا ملء بئر الخلية حفر مع 10 ملليلتر من واحد إلى 29 محلول حمض الهيدروفلوريك. ثم، تشغيل ثابت من 3.7 مللي امبير في سنتيمتر مربع لمدة 250 ثانية.بمجرد الانتهاء من الحفر ، وإزالة الخلية من الدائرة. قد يكون لطبقة السيليكون المسامية تموجات مرئية، مما يشير إلى انفصالها عن رقاقة السيليكون البلورية. غسل بلطف من محلول حمض الهيدروفلوريك، وشطف ثلاث مرات كل مع الإيثانول والماء.باستخدام طرف ماصة، الكراك بحزم محيط طبقة السيليكون المسامية فصاعدة كاملة. باستخدام الإيثانول، وجمع شظايا السيليكون المسامية، أو رقائق، من خلية حفر تفلون في قارب وزنها. ثم، نقل رقائق إلى قارورة زجاجية للتخزين.بعد ذلك، استبدل الإيثانول في القارورة الزجاجية التي تحتوي على رقائق السيليكون المسامية بمليلترين من المياه الخالية من RNase. سقف بحزم وختم القارورة باستخدام بارا فيلم. وضع الزجاج القارورة في حمام سونيكاتور وعلقت بحيث يتم غمر حجم رقائق السيليكون مسامية تماما تحت سطح حمام الماء.لمنع فقدان المياه كبيرة أثناء سونيكيشن، وضع قارورة الحجمي مليئة بالماء، مقلوب بحيث يلامس فتح قارورة سطح حمام الماء. ثم، سونيكات رقائق السيليكون المسامية لمدة 12 ساعة في 35 كيلوهيرتز مع قوة الترددات اللاسلكية من 48 واط. بعد صوتنة، ضع قارورة الزجاج على سطح مستو لمدة ساعة واحدة للسماح للجسيمات الأكبر أن تستقر في القاع.ثم، وجمع الماغن باستخدام ماصة. في قارورة الزجاج، إضافة 72.55 ميكرولترات من حل DMPC، 15.16 ميكرولتررز من حل DSPE-PEG، و 19.63 ميكرولترات من الحل DOTAP، ومزيج عن طريق الأنابيب. ضع القارورة في غطاء دخان مع غطاء فضفاض للسماح للمذيبات بالتبخر بين عشية وضحاها.سيكون الفيلم المجفف مادة غائمة، صلبة، تشبه الهلام في الجزء السفلي من القارورة. المقبل، وضع أنبوب microcentrifuge تحتوي على 150 ميكرولترات من الجسيمات النانوية السيليكون مسامية في حمام سونيكيشن المثلج أعدت سابقا. تحت ultrasonication 15 دقيقة، ماص بلطف 150 ميكرولتر من الرنا و 700 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم اثنين من المولور في الجسيمات النانوية السيليكون المسامية.إزالة أنبوب يحتوي على ملليلتر واحد من جسيمات نانوية السيليكون المسامية محملة بالكالسيوم من سونيكاتور. ملء بواكير واسعة مع المياه الأيونية. نقع غشاء البولي وأربعة مرشح يدعم عن طريق تعويم لهم على سطح الماء.ثم، تجميع مجموعة بثق الدهون عن طريق اتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، هيدرات فيلم الدهون المجففة في القارورة الزجاجية مع ملليلتر واحد من جسيمات السيليكون النانوية المسامية المحملة بالكالسيوم التي تحملها السيلنا. الماصات حتى يتم رفع جميع الدهون من الجزء السفلي من القارورة ويتم ملاحظة حل غائم ومتجانس.إضافة شريط التحريك المغناطيسي إلى القارورة الزجاجية، ووضع القارورة على لوحة ساخنة لتسخين الجسيمات إلى 40 درجة مئوية في حين اثارة المغناطيسي الحل لمدة 20 دقيقة. بعد هذا، إرفاق حقنة فارغة إلى جانب واحد من الطارد. ثم، ملء حقنة أخرى مع ملليلتر واحد من محلول جسيمات السيليكون النانوية المسامية المغلفة بالدهون، وإرفاق الحقنة إلى الجانب الآخر من الطارد.ابدأ البثق عن طريق دفع المكبس ببطء لدفع الجسيمات من حقنة واحدة ، من خلال الغشاء البولي ، وإلى الحقنة الأخرى. كرر 20 مرة. ثم، وجمع الجسيمات مقذوف في أنبوب microcentrifuge.إعداد مخزون الببتيد مع تركيز ببتيد واحد ملليغرام لكل ملليلتر في المياه الخالية من RNase. في أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على جسيمات نانوية السيليكون المسامية المغلفة بالدهون المكسوة بالدهونية، أضف 100 ميكرولترات من مخزون الببتيد، والماصات بلطف. الحفاظ على أنبوب ثابت في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.لإزالة الببتيد الزائد أو الرنا وغيرها من سواغ، يغسل في مرشح الطرد المركزي 30 كيلودالتون عن طريق الغزل في 5، 000 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. جهاز طرد مركزي مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تحت نفس الإعدادات. بعد الطرد المركزي، resuspend النهائي الببتيد مترافق الدهون مترافق مسامية الدهون جسيمات نانوية مسامية في PBS في التركيز المطلوب.ويمكن أن تكون الجزيئات aliquoted وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل. وينبغي أن ينتج عن توليف ناجح للجسيمات النانوية السيليكونية المسامية المذابة حلًا متجانسًا مبهمًا بعض الشيء قد يتم تخزينه لمدة 30 يومًا وذوبانه دون التسبب في تغييرات هيكلية. وقد يؤدي الفشل في تحسين النسبة والتركيز، وكذلك دورات التجميد والذوبان المتكررة إلى التجميع عند التحميل.كما هي مقذوف الجسيمات، وينبغي أن يكون متوسط قطر هيدرودينامية من الجسيمات النانوية السيليكون مسامية fusogenic تقاس بتشتت الضوء الحيوي ما يقرب من 200 نانومتر ومتوسط زيتا المحتملة تقريبا إيجابية سبعة ملليفولت. بعد تعديل السطح مع الببتيدات المستهدفة، يجب أن يكون القطر الإجمالي أقل من 230 نانومتر، وينخفض متوسط إمكانات زيتا إلى ناقص 3.4 ملليفولت. يمكن تأكيد الانصهار عن طريق وضع العلامات على الدهون fusogenic مع الفلوروفور الدهنية DiI ومراقبة في التعريب في المختبر باستخدام المجهر confocal.ويلاحظ الانصهار الناجح عندما الدهون في جسيمات السيليكون النانوية المسامية fusogenic نقل DiI إلى غشاء البلازما و مترجم مستقلة عن lysosomes. سوف تظهر الانصهار غير ناجحة توطين DiI داخل السيتوبلازم الخلية والتعريب المشترك مع lysosomes. هذا النظام النانوي fusogenic الآن تستخدم للتطبيقات العلاجية في الالتهابات البكتيرية ليس فقط ولكن أيضا في العلاج السرطان المساعد والعلاج المناعي للسرطان.قد يكون هذا البروتوكول الأمثل لتحميل أكثر من siRNAs. وقد أظهر نظام الجسيمات النانوية fusogenic إمكانات في تحميل وتسليم حمولات أنيونية أكبر حجما، مثل MRNAs ومجمعات CRISPR/Cas9.

Research

JoVE Journal

Engineering

Optical Trapping of Nanoparticles

البصرية محاصرة من الجسيمات النانوية

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

التوليف وFunctionalization من النيتروجين مخدر الكؤوس الأنابيب الجزيئية الكربونية مع جزيئات الذهب كما سدادات الفلين

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Monolayer Contact Doping of Silicon Surfaces and Nanowires Using Organophosphorus Compounds

الاتصال أحادي الطبقة المنشطات من السيليكون السطوح والأسلاك المتناهية الصغر عن طريق المركبات الفوسفورية العضوية

Monolayer Contact Doping (MLCD) is a simple method for doping of surfaces and nanostructures1. MLCD results in the formation of highly controlled, ultra ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

انتقائية المساحة تعديل السيليكون بلل السطح بواسطة الليزر النبضي للأشعة فوق البنفسجية تشعيع في البيئة السائلة

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Silicon Metal-oxide-semiconductor Quantum Dots for Single-electron Pumping

السيليكون المعدنية أكسيد أشباه الموصلات الكم النقاط لالضخ وحيد الإلكترون

As mass-produced silicon transistors have reached the nano-scale, their behavior and performances are increasingly affected, and often deteriorated, by ...

Synthesis and Functionalization of 3D Nano-graphene Materials: Graphene Aerogels and Graphene Macro Assemblies

التوليف وFunctionalization من 3D مواد النانو الجرافين: الجرافين Aerogels والجرافين جمعيات الكلية

Efforts to assemble graphene into three-dimensional monolithic structures have been hampered by the high cost and poor processability of graphene. ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

دمج ضوء الاصطياد الفضة النانوية في مهدرج الجريزوفولفين سيليكون الخلايا الشمسية عن طريق التحويل الطباعة

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

في الموقع توليف الذهب النانوية دون تجميع في الفضاء البينية من الطبقات ملح التيتان أفلام شفافة

Combinations of metal oxide semiconductors and gold nanoparticles (AuNPs) have been investigated as new types of materials. The in situ synthesis of AuNPs ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

إثراء وتوسيع نطاق خلايا نادرة محددة مستضد تي مع جسيمات نانوية مغناطيسية

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Procedure for the Transfer of Polymer Films Onto Porous Substrates with Minimized Defects

إجراءات نقل أفلام البوليمر إلى ركائز مسامية مع عيوب أقل

The fabrication of devices containing thin film composite membranes necessitates the transfer of these films onto the surfaces of arbitrary support ...