Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health gennem kontrakt # R01 AI132413-01.

1. Sammenfatning af porøs silicium nanopartikler (pSINPs)
Forsigtig: Brug altid forsigtig, når du arbejder med flussyre (HF). Følg alle sikkerheds guider ifølge sin sikkerhedsdatablad (SDS), håndtere enhver HF-indeholdende kemikalier i et stinkskab og bære passende personlige værnemidler (PPE, dobbelt handsker med butyl handsker på ydersiden, butyl forklæde med laboratoriekittel nedenunder, ansigt skjold med beskyttelsesbriller nedenunder). Alle universiteter og R & D laboratorier kræv...

<ol>
	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications.">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li><li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+gene+editing:+delivery+and+regulatory+perspectives.">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).</li><li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs.">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li><li>Dai, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

Syntese af porøs silicium nanopartikler er vist i figur 5. Den kritiske trin i syntesen af fusogenic pSiNPs er i lastning trin (trin 3). Hvis fusogenic nanopartikler sammenlægning efter syntese (figur 3), årsagen kan skyldes følgende: (1) calciumchlorid lager blev ikke homogen måde forberedt, således skridt 3.1.2 skal være omhyggeligt fulgt eller raffineret; eller (2) forholdet mellem pSiNP: siRNA: CaCl2 eller koncentrationen af et eller flere ...

Genterapi modulerer specifikke genekspression for at opnå en terapeutisk resultatet. Mange værktøjer til gen graduering er blevet opdaget og undersøgt, herunder ribonukleinsyre interferens (RNAi) ved hjælp af oligonukleotider (f.eks. korte interfererende RNA (siRNA)1,2, mikroRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmider5,6, nukleaser (f.eks. zink finger, TALENS)7,8, og CRISPR/Cas9 systems9,10. Mens hver værktøjets virkningsmekanisme er forskellig, skal alle værktøjerne nå cellens cytoplasma eller kerne at være aktive. Som sådan, mens disse værktøjer har vist sig for at fremkalde signifikant effekt i modulerende genekspression in vitro, lider in vivo effekten af ekstracellulære og intracellulære forhindringer. Skyldes, at værktøjerne er af biologisk oprindelse, findes mange enzymer og clearance systemer i vores krop, der har evnen til at nedbryde eller fjerne fremmede molekyler11. Selv i tilfældet lider at værktøjerne nå målcellen, de af endocytose; en tilstand af cellulære optagelse, der indkapsler og fælder værktøjer i sure maven-lignende blærer, der nedbrydes eller udvise værktøjer ud af cellen. Undersøgelser har faktisk vist sig at lipid nanopartikler er endocytosed via macropinocytosis, hvorfra omkring 70% af siRNA er exocytosed fra celler inden for 24 timer af optagelsen12,13. Fleste af de resterende siRNA er nedbrudt gennem den lysosomale vej, og i sidste ende kun 1-2% af den siRNA, der i første omgang kommer ind i cellen med nanopartikler opnå endosomal undslippe underkastes potentielt RNAi13,14 .
Vi har for nylig udviklet fusogenic porøs silicium nanopartikler (F-pSiNPs), har en siRNA-loaded kerne består af porøs silicium nanopartikler, og en fusogenic lipid shell15. F-pSiNPs præsentere tre store fordele i forhold til andre konventionelle oligonukleotid levering systemer: (1) en fusogenic lipid belægning, som gør det muligt for partikler til at omgå endocytose og levere hele nyttelasten direkte i cellen cytoplasma (versus 1-2% opnået ved endocytosed partikler13,14) (figur 1); (2) høje masse lastning af siRNA i pSiNPs (> 20 wt % i forhold til 1-15 wt % af konventionelle systemer)15, der hurtigt nedbrydes i cytoplasma (når core partikler kaste lipid belægning via fusogenic optagelse) for at frigive siRNA; og (3) målretning peptid konjugation for selektiv homing til ønskede celletyper in vivo.
F-pSiNP-systemet har demonstreret betydelige genhæmning effektivitet (> 95% in vitro-; > 80% in vivo) og efterfølgende terapeutiske effekt i en alvorlig musemodel af S. aureus lungebetændelse; resultaterne af som blev offentliggjort tidligere15. Den komplekse struktur af F-pSiNP system kræver dog fine håndtering og finjusteres optimering til at generere ensartet og stabil nanopartikler. Formålet med dette arbejde er således, at fremlægge en grundig protokol samt optimeringsstrategier for syntese, functionalization og karakterisering af F-pSiNPs anvendes i målrettet levering af siRNAs til potente gene silencing effekt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

Med fremkomsten af genterapi, er udviklingen af en effektiv in vivo nukleotid-nyttelast levering system blevet parallel import. Fusogenic porøs silicium nanopartikler (F-pSiNPs) har for nylig demonstreret høj in vivo genhæmning effektivitet på grund af sin høje oligonukleotid lastning kapacitet og unikke cellulære optagelse pathway, der undgår endocytose. Syntesen af F-pSiNPs er en multi-trins proces, der omfatter: (1) indlæsning og forsegling af oligonukleotid nyttelast i silicon porer; (2) samtidige belægning og dimensionering af fusogenic lipider omkring porøs silicium kerner; og (3) konjugation af målretning peptider og vask for at fjerne overskydende oligonukleotid, silicium debris og peptid. Den partikel størrelse ensartethed er præget af dynamisk lysspredning, og dens kerne-shell struktur kan verificeres ved transmissions Elektron Mikroskopi. Fusogenic optagelse er valideret ved at indlæse en lipofile farvestof, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat (DiI), i fusogenic lipid tolagede og behandler det til celler in vitro-at observere for plasma membran farvning endocytic lokaliseringer. Målretning og in vivo gene silencing efficacies var tidligere tal i en musemodel af Staphylococcus aureus lungebetændelse, hvori den målretning peptid forventes at hjælpe F-pSiNPs til hjem til infektionsstedet. Ud over dets anvendelse i S. aureus infektion, kan F-pSiNP system bruges til at levere enhver oligonukleotid for genterapi for en bred vifte af sygdomme, herunder virusinfektioner, kræft og autoimmune sygdomme.

En vellykket syntese af fusogenic pSiNPs skal producere en homogen, lidt uigennemsigtig løsning (figur 3a). Undladelse af at optimere forholdet og koncentration af pSiNPs: siRNA: CaCl2 kan føre til sammenlægning efter indlæsning (figur 3b). Da partiklerne er ekstruderet gennem 200 nm membraner, hydrodynamiske gennemsnitsdiameteren på den fusogenic pSiNPs målt ved DLS bør være ca. 200 nm, og den gennemsnitlige z...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Vi demonstrere syntesen af fusogenic porøs silicium nanopartikler til effektiv in vitro- og in vivo oligonukleotid levering. Porøs silicium nanopartikler er lastet med siRNA til kernen, som er belagt med fusogenic lipider gennem ekstrudering at danne skallen. Målretning gruppe functionalization og partikel karakterisering er inkluderet.

Syntese, Functionalization og karakterisering af Fusogenic porøs silicium nanopartikler til oligonukleotid levering

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

Denne protokol beskriver syntesen af et nanopartikelsystem, der er i stand til at lukke munden på gener in vivo ved at levere siRNA'er med høj effektivitet. Ved blot at udveksle målretning peptid og siRNA nyttelast, kan de fusogenic nanopartikler bruges som en potentiel terapeutisk formulering for sygdomme, der kræver in vivo gen modulering. Vi har tidligere offentliggjort resultater ved hjælp af fusogen nanoplatform mod gram-positive bakterielle infektioner ved at lukke et gen, der koder for betændelse i makrofager til at opsige kronisk inflammation.Før denne procedure udføres, samles en Teflon-ætscelle med en siliciumwafer i en tre-til-en flussyreopløsning. Der køres en vekselstrøm af en kvadratisk bølgeform med en lav strømtæthed på 50 milliampere pr. centimeter, der er kvadreret i 0,6 sekunder, og en høj strømtæthed på 400 milliampere pr. centimeter, der er vadfet i 0,36 sekunder gentaget i 500 cyklusser. Når ætsningen er færdig, fjernes cellen fra kredsløbet, og flussyreopløsningen skylles forsigtigt ud med en sprøjte.Skyl derefter tre gange med ethanol. For at løfte det porøse lag fra siliciumwaferen skal du først fylde ætscellens brønd med 10 milliliter en en-til-29 flussyreopløsning. Derefter køre en konstant på 3,7 milliampere per centimeter kvadreret i 250 sekunder.Når ætsning er færdig, skal du fjerne cellen fra kredsløbet. Det porøse siliciumlag kan have synlige krusninger, hvilket indikerer løsrivelse fra den krystallinske siliciumwafer. Vask forsigtigt flussyreopløsningen ud, og skyl tre gange hver med ethanol og vand.Ved hjælp af en pipettespids, fast knæk omkredsen af den porøse silicium lag for en komplet løsrivelse. Ved hjælp af ethanol indsamles de porøse siliciumfragmenter eller spåner fra Teflon-ætscellen i en vejebåd. Derefter overføres spånerne til et glashætteglas til opbevaring.Dernæst erstatte ethanol i glas hætteglas, der indeholder porøse silicium chips med to milliliter RNase-frit vand. Hætteglasset med Parafilm skal forsegles og forsegles. Anbring glashætteglasset i et sonikatorbad, og ophæng så meget, at mængden af porøse siliciumspåner er helt nedsænket under vandbadets overflade.For at undgå betydeligt vandtab under sonikering anbringes en målekolbe fyldt med vand, der er omvendt, således at kolbens åbning berører vandbadets overflade. Derefter sonikere de porøse silicium chips i 12 timer ved 35 kilohertz med en RF effekt på 48 watt. Efter sonikering skal glashætteglasset sættes på en flad overflade i en time, så de større partikler kan sætte sig fast i bunden.Derefter indsamle supernatant ved hjælp af en pipette. I et glashætteglas tilsættes 72,55 mikroliter DMPC-opløsning, 15,16 mikroliter DSPE-PEG-opløsning og 19,63 mikroliter DOTAP-opløsning, og der blandes ved pipettering. Anslæm hætten i en røghætte med en løs hætte, så opløsningsmidlet kan fordampe natten over.Den tørrede film vil være en overskyet, hård, gel-lignende stof i bunden af hætteglasset. Dernæst placere en mikrocentrifuge rør, der indeholder 150 mikroliter af porøse silicium nanopartikler i en tidligere forberedt iced sonikering bad. Under en 15-minutters ultralydbehandling pipetter forsigtigt 150 mikroliter siRNA og 700 mikroliter af to-molar calciumchlorid ind i de porøse silicium nanopartikler.Fjern røret, der indeholder en milliliter siRNA-belastet calcium-belagt porøs silicium nanopartikler fra sonicator. Fyld et bredt bægerglas med deioniseret vand. Læg en polycarbonatmembran i blød og fire filterstøtter ved at flyde dem på vandoverfladen.Derefter samle en liposom ekstrudering kit ved at følge producentens anvisninger. Dernæst fugte den tørrede lipidfilm i glashætteglasset med en milliliter af de siRNA-belastede calciumbelagte porøse silicium nanopartikler. Pipette, indtil alle lipider er løftet fra bunden af hætteglasset, og der observeres en uklar, homogen opløsning.Tilsæt en magnetisk omrøring bar til glas hætteglasset, og læg hætteglasset på en varmeplade til at opvarme partiklerne til 40 grader Celsius, mens magnetisk omrøring opløsningen i 20 minutter. Derefter fastgøres en tom sprøjte til den ene side af ekstruderen. Derefter fyldes en anden sprøjte med en milliliter af lipid-belagt porøs silicium nanopartikel opløsning, og fastgør sprøjten til den anden side af ekstruderen.Ekstruderingen påbegyndes ved langsomt at skubbe stemplet ind for at skubbe partiklerne fra den ene sprøjte, gennem polycarbonatmembranen og ind i den anden sprøjte. Gentag 20 gange. Derefter indsamles de ekstruderede partikler i et mikrocentrifugerør.Forbered et peptid lager med en one-milligram-per-milliliter peptid koncentration i RNase-fri vand. I mikrocentrifugerøret, der indeholder de fusogeniske lipidbelagte porøse siliciumnanopartikler, tilsættes 100 mikroliter af peptidbestanden, og pipette forsigtigt. Hold røret statisk ved stuetemperatur i 20 minutter.For at fjerne overskydende peptid eller siRNA og andre hjælpestoffer vaskes i et 30-kilodalton centrifugalfilter ved at dreje ved 5.000 gange g ved stuetemperatur i en time. Centrifuge to gange mere med en milliliter PBS under de samme indstillinger. Efter centrifugering, resuspenderede den endelige peptid-konjugerede fusogenic lipid-belagt porøse silicium nanopartikler i PBS ved den ønskede koncentration.Partiklerne kan aliquoted og opbevares ved minus 80 grader Celsius i mindst 30 dage. En vellykket syntese af fusogene porøse silicium nanopartikler bør producere en homogen, let uigennemsigtig opløsning, der kan opbevares i 30 dage og optøes uden at forårsage strukturelle ændringer. Manglende optimering af forholdet og koncentrationen samt gentagne fryse-tø cykler kan føre til sammenlægning ved belastning.Da partiklerne ekstruderes, bør den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter af de fusogene porøse siliciumnanopartikler målt ved dynamisk lyssprælde være ca. 200 nanometer og det gennemsnitlige zetapotentiale ca. positive syv millivolt. Efter overflade modifikation med målretning peptider, bør den samlede diameter være mindre end 230 nanometer, og den gennemsnitlige zeta-potentiale falder til minus 3,4 millivolt. Fusion kan bekræftes ved at mærke de fusogeniske lipider med lipofile fluorophore DiI og observere in vitro lokalisering ved hjælp af konfokal mikroskopi.Vellykket fusion observeres, når den fusogene porøse silicium nanopartikel's lipider overføre DiI til plasmamembranen og er lokaliseret uafhængigt af lysosomer. Mislykket fusion vil vise DiI lokalisering inden for cellens cytoplasma og co-lokalisering med lysosomer. Dette fusogeniske nanopartikelsystem anvendes nu til terapeutiske anvendelser i ikke kun bakterielle infektioner, men også i kræft adjuverende behandling og kræftimmunterapi.Denne protokol kan optimeres yderligere til at indlæse mere end siRNA'er. Det fusogeniske nanopartikelsystem har vist potentiale i lastning og levering af større anioniske nyttelast, såsom mRNAs og CRISPR/Cas9-komplekser.

Research

JoVE Journal

Engineering

Optical Trapping of Nanoparticles

Optisk diffusering af nanopartikler

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

Syntese og Funktionalisering af Nitrogen-doped kulstof nanorør Cups med guld nanopartikler som korkpropper

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Monolayer Contact Doping of Silicon Surfaces and Nanowires Using Organophosphorus Compounds

Enkeltlags Kontakt doping af silicium overflader og nanotråde Brug organophosphorforbindelser

Monolayer Contact Doping (MLCD) is a simple method for doping of surfaces and nanostructures1. MLCD results in the formation of highly controlled, ultra ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

Selektiv Area Ændring af Silicon overfladebefugtelighed af Pulsed UV laser Bestråling i Liquid Miljø

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Silicon Metal-oxide-semiconductor Quantum Dots for Single-electron Pumping

Silicium-oxid-halvleder Quantum Dots for Single-elektron Pumpning

As mass-produced silicon transistors have reached the nano-scale, their behavior and performances are increasingly affected, and often deteriorated, by ...

Synthesis and Functionalization of 3D Nano-graphene Materials: Graphene Aerogels and Graphene Macro Assemblies

Syntese og Funktionalisering af 3D Nano-graphene Materialer: Graphene Aerogeler og Graphene Macro forsamlinger

Efforts to assemble graphene into three-dimensional monolithic structures have been hampered by the high cost and poor processability of graphene. ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

Integration af Light fældefangst Sølv Nanostrukturer i hydrogeneret Mikrokrystallinsk silicium solceller ved Transfer Printing

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Syntese af Gold Nanopartikler uden Sammenlægning i mellemlaget Space of Layered titanat Gennemsigtige Films

Combinations of metal oxide semiconductors and gold nanoparticles (AuNPs) have been investigated as new types of materials. The in situ synthesis of AuNPs ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Berige og udvide sjældne Antigen-specifikke T-celler med magnetisk nanopartikler

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Procedure for the Transfer of Polymer Films Onto Porous Substrates with Minimized Defects

Procedure for overførsel af polymer film på porøse substrater med minimerede defekter

The fabrication of devices containing thin film composite membranes necessitates the transfer of these films onto the surfaces of arbitrary support ...