Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health à travers contrat no R01 AI132413-01.

1. synthèse de nanoparticules de silicium poreux (pSINPs)
Attention : Soyez toujours prudent lorsque vous travaillez avec de l’acide fluorhydrique (HF). Suivez tous les guides de sécurité selon sa fiche de données de sécurité (SDS), gérer les produits chimiques contenant du HF dans une hotte aspirante et porter les équipements de protection individuelle appropriés (PPE, gants doubles avec gants butyl sur l’extérieur, tablier de butyle avec blouse en dessous, visage protéger avec ...

<ol>
	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications.">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li><li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+gene+editing:+delivery+and+regulatory+perspectives.">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).</li><li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs.">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li><li>Dai, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

Synthèse de nanoparticules de silicium poreux est illustrée à la Figure 5. L’étape critique dans la synthèse des pSiNPs coniques est à l’étape de chargement (étape 3). Si les nanoparticules fusogène agrégez post-synthèse (Figure 3), la raison peut être en raison de ce qui suit : (1) actions de chlorure de calcium ne préparait pas homogène, donc étape 3.1.2 doit être soigneusement suivi ou raffiné ; ou (2) le rapport de pSiNP : siARN : Ca...

Thérapie génique module l’expression de gènes spécifiques afin d’obtenir un résultat thérapeutique. Nombreux outils pour la modulation de gène ont été découverts et étudiés, y compris l’acide ribonucléique interférence (Arni) utilisant des oligonucléotides (p. ex., court interférence ARN (siRNA)1,2, microARN (miARN)3,4 ), ADN plasmides5,6, nucléases (p. ex., doigt de zinc, TALENS)7,8et CRISPR/Cas9 systèmes9,10. Alors que le mécanisme de chaque outil d’action est différent, tous les outils doivent parvenir à cytoplasme de la cellule ou le noyau actif. Ainsi, alors que ces outils se sont avérés pour induire un effet significatif dans la modulation de l’expression génique in vitro, l’efficacité in vivo souffre d’obstacles extracellulaires et intracellulaires. Dû au fait que les outils sont d’origine biologique, plusieurs enzymes et les systèmes d’autorisation existent dans notre corps qui ont la capacité de dégrader ou de supprimer les molécules étrangères11. Même dans le cas que les outils atteignent la cellule cible, ils souffrent d’endocytose ; un mode d’absorption cellulaire qui encapsule et emprisonne les outils dans les vésicules d’estomac comme acides qui se dégradent ou expulser les outils hors de la cellule. En fait, les études ont montré que les nanoparticules lipidiques sont mégacaryocyte via macropinocytose, dont environ 70 % de des siARN sont exocytosed des cellules dans les 24h d’absorption12,13. La majorité des siARN restant est dégradée par la voie lysosomiale, et en fin de compte que 1 à 2 % des siARN qui initialement pénètre dans la cellule avec les nanoparticules atteindre évasion endosomal potentiellement subir Arni13,14 .
Nous avons récemment développé des nanoparticules de silicium poreux fusogène (F-pSiNPs) qui ont un noyau chargés en siARN composé de nanoparticules de silicium poreux et un fusogène lipides coquille15. Les F-pSiNPs présente trois avantages majeurs sur les autres vecteurs d’oligonucléotide classiques : (1) un lipide fusogène revêtement qui permet aux particules de contourner l’endocytose et distribuer la surcharge ensemble directement dans le cytoplasme des cellules (contre le 1-2 % réalisé par mégacaryocyte particules13,14) (Figure 1) ; (2) haute emplissage de siARN dans la pSiNPs (> 20 % en poids par rapport à 1-15 % en poids par les systèmes conventionnels)15, qui dégradent rapidement dans le cytoplasme (une fois que les particules de base versé la couche lipidique via fusogène absorption) pour libérer le siARN ; et (3) ciblant la conjugaison de peptide pour domiciliation sélective à désiré types cellulaires in vivo.
Le système F-pSiNP a démontré le silençage efficacité de gènes importants (> 95 % in vitro ; > 80 % in vivo) et un effet thérapeutique ultérieur dans un modèle de souris mortel de pneumonie à Staphylococcus aureus ; les résultats qui ont été publiées auparavant15. Cependant, la structure complexe du système F-pSiNP suppose une manipulation délicate et optimisation adaptée pour générer des nanoparticules homogène et stables. Ainsi, le but de ce travail est de présenter un protocole complet, ainsi que des stratégies d’optimisation pour la synthèse, fonctionnalisation et caractérisation de F-pSiNPs à utiliser dans l’administration ciblée des siRNAs pour un effet puissant gène silencieux.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

Avec l’avènement de la thérapie génique, le développement d’un système de livraison efficace in vivo nucléotide-charge utile est devenu d’importation parallèle. Nanoparticules de silicium poreux Fusogène (F-pSiNPs) ont récemment démontré des gènes in vivo haute silence efficacité en raison de sa haute oligonucléotide chargement de capacité et la voie d’absorption cellulaire unique qui évite l’endocytose. La synthèse de F-pSiNPs est un processus multi-étapes qui comprend : (1) chargement et la fermeture des oligonucléotides charges utiles dans les pores de silicium ; (2) simultanée de revêtement et de dimensionnement des lipides coniques autour les carottes de silicium poreux ; et (3) la conjugaison de ciblage de peptides et de lavage pour éliminer les excès oligonucléotide, débris de silicium et le peptide. Uniformité de taille de la particule se caractérise par la diffusion dynamique de la lumière, et sa structure de noyau-enveloppe peut être vérifiée par microscopie électronique à transmission. L’absorption de fusogène est validée en chargeant un lipophile teindre, 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI), dans la bicouche lipidique fusogène et traitant aux cellules in vitro d’observer pour la coloration par rapport à la membrane plasmique localisations endocytose. L’efficacité de silencieux de gène ciblage et in vivo ont été quantifiées précédemment dans un modèle murin de pneumonie à Staphylococcus aureus , dans lequel le peptide de ciblage devrait aider le F-pSiNPs à domicile pour le site de l’infection. Au-delà de son application dans l’infection à Staphylococcus aureus , le système F-pSiNP peut servir à livrer un oligonucléotide pour la thérapie génique d’un large éventail de maladies, y compris les infections virales, le cancer et les maladies auto-immunes.

Une synthèse réussie des coniques pSiNPs devrait produire une solution homogène, légèrement opaque (Figure 3 a). Échec d’optimiser le ratio et la concentration de pSiNPs : siARN : CaCl2 peut conduire à l’agrégation lorsqu’il se charge (Figure 3 b). Comme les particules sont extrudés à travers les 200 membranes nm, le diamètre moyen hydrodynamique de la pSiNPs fusogène mesurée par DLS devrait être ...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Nous démontrons la synthèse de nanoparticules de silicium poreux fusogène pour livraison efficace oligonucléotide in vitro et in vivo. Nanoparticules de silicium poreux sont chargés avec des siARN pour former le noyau, qui est recouvert par les lipides fusogène par extrusion pour former la coquille. Ciblage portion fonctionnalisation et caractérisation des particules sont inclus.

Synthèse, fonctionnalisation et caractérisation de nanoparticules de silicium poreux Fusogène pour la livraison de l’oligonucléotide

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

Ce protocole décrit la synthèse d’un système de nanoparticules capable de faire taire les gènes in vivo en fournissant des siARN avec une grande efficacité. En échangeant simplement le peptide de ciblage et la charge utile de siRNA, les nanoparticules fusogéniques peuvent être employées comme formulation thérapeutique potentielle pour des maladies qui exigent la modulation in vivo de gène. Nous avons déjà publié des résultats utilisant le nanoplateforme fusogénique contre les infections bactériennes gram-positives en faisant taire un gène qui code pour l’inflammation dans les macrophages pour mettre fin à l’inflammation chronique.Avant d’effectuer cette procédure, assemblez une cellule d’échage de téflon contenant une plaquette de silicium dans une solution d’acide fluorhydrique trois contre un. Exécutez un courant alternatif d’une forme d’onde carrée avec une faible densité de courant de 50 milliamperes par centimètre au carré pendant 0,6 seconde et une densité de courant élevée de 400 milliamperes par centimètre au carré pendant 0,36 seconde répétée pendant 500 cycles. Une fois la gravure terminée, retirer la cellule du circuit et rincer soigneusement la solution d’acide fluorhydrique à l’aide d’une seringue.Rincez ensuite trois fois à l’éthanol. Pour enlever la couche poreuse de la plaquette de silicium, remplissez d’abord le puits de la cellule d’échage de 10 millilitres d’une solution d’acide fluorhydrique d’un à 29. Ensuite, exécutez une constante de 3,7 milliamperes par centimètre au carré pendant 250 secondes.Une fois la gravure terminée, retirez la cellule du circuit. La couche poreuse de silicium peut avoir des ondulations visibles, indiquant le détachement de la gaufrette cristalline de silicium. Laver délicatement la solution d’acide fluorhydrique et rincer trois fois chacun avec de l’éthanol et de l’eau.À l’aide d’une pointe de pipette, fendre fermement la circonférence de la couche de silicium poreux pour un détachement complet. À l’aide d’éthanol, recueillir les fragments de silicium poreux, ou copeaux, de la cellule d’échasse de Téflon dans un bateau de pesage. Ensuite, transférez les copeaux sur un flacon de verre pour le stockage.Ensuite, remplacez l’éthanol dans le flacon de verre contenant les copeaux de silicium poreux par deux millilitres d’eau sans RNase. Fermement capuchon et sceller le flacon à l’aide de Parafilm. Placez le flacon de verre dans un bain sonicateur et suspendu de telle sorte que le volume de copeaux de silicium poreux sont complètement immergés sous la surface du bain d’eau.Pour éviter une perte d’eau importante pendant la sonication, placez un flacon volumétrique rempli d’eau, inversé de sorte que l’ouverture du flacon touche la surface du bain d’eau. Puis, sonicate les puces de silicium poreux pendant 12 heures à 35 kilohertz avec une puissance RF de 48 watts. Après la sonication, placez le flacon de verre sur une surface plane pendant une heure pour permettre aux particules plus grosses de se déposer au fond.Ensuite, recueillir le surnatant à l’aide d’une pipette. Dans un flacon de verre, ajouter 72,55 microlitres de solution DMPC, 15,16 microlitres de solution DSPE-PEG, et 19,63 microlitres de solution DOTAP, et mélanger par pipetting. Placez le flacon dans un capot de fumée avec un capuchon lâche pour permettre au solvant de s’évaporer pendant la nuit.Le film séché sera une substance nuageuse, dure, gel-like au fond du flacon. Ensuite, placez un tube de microcentrifugeuse contenant 150 microlitres de nanoparticules de silicium poreux dans un bain de sonication glacée préparé précédemment. Sous ultrasonication de 15 minutes, pipette doucement 150 microlitres de siRNA et 700 microlitres de chlorure de calcium bi molaire dans les nanoparticules poreuses de silicium.Retirez le tube contenant un millilitre de nanoparticules poreuses de siRNA recouvertes de calcium du sonicateur. Remplissez un large bécher d’eau déionisée. Faire tremper une membrane en polycarbonate et quatre supports de filtre en les faisant flotter à la surface de l’eau.Ensuite, assemblez un kit d’extrusion liposome en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, hydratez le film lipidique séché dans le flacon de verre avec un millilitre des nanoparticules poreuses de siRNA recouvertes de calcium. Pipette jusqu’à ce que tous les lipides se soient levés du fond du flacon et qu’une solution nuageuse et homogène soit observée.Ajouter une barre magnétique d’agitation au flacon de verre et placer le flacon sur une plaque chauffante pour chauffer les particules à 40 degrés Celsius tout en remuant magnétiquement la solution pendant 20 minutes. Par la suite, fixez une seringue vide d’un côté de l’extrtruder. Ensuite, remplissez une autre seringue d’un millilitre de la solution poreuse de nanoparticules de silicium poreuse enduite de lipides et fixez la seringue de l’autre côté de l’extrème.Commencez l’extrusion en poussant le piston lentement pour pousser les particules d’une seringue, à travers la membrane de polycarbonate, et dans l’autre seringue. Répéter 20 fois. Ensuite, recueillir les particules extrudées dans un tube de microcentrifugeuse.Préparer un bouillon de peptide avec une concentration de peptide d’un milligramme par millilitre dans de l’eau exempte de RNase. Dans le tube de microcentrifugeuse contenant les nanoparticules poreuses de silicium poreuses enrobées de lipides fusogéniques, ajouter 100 microlitres du bouillon de peptide et pipette doucement. Maintenez le tube statique à température ambiante pendant 20 minutes.Pour éliminer l’excès de peptide ou de siRNA et d’autres excipients, lavez-le dans un filtre centrifuge de 30 kilodaltons en tournant à 5000 fois g à température ambiante pendant une heure. Centrifugeuse deux fois de plus avec un millilitre de PBS dans les mêmes réglages. Après centrifugation, resuspendez les nanoparticules poreuses de silicium poreuses conjuguées au peptide final dans PBS à la concentration désirée.Les particules peuvent être aliquoted et stockées à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 30 jours. Une synthèse réussie des nanoparticules poreuses fusogenic de silicium devrait produire une solution homogène et légèrement opaque qui peut être stockée pendant 30 jours et décongelée sans causer des changements structurels. Le défaut d’optimiser le rapport et la concentration, ainsi que les cycles répétés de gel-dégel peuvent conduire à l’agrégation lors du chargement.Comme les particules sont extrudées, le diamètre hydrodynamique moyen des nanoparticules de silicium poreux fusogéniques mesurées par la diffusion dynamique de la lumière devrait être d’environ 200 nanomètres et le potentiel moyen de zéta environ positif sept millivolts. Après modification de surface avec des peptides de ciblage, le diamètre global devrait être inférieur à 230 nanomètres, et le potentiel zeta moyen diminue à moins 3,4 millivolts. La fusion peut être confirmée en étiquetant les lipides fusogéniques avec le fluorophore lipophile DiI et en observant la localisation in vitro à l’aide de microscopie confoccale.Une fusion réussie est observée lorsque les lipides de la nanoparticule de silicium poreux fusogénique transfèrent le DiI à la membrane plasmatique et sont localisés indépendamment des lysosomes. La fusion infructueuse montrera la localisation de DiI dans le cytoplasme de la cellule et la co-localisation avec des lysosomes. Ce système de nanoparticules fusogènes est maintenant utilisé pour des applications thérapeutiques non seulement dans les infections bactériennes, mais aussi dans la thérapie adjuvante contre le cancer et l’immunothérapie contre le cancer.Ce protocole peut être encore optimisé pour charger plus de siARN. Le système de nanoparticules fusogènes a montré un potentiel dans le chargement et la livraison de charges utiles anioniques plus grandes, telles que les ARNH et les complexes CRISPR/Cas9.

Research

JoVE Journal

Engineering

Optical Trapping of Nanoparticles

Le piégeage optique de nanoparticules

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Recherche

Ingénierie

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

Synthèse et fonctionnalisation des dopé à l&#39;azote Coupes de nanotubes de carbone avec des nanoparticules d&#39;or que les bouchons de liège

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Monolayer Contact Doping of Silicon Surfaces and Nanowires Using Organophosphorus Compounds

Monocouche Contactez-dopage du silicium Surfaces et nanofils utilisant des composés organophosphorés

Monolayer Contact Doping (MLCD) is a simple method for doping of surfaces and nanostructures1. MLCD results in the formation of highly controlled, ultra ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

Selective Area Modification de la Silicon mouillabilité de surface par irradiation laser pulsé UV en milieu liquide

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Silicon Metal-oxide-semiconductor Quantum Dots for Single-electron Pumping

Silicium métal-oxyde-semiconducteur Quantum Dots pour le pompage mono-électronique

As mass-produced silicon transistors have reached the nano-scale, their behavior and performances are increasingly affected, and often deteriorated, by ...

Synthesis and Functionalization of 3D Nano-graphene Materials: Graphene Aerogels and Graphene Macro Assemblies

Synthèse et fonctionnalisation des matériaux 3D Nano-graphène graphène: aérogels et graphène assemblées Macro

Efforts to assemble graphene into three-dimensional monolithic structures have been hampered by the high cost and poor processability of graphene. ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

Intégration de la Lumière de piégeage argent Nanostructures dans hydrogénée microcristalline cellules solaires en silicium par impression par transfert

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthèse de nanoparticules d&#39; or sans agrégation dans l&#39;espace intercalaire de Layered titanate Films transparents

Combinations of metal oxide semiconductors and gold nanoparticles (AuNPs) have been investigated as new types of materials. The in situ synthesis of AuNPs ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Procedure for the Transfer of Polymer Films Onto Porous Substrates with Minimized Defects

Procédure pour le transfert de films polymères sur des substrats poreux avec des défauts minimisés

The fabrication of devices containing thin film composite membranes necessitates the transfer of these films onto the surfaces of arbitrary support ...