Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
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Diese Arbeit wird unterstützt durch die National Institutes of Health durch Vertrag # R01 AI132413-01.

1. Zusammenfassung der poröse Silizium-Nanopartikeln (pSINPs)
Achtung: Seien Sie immer vorsichtig, beim Arbeiten mit Fluorwasserstoffsäure (HF). Folgen Sie alle Reiseführer in Sicherheit nach seiner Sicherheitsdatenblatt (SDB) zu, behandeln Sie keine HF-haltigen Chemikalien in einer Dampfhaube und tragen Sie geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PSA, doppelte Handschuhe mit Butyl Handschuhe auf der Außenseite, Butyl-Schürze mit Laborkittel unter Gesicht Schild mit Schutzbrille unter)....

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	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications.">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li><li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+gene+editing:+delivery+and+regulatory+perspectives.">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).</li><li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs.">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li><li>Dai, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

Synthese von porösem Silizium-Nanopartikeln ist in Abbildung 5dargestellt. Der entscheidende Schritt bei der Synthese von Fusogenic pSiNPs ist im Laden Schritt (Schritt 3). Wenn die Fusogenic Nanopartikel aggregieren sind Post-Synthese (Abbildung 3), kann aufgrund der folgenden Gründe geben: (1) Kalzium-Chlorid-Lager war nicht homogen bereit, damit Schritt 3.1.2 muss sorgfältig gefolgt oder verfeinert; oder (2) das Verhältnis der pSiNP: SiRNA: CaCl2</su...

Gentherapie moduliert spezifische Genexpression um ein therapeutisches Ergebnis zu erhalten. Zahlreiche Werkzeuge für gen-Modulation entdeckt und untersucht, einschließlich der Ribonukleinsäure-Interferenz (RNAi) mit Oligonukleotiden (z. B. kurze interferierende RNA (SiRNA)1,2, MicroRNA (MiRNA)3,4 ), DNA Plasmide5,6, Nukleasen (z. B. Zinkfinger, TALENS)7,8und CRISPR/Cas9 Systeme9,10. Während jedes Werkzeug Wirkmechanismus unterscheidet, müssen alle Werkzeuge der Zelle Zytoplasma oder Nucleus aktiv sein erreichen. So, während diese Werkzeuge induzieren signifikanten Effekt Modulation der gen-Expression in vitro nachgewiesen haben, leidet die in-vivo Wirksamkeit extrazellulären und intrazellulären Hindernisse. Da die Werkzeuge der biologischen Ursprungs sind, gibt es viele Enzyme und Abfertigungssysteme in unserem Körper, die Fähigkeit zu degradieren oder fremde Moleküle11zu entfernen. Auch in dem Fall, dass die Werkzeuge die Zielzelle erreichen leiden sie Endozytose; ein Modus der zelluläre Aufnahme, die kapselt und fallen die Werkzeuge im sauren Magen-wie Bläschen, die verschlechtern oder die Werkzeuge aus der Zelle zu vertreiben. In der Tat haben Studien gezeigt, dass Lipid Nanopartikel Endocytosed über Macropinocytosis, von denen etwa 70 % der SiRNA aus den Zellen innerhalb von 24 Stunden nach der Aufnahme12,13exocytosed sind. Der Großteil der verbleibenden SiRNA sind durch die lysosomalen Pathway abgebaut und letztlich erreichen nur 1-2 % der SiRNA, die zunächst die Zelle mit den Nanopartikeln betritt Endosomal Flucht potenziell RNAi13,14 unterziehen .
Wir haben vor kurzem Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln (F-pSiNPs) entwickelt, die einen SiRNA-geladenen Kern bestehend aus porösem Silizium-Nanopartikeln und Fusogenic Lipid Schale15haben. Die F-pSiNPs präsentieren drei große Vorteile gegenüber anderen konventionellen Oligonukleotid-Delivery-Systeme: (1) ein Fusogenic Lipid Beschichtung, wodurch die Teilchen zu umgehen Endozytose und liefern die gesamte Nutzlast direkt in das Zytoplasma der Zelle (im Gegensatz zu den 1 %-2 % erzielt durch Endocytosed Partikel13,14) (Abbildung 1). (2) hohe Masse geladen von SiRNA in der pSiNPs (> 20 Gew.-% im Vergleich zu 1-15 Gew.-% von herkömmlichen Systemen)15, die schnell im Zytoplasma verschlechtern (Sobald die Core-Partikel die Lipid-Beschichtung über Fusogenic Aufnahme Schuppen), lassen Sie die SiRNA; (3) gezielt Peptid Konjugation für selektive Homing, Zelltypen in-vivo gewünscht.
Die F-pSiNP-System hat bedeutende Gen-silencing Wirksamkeit gezeigt (> 95 % in-vitro-; > 80 % in-vivo) und anschließende therapeutische Wirkung in einem tödlichen Mausmodell der S. Aureus -Pneumonie; die Ergebnisse waren vorher15veröffentlicht. Allerdings erfordert die komplexe Struktur des F-pSiNP Systems Feingefühl und fein abgestimmte Optimierung, homogen und beständig Nanopartikel zu generieren. So soll der Zweck dieser Arbeit eine gründliche Protokoll sowie Optimierung von Strategien für die Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von F-pSiNPs in gezielte Bereitstellung von SiRNAs für potente Gen-Silencing-Effekt verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

Mit dem Aufkommen der Gentherapie ist die Entwicklung einer wirksamen in-vivo-Nukleotid-Nutzlast-Delivery-System der Parallelimport geworden. Fusogenic poröse Silizium-Nanopartikeln (F-pSiNPs) haben vor kurzem gezeigt, hohen in-vivo Gen-silencing Wirksamkeit aufgrund seiner hohen Oligonukleotid Tragfähigkeit und einzigartige zelluläre Aufnahme Weg, der Endozytose vermeidet. Die Synthese von F-pSiNPs ist ein mehrstufiger Prozess, der enthält: (1) laden und Abdichtung des Oligonukleotids Nutzlasten in den Silizium-Poren; (2) gleichzeitige Beschichtung und Dimensionierung der Fusogenic Lipide um die poröse Silizium-Kerne; und (3) Konjugation von targeting Peptide und waschen um überschüssige Oligonukleotid, Silizium Schmutz und Peptid zu entfernen. Die Partikel Größe Einheitlichkeit zeichnet sich durch dynamische Lichtstreuung und seine Kern-Schale-Struktur von Transmissions-Elektronenmikroskopie überprüft werden kann. Die Fusogenic-Aufnahme ist durch das Laden eines lipophilen validiert färben, 1, 1'-Dioctadecyl-3,3, 3', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI), in der Fusogenic-Lipid-Bilayer und behandeln Sie es um Zellen in vitro Plasmamembran Färbung im Vergleich zu beobachten endocytic Lokalisierungen. Targeting und in-vivo Gen-Silencing-Wirksamkeiten wurden zuvor in einem Mausmodell der Staphylococcus Aureus Lungenentzündung, quantifiziert in denen targeting Peptid wird voraussichtlich die F-pSiNPs zu Haus, um den Ort der Infektion zu helfen. Über ihre Anwendung in S. Aureus -Infektion kann das F-pSiNP-System zur jeder Oligonukleotid für Gen-Therapie einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich virale Infektionen, Krebs und Autoimmunerkrankungen zu liefern.

Eine gelungene Synthese aus Fusogenic pSiNPs sollte eine homogene, etwas undurchsichtige Lösung (Abbildung 3a) produzieren. Versagen, das Verhältnis und die Konzentration von pSiNPs zu optimieren: SiRNA: CaCl2 Aggregation nach dem Laden (Abb. 3 b) führen kann. Wie die Partikel durch 200 nm Membranen extrudiert werden, sollte die hydrodynamische Durchmesser von der Fusogenic pSiNPs DLS gemessen ca. 200 nm, und die du...

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Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Wir zeigen die Synthese von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für effektive in vitro und in vivo Oligonukleotid-Lieferung. Poröses Silizium-Nanopartikeln sind beladen mit SiRNA den Kern bilden die durch Fusogenic Lipide durch Extrusion die Shell zu bilden beschichtet ist. Targeting glyko-Funktionalisierung und Partikelcharakterisierung sind im Preis inbegriffen.

Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für Oligonukleotid-Lieferung

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese eines Nanopartikelsystems, das in der Lage ist, Gene in vivo zum Schweigen zu bringen, indem siRNAs mit hoher Effizienz geliefert werden. Durch den einfachen Austausch des Targeting-Peptids und der siRNA-Nutzlast können die fusogenen Nanopartikel als potenzielle therapeutische Formulierung für Krankheiten verwendet werden, die eine In-vivo-Genmodulation erfordern. Wir haben bereits Ergebnisse veröffentlicht, die die fusogene Nanoplattform gegen grampositive bakterielle Infektionen verwenden, indem wir ein Gen zum Schweigen bringen, das für Entzündungen in Makrophagen kodiert, um chronische Entzündungen zu beenden.Vor der Durchführung dieses Verfahrens eine Teflon-Ätzzelle, die einen Siliziumwafer enthält, in einer Drei-zu-eins-Lösung für Flusssäure zusammensetzen. Führen Sie einen Wechselstrom einer quadratischen Wellenform mit einer niedrigen Stromdichte von 50 Milliampere pro Zentimeter quadratisch für 0,6 Sekunden und einer hohen Stromdichte von 400 Milliampere pro Zentimeter für 0,36 Sekunden, die für 500 Zyklen wiederholt werden. Sobald die Ätzung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zelle aus dem Kreislauf und spülen Sie die Flusssäurelösung vorsichtig mit einer Spritze aus.Dann dreimal mit Ethanol abspülen. Um die poröse Schicht aus dem Siliziumwafer zu heben, füllen Sie zunächst den Brunnen der Ätzzelle mit 10 Millilitern einer 1-zu-29-Flusssäurelösung. Führen Sie dann eine Konstante von 3,7 Milliampere pro Zentimeter quadratisch für 250 Sekunden aus.Sobald die Ätzung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zelle aus dem Schaltkreis. Die poröse Siliziumschicht kann sichtbare Wellen haben, was auf eine Ablösung vom kristallinen Siliziumwafer hindeutet. Die Flusssäurelösung vorsichtig auswaschen und jeweils dreimal mit Ethanol und Wasser abspülen.Mit einer Pipettenspitze den Umfang der porösen Siliziumschicht fest knacken, um eine vollständige Ablösung zu erhalten. Mit Ethanol die porösen Siliziumfragmente oder Chips aus der Teflon-Ätzzelle in ein Wägeboot zu sammeln. Dann übertragen Sie die Chips auf eine Glasflasche zur Lagerung.Als nächstes ersetzen Sie das Ethanol in der Glasflasche, das die porösen Siliziumchips enthält, durch zwei Milliliter RNase-freies Wasser. Die Durchstechflasche mit Parafilm fest verriegeln und versiegeln. Legen Sie die Glasflasche in ein Beschallungsbad und hängen Sie so, dass das Volumen der porösen Siliziumchips vollständig unter der Oberfläche des Wasserbades untergetaucht ist.Um einen signifikanten Wasserverlust während der Beschallung zu vermeiden, legen Sie einen mit Wasser gefüllten Volumekolben auf, der invertiert ist, so dass die Öffnung des Kolbens die Oberfläche des Wasserbades berührt. Dann beschallen Sie die porösen Siliziumchips 12 Stunden lang bei 35 Kilohertz mit einer HF-Leistung von 48 Watt. Nach der Beschallung die Glasflasche für eine Stunde auf eine flache Oberfläche legen, damit sich die größeren Partikel am Boden absetzen können.Dann sammeln Sie den Überstand mit einer Pipette. In einer Glasdurchstechflasche 72,55 Mikroliter DMPC-Lösung, 15,16 Mikroliter DSPE-PEG-Lösung und 19,63 Mikroliter DOTAP-Lösung hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Legen Sie die Durchstechflasche in eine Dunstabzugshaube mit einer lockeren Kappe, damit das Lösungsmittel über Nacht verdampfen kann.Der getrocknete Film wird eine trübe, harte, gelartige Substanz am Boden der Durchstechflasche sein. Als nächstes legen Sie ein Mikrozentrifugenrohr mit 150 Mikroliterporen porösen Silizium-Nanopartikeln in ein zuvor vorbereitetes Eisbeschallungsbad. Unter einer 15-minütigen Ultraschallation, pipette 150 Mikroliter siRNA und 700 Mikroliter zweimolares Calciumchlorid in die porösen Silizium-Nanopartikel.Entfernen Sie die Tube mit einem Milliliter siRNA-belasteter calciumbeschichteter poröser Silizium-Nanopartikel aus dem Beschallungsmittel. Füllen Sie einen breiten Becher mit entionisiertem Wasser. Einweichen Sie eine Polycarbonatmembran und vier Filterstützen, indem Sie sie auf der Wasseroberfläche schweben.Dann montieren Sie ein Liposomen-Extrusionskit, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Als nächstes hydratisieren Sie den getrockneten Lipidfilm in der Glasdurchstechflasche mit einem Milliliter der siRNA-belasteten calciumbeschichteten porösen Silizium-Nanopartikel. Pipette, bis sich alle Lipide vom Boden der Durchstechflasche gehoben haben und eine trübe, homogene Lösung beobachtet wird.Fügen Sie der Glasflasche einen magnetischen Rührbalken hinzu und legen Sie die Durchstechflasche auf eine Kochplatte, um die Partikel auf 40 Grad Celsius zu erhitzen, während sie die Lösung 20 Minuten lang magnetisch rührt. Befestigen Sie anschließend eine leere Spritze an einer Seite des Extruders. Dann füllen Sie eine weitere Spritze mit einem Milliliter der lipidbeschichteten porösen Silizium-Nanopartikellösung und befestigen Sie die Spritze an der anderen Seite des Extruders.Beginnen Sie die Extrusion, indem Sie den Kolben langsam einschieben, um die Partikel von einer Spritze durch die Polycarbonatmembran in die andere Spritze zu schieben. Wiederholen Sie dies 20 Mal. Sammeln Sie dann die extrudierten Partikel in einem Mikrozentrifugenrohr.Bereiten Sie einen Peptidbestand mit einer Peptidkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter in RNase-freiem Wasser vor. In der Mikrozentrifugenröhre, die die fusogenen lipidbeschichteten porösen Silizium-Nanopartikel enthält, 100 Mikroliter des Peptidbestands und Pipette schonend hinzufügen. Halten Sie das Rohr 20 Minuten lang statisch bei Raumtemperatur.Um überschüssiges Peptid oder siRNA und andere Hilfsstoffe zu entfernen, waschen Sie in einem 30-Kilodalton-Zentrifugalfilter, indem Sie bei 5 000 mal g bei Raumtemperatur eine Stunde lang drehen. Zentrifugieren Sie zwei weitere Male mit einem Milliliter PBS unter den gleichen Einstellungen. Nach der Zentrifugation die letzten peptidkonjugierten fusogenlipidbeschichteten porösen Silizium-Nanopartikel in PBS in der gewünschten Konzentration wieder aufsetzen.Die Partikel können mindestens 30 Tage lang bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Eine erfolgreiche Synthese von fusogenporösen Silizium-Nanopartikeln sollte eine homogene, leicht opake Lösung erzeugen, die 30 Tage lang gelagert und aufgetaut werden kann, ohne strukturelle Veränderungen zu verursachen. Wenn das Verhältnis und die Konzentration nicht optimiert werden, sowie wiederholte Frost-Tau-Zyklen kann dies bei der Belastung zur Aggregation führen.Wenn die Partikel extrudiert werden, sollte der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser der durch dynamische Lichtstreuung gemessenen fusogenporösen Silizium-Nanopartikel etwa 200 Nanometer betragen und das durchschnittliche Zeta-Potenzial etwa sieben Millivolt. Nach der Oberflächenmodifikation mit Targeting-Peptiden sollte der Gesamtdurchmesser weniger als 230 Nanometer betragen, und das durchschnittliche Zeta-Potenzial sinkt auf minus 3,4 Millivolt. Die Fusion kann bestätigt werden, indem die fusogenen Lipide mit dem lipophilen Fluorophor DiI gekennzeichnet und die In-vitro-Lokalisation mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet wird.Eine erfolgreiche Fusion wird beobachtet, wenn die Lipide des fusogenporösen Silizium-Nanopartikels das DiI auf die Plasmamembran übertragen und unabhängig von Lysosomen lokalisiert werden. Eine erfolglose Fusion zeigt die DiI-Lokalisierung innerhalb des Zytoplasmas der Zelle und die Kolokalisierung mit Lysosomen. Dieses fusogene Nanopartikelsystem wird nun nicht nur bei bakteriellen Infektionen, sondern auch bei der Krebsadjuvantentherapie und Krebsimmuntherapie für therapeutische Anwendungen eingesetzt.Dieses Protokoll kann weiter optimiert werden, um mehr als siRNAs zu laden. Das fusogene Nanopartikelsystem hat Potenzial bei der Beladung und Bereitstellung größerer anionischer Nutzlasten wie mRNAs und CRISPR/Cas9-Komplexe gezeigt.

Research

JoVE Journal

Engineering

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Forschung

Ingenieurwesen

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