Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מכוני הבריאות הלאומיים דרך חוזה # R01 AI132413-01.

1. סינתזה של הסיליקון הנקבובי חלקיקים (pSINPs)
התראה: תמיד באמצעי זהירות כאשר עובדים עם חומצה הידרופלואורית (HF). בצע את כל מדריכי בטיחות על פי גיליון הנתונים שלו בטיחות (מרחביות), לטפל בכימיקלים המכילים HF בשכונה fume בה ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי; כפפות כפול ע?...

<ol>
	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications.">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li><li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+gene+editing:+delivery+and+regulatory+perspectives.">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).</li><li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs.">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li><li>Dai, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

סינתזה של חלקיקים הסיליקון הנקבובי מוצג באיור5. השלב הקריטי בסינתזה של fusogenic pSiNPs הוא שלב ההעמסה (שלב 3). אם הנך מסכם חלקיקים fusogenic שלאחר סינתזה (איור 3), הסיבה לכך יכול להיות בגלל הבאות: (1) סידן כלורי המניה לא הוכן למשל, ולכן שלב 3.1.2 יש בקפידה עקב או מעודן; או (2) היח...

ריפוי גנטי ממיקרו ביטוי גנים ספציפיים כדי לקבל תוצאה טיפולית. כלים רבים עבור ג'ין אפנון יש כבר גילה ולמד, כולל הפרעות חומצה ריבונוקלאית (RNAi) באמצעות oligonucleotides (למשל, קצר מפריעות RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), ה-DNA פלסמידים5,6, nucleases (למשל, אצבע אבץ, TALENS)7,8, ו CRISPR/Cas9 מערכות9,10. בזמן של הכלי כל מנגנון פעולה שונה, כל הכלים צריך להגיע הציטופלסמה של התא או את הגרעין להיות פעילים. ככזה, בעוד כלים אלה הוכיחו לזירוז השפעה משמעותית של הכוח ויסות גנים במבחנה, היעילות ויוו סובל מכשולים חוץ-תאית, תאיים. בשל העובדה כי הכלים הם ממקור ביולוגי, אנזימים רבים, מערכות סליקה קיים בגוף שלנו יש את היכולת להשפיל או להסיר את מולקולות זרות11. אפילו במקרה כי הכלים להגיע לתא המטרה, הם סובלים אנדוציטוזה; מצב של ספיגת הסלולר מבצע אנקפסולציה, מלכודות הכלים בשלפוחית כמו קיבה חומצי לבזות או לגרש את הכלים מחוץ לתאים. למעשה, מחקרים הראו כי השומנים חלקיקים הם endocytosed ויה macropinocytosis, שממנו הם כ- 70% siRNA exocytosed את התאים בתוך 24 שעות של ספיגת12,13. רוב siRNA הנותרים הם השפיל דרך השביל lysosomal, ולהשיג בסופו של דבר רק 1-2% של siRNA המוסיפה בתחילה את התא עם חלקיקים endosomal לברוח העלול לעבור RNAi13,14 .
לאחרונה פיתחנו fusogenic הסיליקון הנקבובי חלקיקים (F-pSiNPs) בעלות של הליבה siRNA טעון מורכב הסיליקון הנקבובי חלקיקים, ו fusogenic השומנים מעטפת15. F-pSiNPs מציגים שלושה יתרונות עיקריים על פני מערכות אחרות oligonucleotide המקובלת: (1) ליפופרוטאין fusogenic ציפוי המאפשר את החלקיקים לעקוף אנדוציטוזה ולספק את כל המטען ישירות בציטופלסמה תא (לעומת % 1-2 מושגת על-ידי endocytosed חלקיקים13,14) (איור 1); (2) הטעינה מסה גבוהה של siRNA ב pSiNPs (> 20% wt לעומת wt 1-15% על ידי מערכות קונבנציונלי)15, אשר במהירות לבזות בציטופלסמה (פעם החלקיקים הליבה לשפוך את ציפוי השומנים דרך ספיגת fusogenic) כדי לשחרר את siRNA; (3) מיקוד פפטיד ההטיה של יונת סלקטיבית כדי הרצוי סוגי תאים ויוו.
מערכת F-pSiNP הוכיחה משמעותית ג'ין להשתיק יעילות (> גופית; 95% > 80% ויוו) ואת האפקט הטיפולי עוקבות במודל של עכברים קטלנית של S. aureus דלקת ריאות; התוצאות אשר פורסמו בעבר15. עם זאת, המבנה המורכב של מערכת F-pSiNP דורש התייחסות רגישה ואופטימיזציה מכויל כדי ליצור חלקיקים אחיד ויציב. לפיכך, מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול יסודי, וכן אסטרטגיות אופטימיזציה עבור סינתזה, functionalization, אפיון של F-pSiNPs כדי לשמש יישוב מסירת siRNAs לאפקט שתיקה ג'ין חזק.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

עם כניסתו של טיפול גנטי, הפך התפתחות מערכת משלוחים יעיל ויוו נוקלאוטיד-המטען של ייבוא מקביל. Fusogenic הסיליקון הנקבובי חלקיקים (F-pSiNPs) הראו לאחרונה גבוהה ג'ין ויוו להשתיק היעילות עקב שלה oligonucleotide גבוהה טעינה קיבולת ועל מסלול ייחודי ספיגת הסלולר זה מונע אנדוציטוזה. הסינתזה של F-pSiNPs הוא תהליך רב שלבי הכולל: טעינת ואיטום (1) oligonucleotide דים על נקבוביות הסיליקון; (2) ציפוי סימולטני ושינוי של fusogenic שומנים סביב הליבות הסיליקון הנקבובי; (3) ההטיה של פילוח פפטידים ושטיפת להסיר את עודף oligonucleotide, סיליקון פסולת ופפטיד. האחידות בגודל של החלקיק מאופיין על ידי פיזור אור דינאמי, מבנהו ליבה-קליפה ניתן לבירור על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. תפיסה fusogenic מאומתת על-ידי טעינת lipophilic לצבוע, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', פרכלורט 3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI), לתוך fusogenic שכבה ליפידית וטיפול זה לתאים במבחנה להתבונן על קרום פלזמה מכתים לעומת endocytic localizations. המטרה ואת ויוו ג'ין שתיקה efficacies היו בעבר לכמת במודל של עכברים של דלקת ריאות Staphylococcus aureus , שבו פפטיד מיקוד צפוי לעזור F-pSiNPs לבית לאתר של זיהום. מעבר היישום שלה ב- S. aureus זיהום, מערכת F-pSiNP עשוי לשמש כדי לספק כל oligonucleotide עבור ריפוי גנטי של מגוון רחב של מחלות, כולל זיהומים נגיפיים, סרטן ומחלות אוטואימוניות.

שילוב מוצלח של fusogenic pSiNPs צריך לייצר פתרון הומוגני, כמעצמה (איור 3 א). כשל כדי למטב את היחס ואת ריכוז של pSiNPs: siRNA: CaCl2 עשוי להוביל צבירה בעת טעינת (איור 3b). כל החלקיקים הם extruded דרך ממברנות 200 ננומטר, קוטר hydrodynamic הממוצע pSiNPs fusogenic נמדדת DLS צריך ל...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

נדגים את הסינתזה של חלקיקים fusogenic הסיליקון הנקבובי למסירה oligonucleotide במבחנה, ויוו יעיל. הסיליקון הנקבובי חלקיקים נטענים עם siRNA ליצירת הליבה, שהטיחה מאת fusogenic שומנים דרך ההבלטה כדי ליצור את הקליפה. Functionalization moiety מיקוד איפיון חלקיקים הינם כלולים.

סינתזה Functionalization, איפיון חלקיקים הסיליקון הנקבובי Fusogenic למסירה Oligonucleotide

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של מערכת חלקיקים כי הוא מסוגל להשתיק גנים ב vivo על ידי אספקת siRNAs ביעילות גבוהה. פשוט על ידי החלפת פפטיד מיקוד מטען siRNA, חלקיקים fusogenic עשוי לשמש ניסוח טיפולי פוטנציאלי למחלות הדורשות אפנון גנים vivo. פרסמנו בעבר תוצאות באמצעות nanoplatform fusogenic נגד זיהומים חיידקיים גרם חיובי על ידי השתקה גן המקודד דלקת מקרופאגים לסיים דלקת כרונית.לפני ביצוע הליך זה, להרכיב תא תחריט טפלון המכיל רקיק סיליקון בתתבר חומצה הידרופלואורית 3 ל-1. הפעל זרם לסירוגין של צורת גל מרובעת עם צפיפות זרם נמוכה של 50 מיליאמפר לס"מ בריבוע למשך 0.6 שניות וצפיפות זרם גבוהה של 400 מיליאמפר לס"מ בריבוע למשך 0.36 שניות חוזרות על עצמן במשך 500 מחזורים. לאחר סיום התחריט, הסר את התא מהמעגל, ושטוף בזהירות את תותב החומצה ההידרופלואורית באמצעות מזרק.לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים עם אתנול. כדי להרים את השכבה הנקבובית מוופל הסיליקון, מלא תחילה את הבאר של תא התחריט ב-10 מיליליטר של תוסף חומצה הידרופלואורית של אחד ל-29. לאחר מכן, לרוץ קבוע של 3.7 מיליאמפר אחוזים בריבוע במשך 250 שניות.לאחר תחריט הוא סיים, להסיר את התא מהמעגל. לשכבת הסיליקון הנקבובית עשויים להיות אדוות נראות לעין, מה שמצביע על ניתוק מוופל הסיליקון הגבישי. לשטוף בעדינות את תספור החומצה ההידרופלואורית, ולשטוף שלוש פעמים כל אחד עם אתנול ומים.בעזרת קצה פיפטה, סדקו בחוזקה את היקף שכבת הסיליקון הנקבובית לניתוק מוחלט. באמצעות אתנול, לאסוף את שברי סיליקון נקבובי, או שבבים, מתא תחריט טפלון לתוך סירה במשקל. לאחר מכן, להעביר את השבבים לבקבוקון זכוכית לאחסון.לאחר מכן, החלף את האתנול בבקבוקון הזכוכית המכיל את שבבי הסיליקון הנקבוביים בשני מיליליטר של מים נטולי RNase. כובע בחוזקה ולאטום את הבקבוקון באמצעות Parafilm. מניחים את בקבוקון הזכוכית באמבטיה sonicator מושעה כך נפח שבבי סיליקון נקבובי שקועים לחלוטין מתחת לפני השטח של אמבט המים.כדי למנוע אובדן מים משמעותי במהלך sonication, מניחים בקבוק נפח מלא מים, הפוך כך פתיחת הבקבוק נוגע על פני השטח של אמבט המים. לאחר מכן, sonicate שבבי סיליקון נקבובי במשך 12 שעות ב 35 קילוהרץ עם כוח RF של 48 וואט. לאחר sonication, מניחים את בקבוקון הזכוכית על משטח שטוח במשך שעה אחת כדי לאפשר לחלקיקים הגדולים להתיישב בתחתית.לאחר מכן, לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה. בבקבוקון זכוכית, הוסיפו 72.55 מיקרוליטרים של פתרון DMPC, 15.16 מיקרוליטרים של פתרון DSPE-PEG ו-19.63 מיקרוליטרים של פתרון DOTAP, וערבבו לפי צינורות. מניחים את הבקבוקון במכסה המנוע של אדים עם כובע רופף כדי לאפשר לממס להתאדות בן לילה.הסרט המיובש יהיה חומר מעונן, קשה, דמוי ג'ל בתחתית הבקבוקון. לאחר מכן, מניחים צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 150 מיקרוליטרים של חלקיקי סיליקון נקבוביים באמבט sonication קר שהוכן בעבר. תחת ultrasonication 15 דקות, בעדינות pipette 150 microliters של siRNA ו 700 microliters של שני טוחנת סידן כלורי לתוך חלקיקי סיליקון נקבובי.הסר את הצינור המכיל מיליליטר אחד של חלקיקי סיליקון נקבוביים מצופים סידן מצופים siRNA מהסוניקטור. ממלאים מקור רחב במים מיונים. משרים קרום פוליקרבונט וארבעה תומכים במסנן על ידי הצפתם על פני המים.לאחר מכן, להרכיב ערכת שולט ליפוזום על ידי ביצוע הוראות היצרן. לאחר מכן, לחות את הסרט השומנים מיובשים בקבוקון זכוכית עם מיליליטר אחד של חלקיקי סיליקון נקבובי מצופה סידן טעון siRNA. פיפטה עד שכל השומנים הוסרו מתחתית הבקבוקון ופתרון מעונן והומוגני נצפה.מוסיפים בר ערבוב מגנטי לבקבוקון הזכוכית, ומ מניחים את הבקבוקון על צלחת חמה כדי לחמם את החלקיקים ל -40 מעלות צלזיוס תוך ערבוב מגנטי של הפתרון במשך 20 דקות. לאחר מכן, לצרף מזרק ריק לצד אחד של extruder. לאחר מכן, למלא מזרק אחר עם מיליליטר אחד של פתרון ננו חלקיקי סיליקון נקבובי מצופה השומנים, ולצרף את המזרק לצד השני של extruder.התחל את ההבלטה על ידי דחיפת הבוכנה לאט לדחוף את החלקיקים ממזרק אחד, דרך קרום פוליקרבונט, ולתוך המזרק השני. חזור על הפעולה 20 פעמים. לאחר מכן, לאסוף את החלקיקים המובלטים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה.הכינו מלאי פפטיד עם ריכוז פפטיד של מיליגרם למיליליטר במים נטולי RNase. בצינור microcentrifuge המכיל את חלקיקי סיליקון נקבובי מצופה שומנים fusogenicic, להוסיף 100 microliters של מלאי פפטיד, ו pipette בעדינות. שמור על הצינור סטטי בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.כדי להסיר עודף פפטיד או siRNA ו excipients אחרים, לשטוף מסנן צנטריפוגלי 30 קילודלטון על ידי ספינינג ב 5, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. צנטריפוגה פעמיים נוספות עם מיליליטר אחד של PBS תחת אותן הגדרות. לאחר הצנטריפוגה, יש להתחדש בננו-חלקיקי הסיליקון הנקבוביים הסופיים מצופים הפוטידים ב-PBS בריכוז הרצוי.החלקיקים יכולים להיות aliquoted ומאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לפחות 30 ימים. סינתזה מוצלחת של חלקיקי סיליקון נקבובי fusogenicics צריך לייצר פתרון הומוגני, אטום מעט כי ניתן לאחסן במשך 30 ימים מופשר מבלי לגרום לשינויים מבניים. אי אופטימיזציה של היחס והריכוז, כמו גם מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים עלולים להוביל לצבירה בעת הטעינה.כאשר החלקיקים מובלטים, הקוטר ההידרודינמי הממוצע של חלקיקי הסיליקון הנקבוביים הפוסוגניים הנמדדים על ידי פיזור אור דינמי צריך להיות כ -200 ננומטר ופוטנציאל הזטה הממוצע בערך חיובי שבעה מילי-וולט. לאחר שינוי פני השטח עם פפטידים מיקוד, הקוטר הכולל צריך להיות פחות מ 230 ננומטר, ואת זטה הפוטנציאל הממוצע יורד למינוס 3.4 מיליבולטים. היתוך עשוי להיות מאושר על ידי תיוג שומנים fusogenic עם פלואורופור DiI ליפופילי והתבוננות לוקליזציה במבחנה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.היתוך מוצלח נצפה כאשר השומנים של סיליקון נקבובי fusogenicic להעביר את DiI לתוך קרום הפלזמה והם מקומיים ללא תלות lysosomes. היתוך לא מוצלח יראה את לוקליזציה DiI בתוך הציטופלסמה של התא ולוקליזציה שיתוף עם lysosomes. מערכת חלקיקים fusogenic זה משמש כעת עבור יישומים טיפוליים לא רק זיהומים חיידקיים, אלא גם בטיפול גוף סרטני אימונותרפיה סרטן.פרוטוקול זה עשוי להיות ממוטב עוד יותר כדי לטעון יותר מאשר siRNAs. מערכת הננו-חלקיקים הפוגנית הראתה פוטנציאל בטעינה ואספקה של מטענים אניונים גדולים יותר, כגון mRNAs ומתסביכים CRISPR/Cas9.

Research

JoVE Journal

Engineering

Optical Trapping of Nanoparticles

לכידה אופטית של חלקיקים

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

סינתזה וFunctionalization גביעי Nanotube פחמן חנקן מסומם עם חלקיקי זהב כפקקים

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Monolayer Contact Doping of Silicon Surfaces and Nanowires Using Organophosphorus Compounds

חד שכבתי לתקשר סימום של משטחי סיליקון וNanowires שימוש בתרכובות זרחן אורגניות

Monolayer Contact Doping (MLCD) is a simple method for doping of surfaces and nanostructures1. MLCD results in the formation of highly controlled, ultra ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

פינת שינוי סלקטיבית של יכולת רטיבות משטח סיליקון על ידי פעמו UV לייזר הקרנה בסביבה נוזלית

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Silicon Metal-oxide-semiconductor Quantum Dots for Single-electron Pumping

סיליקון מתכת-תחמוצת-מוליכים למחצה קוונטי נקודות לשאיבת חד אלקטרון

As mass-produced silicon transistors have reached the nano-scale, their behavior and performances are increasingly affected, and often deteriorated, by ...

Synthesis and Functionalization of 3D Nano-graphene Materials: Graphene Aerogels and Graphene Macro Assemblies

סינתזה וFunctionalization של חומרים ננו-גרפן 3D: הרכבות מאקרו Aerogels גראפן וגראפן

Efforts to assemble graphene into three-dimensional monolithic structures have been hampered by the high cost and poor processability of graphene. ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

שילוב של אור ננו-מבני כסף השמנה בתאים סולריים המוקשה Microcrystalline הסיליקון ידי העברת הדפסה

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

באתרו הסינתזה של זהב חלקיקים ללא צבירה במרחב Interlayer של סרטים שקופים Titanate Layered

Combinations of metal oxide semiconductors and gold nanoparticles (AuNPs) have been investigated as new types of materials. The in situ synthesis of AuNPs ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

להעשיר ולהרחיב בתאי T אנטיגן ספציפי נדיר עם חלקיקים מגנטיים

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Procedure for the Transfer of Polymer Films Onto Porous Substrates with Minimized Defects

נוהל העברת סרטים פולימריים אל מצעים נקבובי עם פגמים ממוזערים

The fabrication of devices containing thin film composite membranes necessitates the transfer of these films onto the surfaces of arbitrary support ...