Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
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Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health attraverso contratto n # R01 AI132413-01.

1. sintesi di nanoparticelle di silicio poroso (pSINPs)
Attenzione: Usare sempre cautela quando si lavora con acido fluoridrico (HF). Seguire tutte le guide di sicurezza secondo la sua scheda di dati di sicurezza (SDS), maneggiare sostanze chimiche contenenti HF in una cappa aspirante e indossare adeguati dispositivi di protezione personale (PPE; doppie guanti con guanti di butyl all'esterno, grembiule di butile con camice sotto, viso scudo con occhiali di sicurezza sotto). Tutte le università ...

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	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

Sintesi di nanoparticelle di silicio poroso sono illustrato nella Figura 5. Il passaggio fondamentale nella sintesi di fusogena pSiNPs è in fase di caricamento (passaggio 3). Se le nanoparticelle fusogena aggregano post-sintesi (Figura 3), il motivo potrebbe essere a causa di quanto segue: (1) stock di cloruro di calcio non era preparato omogeneamente, così passo 3.1.2 dovrà essere attentamente seguito o raffinato; o (2) il rapporto di pSiNP: siRNA: CaCl...

Terapia genica modula l'espressione genica specifici per ottenere un risultato terapeutico. Numerosi strumenti per la modulazione del gene sono stati scoperti e studiati, compreso acido ribonucleico interferenza (RNAi) utilizzando oligonucleotidi (ad es., breve interfering RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmidi5,6, nucleasi (ad es., dito di zinco, TALENS)7,8e CRISPR/Cas9 sistemi9,10. Mentre il meccanismo di ciascuno strumento di azione è diverso, tutti gli strumenti deve raggiungere il citoplasma della cellula o il nucleo è attivo. Come tale, mentre questi strumenti hanno dimostrato di indurre un effetto significativo nella modulazione della espressione genica in vitro, in vivo l'efficacia soffre da ostacoli extracellulari ed intracellulari. Dovuto al fatto che gli strumenti sono di origine biologica, molti enzimi e sistemi di sdoganamento esistano nel nostro corpo che hanno la capacità di degradare o rimuovere le molecole estranee11. Anche nel caso che gli strumenti di raggiungano la cella obiettivo, essi soffrono di endocitosi; una modalità di assorbimento cellulare che incapsula e intrappola gli strumenti in acido dello stomaco-come vescicole che degradano o espellere gli strumenti fuori dalla cella. Infatti, studi hanno dimostrato che nanoparticelle lipidiche sono stimolazione tramite Macropinocitosi, da cui circa il 70% dei siRNA sono exocytosed dalle cellule all'interno di 24h di assorbimento12,13. La maggior parte del siRNA rimanente vengono degradata attraverso il pathway lisosomiale, e in definitiva soltanto 1-2% di siRNA che inizialmente entra nella cellula con le nanoparticelle ottenere fuga endosomal potenzialmente subire RNAi13,14 .
Recentemente abbiamo sviluppato le nanoparticelle di silicio poroso fusogena (F-pSiNPs) che hanno un nucleo caricato siRNA composto di silicio poroso nanoparticelle e un fusogena lipidica shell15. F-pSiNPs presentano tre vantaggi principali rispetto ad altri sistemi di consegna del oligonucleotide convenzionale: (1) un lipide fusogena rivestimento che permette alle particelle di bypassare endocitosi e consegnare l'intero payload direttamente nel citoplasma delle cellule (contro l'1-2% raggiunto da stimolazione particelle13,14) (Figura 1); (2) carico di massa elevata di siRNA nella pSiNPs (> 20% in peso rispetto al 1-15 wt % dai sistemi convenzionali)15, che degradano rapidamente nel citoplasma (una volta che le particelle del nucleo capannone il rivestimento lipidico tramite l'assorbimento fusogena) per rilasciare il siRNA; e (3) targeting coniugazione del peptide per homing selettiva al desiderato tipi di cellule in vivo.
Il sistema F-pSiNP ha dimostrato notevole efficacia il silenziamento genico (> 95% in vitro; > 80% in vivo) e conseguente effetto terapeutico in un modello murino mortale di polmonite Staphylococcus aureus ; i risultati di cui sono stati pubblicati in precedenza15. Tuttavia, la complessa struttura del sistema F-pSiNP richiede manipolazioni delicate e ottimizzazione fine-tuned per generare nanoparticelle uniforme e stabile. Così, lo scopo di questo lavoro è di presentare un protocollo approfondito, nonché strategie di ottimizzazione per la sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di F-pSiNPs per essere utilizzato in somministrazione mirata di siRNA per effetto di silenziamento del gene potente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

Con l'avvento della terapia genica, lo sviluppo di un sistema di consegna efficaci in vivo del nucleotide-payload è diventata di importazione parallela. Fusogena silicio poroso nanoparticelle (F-pSiNPs) hanno recentemente dimostrato alto genico in vivo di efficacia a causa sua oligonucleotide ad alto capacità di carico e via di assorbimento cellulare unico che evita endocitosi. La sintesi di F-pSiNPs è un processo a più fasi che include: (1) di carico e la sigillatura di payload del oligonucleotide nei pori di silicio; (2) rivestimento simultanea e dimensionamento dei lipidi fusogena intorno i nuclei di silicio poroso; e (3) coniugazione di peptidi di targeting e lavaggio per rimuovere l'eccesso del oligonucleotide, detriti di silicio e il peptide. Uniformità di dimensione della particella è caratterizzata da diffusione dinamica della luce, e la sua struttura core-shell può essere verificata da microscopia elettronica di trasmissione. L'assorbimento di fusogena viene convalidato caricando un lipofilico tingere, 1, 1'-Diottadecilbis-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), in bilayer del lipido fusogena e trattandolo alle cellule in vitro per osservare per membrana plasmatica colorazione contro localizzazioni endocitosi. I efficacies di silenziamento gene targeting e in vivo in precedenza sono stati quantificati in un modello murino di polmonite Staphylococcus aureus , in cui è previsto il peptide targeting per aiutare il F-pSiNPs a casa per il sito di infezione. Oltre la sua applicazione nell'infezione di S. aureus , il sistema di F-pSiNP può essere usato per fornire qualsiasi oligonucleotide per la terapia genica di una vasta gamma di malattie, compreso le infezioni virali, cancro e malattie autoimmuni.

Una riuscita sintesi di fusogena pSiNPs dovrebbe produrre una soluzione omogenea, leggermente opaca (Figura 3a). Il mancato rispetto di ottimizzare il rapporto e la concentrazione di pSiNPs: siRNA: CaCl2 può condurre all'aggregazione al caricamento (Figura 3b). Come le particelle vengono estruse attraverso membrane di 200 nm, il diametro medio di idrodinamico della pSiNPs fusogena misurata da liste di distribuzione de...

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Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Dimostriamo la sintesi di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna effettiva del oligonucleotide in vitro e in vivo. Silicio poroso nanoparticelle vengono caricate con siRNA per formare il nucleo, che è rivestito dai lipidi fusogena attraverso estrusione per formare il guscio. I servizi e le dotazioni comprendono targeting frazione funzionalizzazione e caratterizzazione delle particelle.

Sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna del Oligonucleotide

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

Questo protocollo descrive la sintesi di un sistema di nanoparticelle in grado di silenziare i geni in vivo fornendo siRNA ad alta efficienza. Semplicemente scambiando il peptide bersaglio e il carico utile di siRNA, le nanoparticelle fusogene possono essere utilizzate come potenziale formulazione terapeutica per malattie che richiedono modulazione genica in vivo. Abbiamo precedentemente pubblicato risultati utilizzando la nanopiastrina fusogena contro le infezioni batteriche gram-positive silenziando un gene che codifica per l'infiammazione nei macrofagi per porre fine all'infiammazione cronica.Prima di eseguire questa procedura, assemblare una cella di incisione di Teflon contenente un wafer di silicio in una soluzione di acido fluoridrico da tre a uno. Eseguire una corrente alternata di una forma d'onda quadrata con una bassa densità di corrente di 50 milliampere per centimetro squadrato per 0,6 secondi e un'alta densità di corrente di 400 milliampere per centimetro al quadrato per 0,36 secondi ripetuti per 500 cicli. Una volta terminata l'incisione, rimuovere la cella dal circuito e risciacquare con cura la soluzione di acido fluoridrico utilizzando una siringa.Quindi, sciacquare tre volte con l'etanolo. Per sollevare lo strato poroso dal wafer di silicio, riempire prima il pozzo della cella di incisione con 10 millilitri di una soluzione di acido fluoridrico uno-a-29. Quindi, eseguire una costante di 3,7 milliampere per centimetro squadrato per 250 secondi.Una volta terminata l'incisione, rimuovere la cella dal circuito. Lo strato poroso di silicio può avere increspature visibili, indicando il distacco dal wafer di silicio cristallino. Lavare delicatamente la soluzione di acido fluoridrico e risciacquare tre volte ciascuna con etanolo e acqua.Utilizzando una punta di pipetta, rompere saldamente la circonferenza dello strato di silicio poroso per un completo distacco. Usando l'etanolo, raccogliere i frammenti di silicio poroso, o chip, dalla cella di incisione teflon in una barca di pesatura. Quindi, trasferire i trucioli in una fiala di vetro per la conservazione.Successivamente, sostituire l'etanolo nella fiala di vetro contenente i trucioli di silicio porosi con due millilitri di acqua priva di RNasi. Cappuccio saldamente e sigillare il flaconcino utilizzando Parafilm. Posizionare il flaconcino di vetro in un bagno sonicatore e sospeso in modo che il volume dei trucioli di silicio poroso sia completamente sommerso sotto la superficie del bagno d'acqua.Per evitare una significativa perdita d'acqua durante la sonicazione, posizionare un pallone volumetrico riempito d'acqua, invertito in modo che l'apertura del pallone tocchi la superficie del bagno d'acqua. Quindi, sonicare i trucioli di silicio porosi per 12 ore a 35 kilohertz con una potenza RF di 48 watt. Dopo la sonicazione, posizionare il flaconcino di vetro su una superficie piana per un'ora per consentire alle particelle più grandi di depositarsi sul fondo.Quindi, raccogliere il supernatante utilizzando una pipetta. In una fiala di vetro aggiungere 72,55 microlitri di soluzione DMPC, 15,16 microlitri di soluzione DSPE-PEG e 19,63 microlitri di soluzione DOTAP e mescolare mediante pipettazione. Posizionare il flaconcino in una cappa aspirante con un cappuccio sciolto per consentire al solvente di evaporare durante la notte.Il film essiccato sarà una sostanza torbosa, dura e simile a un gel nella parte inferiore del flaconcino. Quindi, posizionare un tubo di microcentrifugo contenente 150 microlitri di nanoparticelle di silicio poroso in un bagno di sonicazione ghiacciato precedentemente preparato. Sotto un'ultrasonicazione di 15 minuti, pipettare delicatamente 150 microlitri di siRNA e 700 microlitri di cloruro di calcio bimolare nelle nanoparticelle di silicio poroso.Rimuovere dal sonicatore il tubo contenente un millilitro di nanoparticelle di silicio poroso cariche di calcio cariche di siRNA. Riempire un ampio becher con acqua deionizzata. Immergere una membrana in policarbonato e quattro supporti filtranti galleggiandoli sulla superficie dell'acqua.Quindi, assemblare un kit di estrusione liposoma seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, idratare il film lipidico essiccato nella fiala di vetro con un millilitro delle nanoparticelle di silicio poroso ricoperte di calcio cariche di siRNA. Pipetta fino a quando tutti i lipidi non si sono sollevati dal fondo della fiala e si osserva una soluzione torbosa e omogenea.Aggiungere una barra di agitazione magnetica al flaconcino di vetro e posizionare il flaconcino su una piastra calda per riscaldare le particelle a 40 gradi Celsius mescolando magneticamente la soluzione per 20 minuti. In seguito, attaccare una siringa vuota su un lato dell'estrusore. Quindi, riempire un'altra siringa con un millilitro della soluzione di nanoparticella di silicio poroso rivestita di lipidi e attaccare la siringa all'altro lato dell'estrusore.Iniziare l'estrusione spingendo lentamente il pistone per spingere le particelle da una siringa, attraverso la membrana in policarbonato e nell'altra siringa. Ripeti 20 volte. Quindi, raccogliere le particelle estruse in un tubo di microcentrifugo.Preparare uno stock peptidico con una concentrazione di peptide di un milligrammo per millilitro in acqua priva di RNasi. Nel tubo di microcentrifugo contenente le nanoparticelle di silicio poroso rivestite di lipidi fusogene, aggiungere 100 microlitri del calcio peptidico e pipettare delicatamente. Mantenere il tubo statico a temperatura ambiente per 20 minuti.Per rimuovere peptide o siRNA in eccesso e altri eccipienti, lavare in un filtro centrifugo da 30 kilodalton girando a 5.000 volte g a temperatura ambiente per un'ora. Centrifuga altre due volte con un millilitro di PBS sotto le stesse impostazioni. A seguito della centrifugazione, ha rimosoppo le nanoparticelle di silicio poroso fusogeno fusogeno coniugato peptide in PBS alla concentrazione desiderata.Le particelle possono essere aliquote e conservate a meno 80 gradi Celsius per almeno 30 giorni. Una sintesi riuscita delle nanoparticelle di silicio poroso fusogeno dovrebbe produrre una soluzione omogenea, leggermente opaca, che può essere immagazzinata per 30 giorni e scongelata senza causare cambiamenti strutturali. La mancata ottimizzazione del rapporto e della concentrazione, così come i ripetuti cicli di congelamento-scongelamento possono portare all'aggregazione al caricamento.Man mano che le particelle vengono estruse, il diametro idrodinamico medio delle nanoparticelle di silicio poroso fusogeno misurate dallo scattering dinamico della luce dovrebbe essere di circa 200 nanometri e il potenziale zeta medio approssimativamente positivo di sette millivolt. Dopo la modifica della superficie con peptidi mirati, il diametro complessivo dovrebbe essere inferiore a 230 nanometri e il potenziale zeta medio diminuisce a meno 3,4 millivolt. La fusione può essere confermata etichettando i lipidi fusogeni con il fluoroforo lipofilo DiI e osservando la localizzazione in vitro mediante microscopia confocale.La fusione di successo si osserva quando i lipidi della nanoparticella di silicio poroso fusogeno trasferiscono il DiI alla membrana plasmatica e sono localizzati indipendentemente dai lisosomi. La fusione non riuscita mostrerà la localizzazione del DiI all'interno del citoplasma della cellula e la co-localizzazione con i lisosomi. Questo sistema di nanoparticelle fusogene viene ora utilizzato per applicazioni terapeutiche non solo nelle infezioni batteriche, ma anche nella terapia adiuvante contro il cancro e nell'immunoterapia del cancro.Questo protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per caricare più di siRNA. Il sistema di nanoparticelle fusogene ha mostrato un potenziale nel caricamento e nella fornitura di carichi utili anionici più grandi, come mRNA e complessi CRISPR/Cas9.

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