Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

この仕事を通しての健康の国民の協会によってサポートされて # R01 AI132413-01 を契約します。

1. ポーラス シリコンのナノ粒子 (pSINPs) の合成
注意: は、フッ化水素酸 (HF) を使用するときに常に注意を使用します。その安全データシート (SDS) によるとすべての安全ガイドに従ってください、発煙のフードで HF を含む化学薬品を処理し、適切な個人用保護具 (PPE; 外にブチル手袋をして二重手袋、ブチル、顔の下に白衣とエプロンを着用シールドの下に安全ゴーグル)。?...

<ol>
	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications.">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li><li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+gene+editing:+delivery+and+regulatory+perspectives.">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).</li><li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs.">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li><li>Dai, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を図 5に示します。融合性 pSiNPs の合成に重要なステップは、読み込みの手順 (手順 3)。膜融合ナノ粒子を集約する場合後合成 (図 3)、理由次が原因である可能性があります: (1) 塩化カルシウム株式がゆく準備されていません、ステップ 3.1.2 必要があります慎重に続くまたは洗練された; するため(2) または pSiNP ?...

遺伝子治療は、治療の結果を取得する特定の遺伝子発現を調節します。遺伝子の調節のための多数のツールを検出し、(例えば、短い干渉 RNA (siRNA)1、2、マイクロ Rna (miRNA)3,4 のオリゴヌクレオチドを使用してリボ核酸干渉 (RNAi) などを学び、)、DNA プラスミド5,6核酸 (例えば、亜鉛指、TALENS)7、8、および CRISPR/Cas9 システム9,10。各ツールの作用機序とは異なる中、セルの細胞質またはアクティブ化する核に到達する必要がありますすべてのツール。など、これらのツールは、体外遺伝子発現を調節することで有意な効果を誘導するために証明されている、間に生体内での有効性は細胞外と細胞内の障害物によって苦しみます。ツールは、生物学的起源、という事実のために多くの酵素やクリアランス システムが低下または外国の分子11を削除する能力を持っている私たちの体で存在します。場合でも、彼らはエンドサイトーシス; から苦しむ目的セルをツールに到達トラップの低下またはセルからツールを追放する酸性の胃のような小胞に含まれるツールをカプセル化して細胞内取り込みモード。実際には、研究はマクロピノサイトーシス、元、siRNA の約 70% が吸収12,13の 24 h 内のセルから exocytosed 経由で貪食を脂質ナノ粒子には示しています。残りの siRNA の大半はリソソーム経路によって劣化が、最終的に当初がナノ粒子でセルに入る siRNA の唯一の 1-2% 達成潜在的 RNAi13,14 を受けるエンドソーム脱出.
最近融合ペプチド脂質シェル15とポーラス シリコン微粒子から成る siRNA ロードのコアを持つ融合性ポーラス シリコン ナノ粒子 (F pSiNPs) を開発しました。F pSiNPs 提示他従来オリゴヌクレオチド配信システムの 3 つの主要な利点: (1) エンドサイトーシスをバイパスし、ペイロード全体を (1-2% 対細胞細胞質内に直接配信する粒子ができますコーティング膜融合脂質貪食粒子13,14目標達成) (図 1)。pSiNPs の siRNA の (2) の高質量負荷 (> 1-15 wt % により、従来に比べて 20 wt %)15、急速に低下する細胞質 (一度コア粒子は膜融合吸収を介して脂質コーティングを流す); siRNA を解放するには(3) と体内細胞の種類を希望する選択的ホーミングのペプチド共役をターゲットします。
F pSiNP システムは、重要な遺伝子サイレンシング効果を実証してきました (> 95% 生体外で; > 体内の 80%)、黄色ブドウ球菌肺炎の致命的なマウスモデルでの後の治療効果結果15以前公開されました。ただし、繊細な取り扱いと均一で安定したナノ粒子を生成するために微調整の最適化、F pSiNP システムの複雑な構造が必要です。したがって、この作業の目的は徹底的なプロトコルとして合成、機能化、および強力な遺伝子サイレンシング効果に Sirna のターゲットを絞った配信で使用する F pSiNPs の特性の最適化戦略を提示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

遺伝子療法の出現により、効果的な体内ヌクレオチド ペイロード搬送システムの開発は並行輸入となっています。融合性ポーラス シリコンのナノ粒子 (F pSiNPs) 高 in vivo 遺伝子サイレンシング力およびエンドサイトーシスを回避するユニークな細胞内取り込み経路その高オリゴヌクレオチドによる有効性を示してきた。F pSiNPs の合成は複数の手順が含まれている: (1) 読み込みとシリコン毛穴; へのオリゴヌクレオチド ペイロードのシール(2) 同時コーティング ・融合ペプチド脂質ポーラス シリコンのコアの周りのサイジング(3) の共役ペプチドをターゲット ・洗浄の余分なオリゴヌクレオチド、シリコンの破片、およびペプチドを削除します。粒子の大きさの均一性は動的光散乱によって特徴付けられるし、そのコア ・ シェル構造は、電子顕微鏡による検証可能性があります。膜融合吸収は、脂溶性の読み込みによって検証された染料、1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸塩 (DiI) 融合ペプチドの脂質二重膜に、細胞膜と染色の観察する治療エンドサイトーシスのローカライズ。ターゲットおよび in vivo 遺伝子サイレンシング効果はターゲットのペプチドの F pSiNPs は、感染部位に家が予想される黄色ブドウ球菌肺炎マウスモデルにおける定量化された以前。黄色ブドウ球菌感染症における応用を越えて F pSiNP システムは幅広い領域の疾患、ウイルス感染症、がん、自己免疫疾患などの遺伝子治療の任意のオリゴヌクレオチドを提供する使用ことがあります。

融合性 pSiNPs の合成に成功は均質なわずかに不透明なソリューション (図 3 a) を生成する必要があります。比と pSiNPs の濃度を最適化に失敗しました: siRNA: CaCl2 (図 3 b) の読み込み時に集約につながる可能性があります。DLS を用いて融合ペプチド pSiNPs の平均流体力学的直径が約 200 をする必要があります 200 nm 膜を介...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

効果的な in vitro および in vivo のオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を示します。ポーラス シリコンのナノ粒子は、シェルを形成する押し出しによる融合ペプチド脂質によるコーティングの核を形成する siRNA によって読み込まれます。ターゲット部位の機能化と粒子特性含まれます。

合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

このプロトコルは、高効率でsiRNAを送達することによって生体内の遺伝子を沈黙させることができるナノ粒子系の合成を記述する。標的ペプチドとsiRNAペイロードを単に交換するだけで、発煙性ナノ粒子を生体内遺伝子変調を必要とする疾患の潜在的な治療製剤として使用することができる。我々は以前、マクロファージの炎症をコードする遺伝子をサイレンシングして慢性炎症を終結させることによって、グラム陽性細菌感染に対する発がん性ナノプラットフォームを用いた結果を発表した。この手順を実行する前に、シリコンウエハを含むテフロンエッチングセルを3対1のフッ化水素酸溶液に組み立てます。低電流密度が50mmの方が0.6秒、高電流密度が400mmの高電流密度を500サイクルで0.36秒四方にして、四方波の交流を実行します。エッチングが終了したら、回路から細胞を取り出し、注射器を使用してフッ化水素酸溶液を慎重にリンスします。次に、エタノールで3回リンスする。シリコンウエハから多孔質層を持ち上げるには、まず1~29のフッ化水素酸溶液を10ミリリットルでエッチングセルのウェルを充填する。その後、250秒間、1センチメートルあたり3.7ミリアンペアの定数を250秒間実行します。エッチングが終了したら、回路からセルを取り外します。多孔質シリコン層は、可視のリップルを有し得、結晶シリコンウエハからの剥離を示す。フッ化水素酸溶液を軽く洗い流し、エタノールと水でそれぞれ3回洗い流します。ピペットチップを使用して、多孔質シリコン層の円周をしっかりと割り、完全に剥離します。エタノールを使用して、多孔質シリコンフラグメント、またはチップをテフロンエッチングセルから計量ボートに回収する。その後、チップをガラスバイアルに移して保管します。次に、多孔質シリコンチップを含むガラスバイアル内のエタノールを、RNaseフリー水2ミリリットルに交換する。パラフィルムを使用してバイアルをしっかりとキャップして密封します。ガラスバイアルをソニカレーター浴に入れ、多孔質シリコンチップの体積が水浴の表面の下に完全に沈むように吊り下げます。超音波処理中に大きな水の損失を防ぐために、フラスコの開口部が水浴の表面に触れるように反転し、水で満たされた体積フラスコを置きます。次に、48ワットのRF電力で35キロヘルツで12時間多孔質シリコンチップを超音波処理します。超音波処理の後、より大きな粒子が底に落ち着くように1時間平らな表面にガラスバイアルを置きます。次に、ピペットを用いて上清を回収する。ガラスバイアルに、DMPC溶液72.55マイクロリットル、DSPE-PEG溶液15.16マイクロリットル、および19.63マイクロリットルのDOTAP溶液を加え、ピペット処理で混合します。溶剤が一晩蒸発できるように、緩いキャップを持つヒュームフードにバイアルを置きます。乾燥したフィルムは、バイアルの底に濁った、硬い、ゲル状の物質になります。次に、150マイクロリットルの多孔質シリコンナノ粒子を含むマイクロ遠心チューブを、以前に調製した氷の超音波浴に入れる。15分間の超音波処理の下で、穏やかにsiRNAの150マイクロリットルと2モル塩化カルシウム700マイクロリットルを多孔質シリコンナノ粒子にピペット。siRNAに積まれたカルシウム被覆の多孔質シリコンナノ粒子を1ミリリットル含むチューブを超音波処理器から取り出します。広いビーカーに脱イオン水を入れます。ポリカーボネート膜と4つのフィルターサポートを水面に浮かべて浸します。次に、メーカーの指示に従ってリポソーム押出キットを組み立てます。次に、乾燥した脂質膜をガラスバイアルに1ミリリットルのsiRNA付きカルシウム被覆多孔質シリコンナノ粒子で水和する。ピペットは、全ての脂質がバイアルの底部から持ち上げられ、濁った、均質な溶液が観察される。ガラスバイアルに磁気攪拌バーを追加し、ホットプレートにバイアルを置き、粒子を摂氏40度に加熱し、溶液を20分間磁気的に攪拌します。これに続いて、押出機の片側に空の注射器を取り付けます。次に、脂質被覆多孔質シリコンナノ粒子溶液の1ミリリットルで別のシリンジを充填し、押出機の反対側にシリンジを取り付ける。ピストンをゆっくりと押し込んで、1つのシリンジからポリカーボネート膜を通り、もう一方のシリンジに粒子を押し込んで押し出し始めます。20 回繰り返します。次いで、押出粒子をマイクロ遠心チューブに集める。RNaseフリー水中の1ミリグラム/ミリリットルのペプチド濃度でペプチドストックを調製します。二色原性脂質被覆多孔質シリコンナノ粒子を含むマイクロ遠心分離管に、ペプチドストックの100マイクロリットルを加え、ピペットを穏やかに添加する。室温で20分間静かにチューブを保ちます。余分なペプチドまたはsiRNAおよび他の賦形剤を除去するために、室温で5,000回gで1時間回転させることによって30キロダルトン遠心フィルターで洗浄する。遠心分離機同じ設定の下でPBSの1ミリリットルでさらに2回。遠心分離後、PBS中の最終的なペプチド共役二元性脂質被覆多孔質シリコンナノ粒子を所望の濃度で再懸濁する。粒子は、少なくとも30日間マイナス80度でアリクォートされ、保存することができます。二種性多孔質シリコンナノ粒子の合成に成功すると、30日間保存され、構造変化を引き起こすことなく解凍することができる均質でわずかに不透明な溶液を生成する必要があります。比と濃度を最適化できないだけでなく、凍結融解サイクルを繰り返し行えば、読み込み時に凝集する可能性があります。粒子が押し出されると、動的光散乱によって測定されるフソジェニック多孔質シリコンナノ粒子の平均流体力学的直径は、約200ナノメートル、平均ゼータ電位はほぼ正の7ミリボルトであるべきである。標的ペプチドによる表面修飾後、全体の直径は230ナノメートル未満にする必要があり、ゼータ電位の平均はマイナス3.4ミリボルトに減少します。融合は、脂溶性フルオロフォアDiIでフゾゲン性脂質を標識し、共焦点顕微鏡を用いてインビトロ局在化を観察することによって確認することができる。融合に成功するのは、フソジェニック多孔質シリコンナノ粒子の脂質がDiIを原形質膜に転移し、リソソームとは独立して局在化する場合に観察される。失敗した融合は細胞の細胞質内のDiIの局在化およびリソソームとの共局在化を示す。このフソジェニックナノ粒子系は、細菌感染のみならず、がんアジュバント療法やがん免疫療法においても治療用途に利用されています。このプロトコルは、siRNA より多くをロードするようにさらに最適化できます。この機体発生性ナノ粒子系は、mRNAやCRISPR/Cas9複合体などのより大きなアニオンペイロードの読み込みと送達の可能性を示している。

Research

JoVE Journal

Engineering

Optical Trapping of Nanoparticles

ナノ粒子の光トラッピング

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

コルク栓のように金ナノ粒子と窒素ドープカーボンナノチューブカップの合成と機能化

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Monolayer Contact Doping of Silicon Surfaces and Nanowires Using Organophosphorus Compounds

Monolayer Contact Doping (MLCD) is a simple method for doping of surfaces and nanostructures1. MLCD results in the formation of highly controlled, ultra ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

液体環境におけるパルスUVレーザー照射によるシリコン表面の濡れ性の選択エリア変更

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Silicon Metal-oxide-semiconductor Quantum Dots for Single-electron Pumping

単電子揚水用のシリコン金属酸化膜半導体量子ドット

As mass-produced silicon transistors have reached the nano-scale, their behavior and performances are increasingly affected, and often deteriorated, by ...

Synthesis and Functionalization of 3D Nano-graphene Materials: Graphene Aerogels and Graphene Macro Assemblies

グラフェンエアロゲルとグラフェンマクロアセンブリ：3Dナノグラフェン材料の合成と機能化

Efforts to assemble graphene into three-dimensional monolithic structures have been hampered by the high cost and poor processability of graphene. ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

転写印刷により水素化微結晶シリコン太陽電池の光トラッピング銀ナノ構造の統合

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

層状チタン酸透明フィルムの層間空間で凝集することなく金ナノ粒子のその場合成で

Combinations of metal oxide semiconductors and gold nanoparticles (AuNPs) have been investigated as new types of materials. The in situ synthesis of AuNPs ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

豊かにし、磁性ナノ粒子でまれな抗原特異的 T 細胞を展開

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Procedure for the Transfer of Polymer Films Onto Porous Substrates with Minimized Defects

欠陥を最小限に抑えた多孔質基板へのポリマーフィルムの移送手順

The fabrication of devices containing thin film composite membranes necessitates the transfer of these films onto the surfaces of arbitrary support ...

合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション

合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラスシリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション