Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
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이 작품을 통해 건강의 국가 학회에 의해 지원 됩니다 # R01 AI132413-01 계약.

1. 다공성 실리콘 나노 입자 (pSINPs)의 합성
주의: 화 수 소산 (HF)을 작업할 때는 항상 주의 사용 합니다. 그것의 안전 데이터 시트 (SDS) 모든 안전 지침을 따르십시오, 연기 후드, HF 포함 된 화학 물질을 처리 하 고 적절 한 개인 보호 장비 (PPE, 외부에 부 틸 장갑 이중 장갑, 랩 코트 밑, 얼굴 부 틸 앞치마를 착용 아래 안전 고글 방패). 모든 대학 및 R & D 연구소 HF 안전 사용 이전에 ?...

<ol>
	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

다공성 실리콘 나노 입자의 합성은 그림 5에 표시 됩니다. 로딩 단계 (3 단계)에서 fusogenic pSiNPs의 합성에 중요 한 단계가입니다. Fusogenic 나노 입자는 집계 하는 경우 후 합성 (그림 3), 이유는 다음과 같은 원인일 수 있습니다: (1) 염화 칼슘 주식 homogenously 준비 되지 않았습니다, 따라서 단계 3.1.2 신중 하 게 따라 하거나 해야 세련 된; (2) 또는 pSiNP의 비율: ...

유전자 치료는 치료 결과 얻기 위해 특정 유전자 발현을 조절 한다. 유전자 변조에 대 한 수많은 도구 발견 되었고 ribonucleic 산 간섭 (RNAi) oligonucleotides (예를 들어, 짧은 간섭 RNA (siRNA)1,2, 예측에 관한 (미르)3,4 사용 하 여 포함 하 여 공부 ), DNA 플라스 미드5,6, nucleases (예, 아연 손가락, TALENS)8,7,및 CRISPR/Cas9 시스템9,10. 작업의 각 도구의 메커니즘 다릅니다, 하는 동안 모든 도구 셀의 세포질 또는 활성 핵을 도달 해야 합니다. 따라서, 이러한 도구 유도 생체 외에서 유전자 발현 조절에 중요 한 영향을 입증 했다, 하는 동안 생체 조건 효 험 extracellular와 세포 장애물에서 겪고 있다. 사실은 도구는 생물학 근원의 이다, 많은 효소 및 허가 시스템 저하 또는 외국 분자11제거 능력을가지고 우리 몸에 존재 합니다. 경우에도 그들은 endocytosis;에서 고통 받는 도구에 도달 목표 셀 캡슐화 하 고 산 성 위 같은 vesicles 저하 또는 셀에서 도구를 추방 하는에서 도구를 트랩 세포질 통풍 관의 모드입니다. 실제로, 연구는 지질 나노 입자는 약 70%는 siRNA의 통풍 관12,13의 24 시간 이내 셀에서 exocytosed는 macropinocytosis 통해 endocytosed 나타났습니다. 나머지 siRNA의 대다수는 lysosomal 통로가 통해 타락 및 궁극적으로 처음가 나노 입자와 셀 siRNA의 유일한 1-2% 달성 잠재적으로 RNAi13,14 endosomal 이스케이프 .
최근 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자 (F pSiNPs) 다공성 실리콘 나노 입자와 fusogenic 지질 셸15의 구성 하는 siRNA 로드 코어를 개발 했습니다. 세 가지 주요 이점을 다른 기존의 oligonucleotide 전달 시스템을 제시 하는 F-pSiNPs: (1) fusogenic 지질 endocytosis를 무시 하 고 (1-2% 대 세포 세포질에 직접 전체 페이로드를 전달 하는 입자를 가능 하 게 코팅 endocytosed 입자13,14달성) (그림 1); (2) 높은 대량 로드는 pSiNPs에 siRNA의 (> 20 wt % 기존의 시스템에 의해 1-15 wt %에 비해)15, 급속 하 게 타락 세포질에 (일단 코어 입자 fusogenic 통풍 관을 통해 지질 코팅 창 고) 출시 siRNA; (3) 세포 유형 vivo에서 원하는 대상에 선택적 추적에 대 한 펩 티 드 활용.
F-pSiNP 시스템 효능 입을 중요 한 유전자를 시연 하고있다 (> 95% 생체 외에서; > 80 %vivo에서) 및 S. 구 균 폐 렴;의 치명적인 마우스 모델에서 후속 치료 효과 결과 출판 이전15. 그러나, F-pSiNP 시스템의 복잡 한 구조는 섬세 한 처리 및 생성 하는 균일 하 고 안정 된 나노 입자를 미세 조정된 최적화 필요 합니다. 따라서,이 작품의 목적은 철저 한 프로토콜 합성과 기능화, 같은 강력한 유전자 입을 효과 siRNAs의 대상된 배달에 사용 될 F-pSiNPs의 특성에 대 한 최적화 전략 제시 하는 것 이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

유전자 치료의 도래와 함께 효과적인 vivo에서 뉴클레오티드-페이로드 전달 시스템의 개발의 병행 수입 되고있다. Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자 (F-pSiNPs)은 최근 높은 생체 조건 유전자 침묵 때문에 용량과 endocytosis를 방지 하는 독특한 세포 통풍 관 통로 로드 하는 높은 oligonucleotide 효능 설명 했다. F-pSiNPs의 합성은 포함 하는 다단계 프로세스: (1) 로드 및 실리콘 모;에서 oligonucleotide 페이로드 씰링 (2) 동시 코팅 및 다공성 실리콘 코어; 주위 fusogenic 지질의 크기 조정 그리고 펩 티 드를 지정 하 고 초과 oligonucleotide, 실리콘 파편, 및 펩 티 드를 제거 하는 세척의 (3) 활용. 그리고 동적 산란, 입자의 크기가 균일 특징 이다 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 그것의 코어-쉘 구조를 확인할 수 있습니다. Fusogenic 이해는 질 성 로드 하 여 유효성을 검사할 염색, 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 과염소산염 (DiI), fusogenic 지질 bilayer에 고 대 얼룩 원형질 막에 대 한 관찰을 생체 외에서 세포 치료 endocytic 있어입니다. 대상 및 생체 조건 유전자 입을 신진대사 이전 대상 펩 티 드 F-pSiNPs의 가정 감염의 사이트에 도움 것으로 예상 된다 황색 포도상구균 폐 렴의 마우스 모델에서 정량 했다. S. 구 균 감염에의 응용, 넘어 F-pSiNP 시스템 바이러스 감염, 암, 자가 면역 질환 등 질병의 광범위의 유전자 치료에 대 한 어떤 oligonucleotide를 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Fusogenic pSiNPs의 성공적인 합성 균질 성, 약간 불투명 한 솔루션 (그림 3a)를 생산 한다. 실패 비율 및 pSiNPs의 농도 최적화: siRNA: CaCl2 (그림 3b) 로딩 시 집계 될 수 있습니다. 입자는 200 nm 세포 막을 통해 돌출 되어, DL로 측정 하는 fusogenic pSiNPs의 평균 유체역학 직경 해야한다 약 200 nm, 그리고 그림 4와 ?...

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Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

우리는 효과적인 생체 외에서 그리고 vivo에서 oligonucleotide 배달 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 합성을 보여 줍니다. 다공성 실리콘 나노 껍질을 형성 하기 위하여 압출을 통해 fusogenic 지질에 의해 코팅은 핵심을 형성 하는 siRNA와 함께 로드 됩니다. 타겟팅 moiety 기능화 및 입자 특성화 포함 되어 있습니다.

합성과 기능화, Oligonucleotide 배달에 대 한 Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 특성

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

이 프로토콜은 고효율siRNA를 전달하여 생체 내에서 유전자를 침묵할 수 있는 나노 입자 시스템의 합성을 설명합니다. 단순히 표적 펩티드와 siRNA 페이로드를 교환함으로써, fusogenic 나노 입자는 생체 내 유전자 변조를 요구하는 질병에 대한 잠재적 인 치료 제제로 사용될 수있다. 우리는 이전에 만성 염증을 종료하기 위해 대식세포에서 염증을 인코딩하는 유전자를 침묵시킴으로써 그람 양성 세균 감염에 대한 후생 나노 플랫폼을 사용하여 결과를 발표했습니다.이 절차를 수행하기 전에 실리콘 웨이퍼를 포함하는 Teflon 에칭 세포를 3 대 1 하이드로 플루오릭 산 용액에 조립하십시오. 0.6초 동안 곱타임당 50밀리미터의 낮은 전류 밀도와 500사이클 동안 반복되는 0.36초 동안 센티미터당 400밀리암퍼의 높은 전류 밀도로 사각 파형의 번갈아 전류를 실행합니다. 에칭이 완료되면 회로에서 세포를 제거하고 주사기를 사용하여 수력 불소성 용액을 조심스럽게 헹구습니다.그런 다음 에탄올로 세 번 헹구습니다. 실리콘 웨이퍼에서 다공성 층을 들어 올리기 위해 먼저 1-29 개의 수력 불소산 용액의 10 밀리리터로 에칭 세포의 우물을 채웁니다. 그런 다음 250초 동안 3.7밀리미터의 일정한 분과곱을 실행합니다.에칭이 끝나면 회로에서 셀을 제거합니다. 다공성 실리콘 층은 결정성 실리콘 웨이퍼로부터 분리를 나타내는 눈에 보이는 잔물결을 가질 수 있다. 수력 불소성 용액을 부드럽게 씻어 내고 에탄올과 물로 각각 3 배 헹구십시오.파이펫 팁을 사용하여 다공성 실리콘 층의 둘레를 단단히 부수고 완전한 분리를 합니다. 에탄올을 사용하여 테플론 에칭 셀에서 계량 보트로 다공성 실리콘 조각 또는 칩을 수집합니다. 그런 다음, 저장을 위해 유리 유리 바이알에 칩을 전송합니다.다음으로 다공성 실리콘 칩을 함유한 유리 바이알의 에탄올을 RNase 가 없는 물의 2밀리리터로 교체한다. 파라필름을 사용하여 유리병을 단단히 캡하고 밀봉하십시오. 유리 유리알을 초음파 식기 욕조에 넣고 다공성 실리콘 칩의 부피가 수조 표면 아래에 완전히 침수될 정도로 중단됩니다.초음파 처리 중 상당한 물 손실을 방지하기 위해 플라스크의 개구부가 수조의 표면에 닿도록 물로 채워진 볼륨 플라스크를 놓습니다. 그런 다음 48와트의 RF 전력으로 35 킬로헤르츠에서 다공성 실리콘 칩을 12 시간 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 유리 유리 바이알을 평평한 표면에 1 시간 동안 배치하여 큰 입자가 바닥에 정착 할 수 있도록합니다.그런 다음 파이펫을 사용하여 상체를 수집합니다. 유리 바이알에 DMPC 용액 72.55 마이크로리터, DSPE-PEG 용액 15.16 마이크로리터, DOTAP 용액 19.63 마이크로리터를 추가하고 파이펫팅으로 혼합합니다. 용매가 하룻밤 동안 증발 할 수 있도록 느슨한 캡연기 후드에 유리병을 배치합니다.말린 필름은 유리병 의 바닥에 흐린, 하드, 젤 같은 물질이 될 것입니다. 다음으로, 이전에 준비된 아이스 초음파 처리 욕조에 150 마이크로리터의 다공성 실리콘 나노 입자를 포함하는 마이크로 센심 분리기 튜브를 배치합니다. 15분 간의 초음파 처리 하에, 시RNA 150 마이크로리터와 염화물 2개의 미디온 700마이크로리터를 다공성 실리콘 나노입자에 부드럽게 피펫합니다.초음파 처리기에서 siRNA로드 칼슘 코팅 다공 성 실리콘 나노 입자의 1 밀리리터를 포함하는 튜브를 제거합니다. 넓은 비커를 탈온화된 물로 채웁니다. 폴리카보네이트 멤브레인과 4개의 필터를 수면에 띄워 보세요.그런 다음 제조업체의 지시에 따라 리포솜 압출 키트를 조립합니다. 다음으로, siRNA 로딩된 칼슘 코팅 다공성 실리콘 나노입자의 1밀리리터로 유리 유리병에 말린 지질 필름을 수화한다. 모든 지질이 바이알 의 바닥에서 들어 올릴 때까지 파이펫과 흐린, 균일 한 용액이 관찰될 때까지.유리 유리 바이알에 마그네틱 교반 바를 추가하고 유리 판에 유리병을 놓고 입자를 섭씨 40도까지 가열하고 용액을 자기적으로 20 분 동안 교반합니다. 이에 따라 압출기의 한쪽에 빈 주사기를 부착합니다. 그런 다음, 지질 코팅 다공성 실리콘 나노 입자 용액의 1 밀리리터로 다른 주사기를 채우고, 압출기의 반대편에 주사기를 부착한다.피스톤을 천천히 밀어 내고, 한 주사기에서, 폴리카보네이트 멤브레인을 통과하고, 다른 주사기로 입자를 밀어 넣음으로써 압출을 시작합니다. 20번 반복합니다. 그런 다음 압출된 입자를 미세 원심 분리튜브로 수집합니다.RNase 가 없는 물에 밀리리터 당 1 밀리그램 펩티드 농도로 펩티드 스톡을 준비합니다. 후생 지질 코팅 다공성 실리콘 나노 입자를 포함하는 마이크로 원심 분리기 튜브에서 펩티드 스톡의 마이크로리터 100 마이크로리터와 파이펫을 부드럽게 추가합니다. 튜브를 실온에서 20분 동안 정전기상태로 유지합니다.과도한 펩타이드 또는 siRNA 및 기타 부형제를 제거하려면 실온에서 1시간 동안 5, 000회 g에서 회전하여 30킬로달톤 원심 필터로 세척하십시오. 원심 분리기는 동일한 설정에서 PBS의 1 밀리리터로 두 번 더. 원심분리에 따라, 최종 펩타이드-컨쥬게이드 후공지질 코팅 다공성 실리콘 나노입자를 원하는 농도로 PBS에서 재연한다.입자는 적어도 30 일 동안 영하 80도에서 알리인용및 저장될 수 있습니다. fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 성공적인 합성은 구조적 변화를 일으키지 않고 30 일 동안 저장되고 해동 될 수있는 균일하고 약간 불투명한 용액을 생성해야합니다. 비율 및 농도를 최적화하지 못하면 반복되는 동결 해동 주기뿐만 아니라 적재 시 집계될 수 있습니다.입자가 압출됨에 따라 동적 광 산란에 의해 측정된 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 평균 유체 역학 직경은 약 200 나노미터여야 하며 평균 제타 전위는 약 7 밀리볼트가 되어야 한다. 표적화 펩티드를 사용하여 표면 변형 후 전체 직경은 230 나노미터 미만이어야하며 평균 제타 전위가 마이너스 3.4 밀리볼트로 감소합니다. 융합은 심포성 플루오로포레 DiI와 후생지질을 표시하고 공초점 현미경을 사용하여 체외 국소화를 관찰함으로써 확인될 수 있다.성공적인 융합은 후생성 다공성 실리콘 나노입자의 지질이 DiI를 플라즈마 멤브레인으로 옮기고 리소좀과 독립적으로 국한화될 때 관찰된다. 실패한 융합은 세포의 세포질 내의 DiI 국소화및 리소좀과의 공동 국소화를 보여줄 것이다. 이 fusogenic 나노 입자 시스템은 지금 세균성 감염 뿐 아니라 암 보조 치료 및 암 면역 요법에서 치료 응용을 위해 사용되고 있습니다.이 프로토콜은 siRNA 보다 더 많은 로드에 더욱 최적화될 수 있습니다. fusogenic 나노 입자 시스템은 mRNAs 및 CRISPR/Cas9 복합체와 같은 더 큰 성전환 페이로드를 적재하고 전달할 수 있는 잠재력을 보여주었습니다.

Research

JoVE Journal

Engineering

Optical Trapping of Nanoparticles

나노 입자의 광학 트래핑

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

연구

공학

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

코르크 마개로 금 나노 입자와 질소 도핑 된 탄소 나노 튜브 컵의 합성과 기능화

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Monolayer Contact Doping of Silicon Surfaces and Nanowires Using Organophosphorus Compounds

유기 화합물을 사용하여 실리콘 표면과 나노 와이어의 단층 연락 도핑

Monolayer Contact Doping (MLCD) is a simple method for doping of surfaces and nanostructures1. MLCD results in the formation of highly controlled, ultra ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

액체 환경에서의 펄스 자외선 레이저 조사에 의한 실리콘 표면의 젖음성의 선택 영역 수정

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Silicon Metal-oxide-semiconductor Quantum Dots for Single-electron Pumping

단일 전자 펌핑 실리콘 금속 - 산화물 - 반도체 양자 점

As mass-produced silicon transistors have reached the nano-scale, their behavior and performances are increasingly affected, and often deteriorated, by ...

Synthesis and Functionalization of 3D Nano-graphene Materials: Graphene Aerogels and Graphene Macro Assemblies

합성 및 3D 나노 그래 핀 소재의 기능화 : 그래 핀 에어로젤과 그래 핀 매크로 어셈블리

Efforts to assemble graphene into three-dimensional monolithic structures have been hampered by the high cost and poor processability of graphene. ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

전송 인쇄하여 수소 첨가 미세 결정 실리콘 태양 전지에 빛 트래핑 실버 나노 구조의 통합

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

계층화 된 티탄 투명 필름의 층간 공간에서 집계하지 않고 금 나노 입자의 제자리 합성에

Combinations of metal oxide semiconductors and gold nanoparticles (AuNPs) have been investigated as new types of materials. The in situ synthesis of AuNPs ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Procedure for the Transfer of Polymer Films Onto Porous Substrates with Minimized Defects

결함이 최소화된 다공성 기판에 폴리머 필름 을 이송하는 절차

The fabrication of devices containing thin film composite membranes necessitates the transfer of these films onto the surfaces of arbitrary support ...