Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
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Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health, através de contrato # R01 AI132413-01.

1. síntese de nanopartículas de silício poroso (pSINPs)
Cuidado: Sempre tenha cuidado ao trabalhar com ácido fluorídrico (HF). Siga todas as guias de segurança, de acordo com sua ficha de dados de segurança (SDS), lidar com quaisquer produtos químicos que contenham HF em uma coifa e usar equipamento de protecção adequado (EPI; luvas duplas com luvas de butilo do lado de fora, butil avental com jaleco e por baixo, rosto proteger com óculos de segurança por baixo). Todas as universidad...

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	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

Síntese de nanopartículas de silício poroso é mostrado na Figura 5. O passo fundamental na síntese de fusogenic pSiNPs está na etapa de carregamento (etapa 3). Se as nanopartículas fusogenic são agregar pós-síntese (Figura 3), o motivo pode ser devido ao seguinte: (1) estoque de cloreto de cálcio não foi homogênea preparado, assim passo 3.1.2 deve ser cuidadosamente seguido ou refinado; ou (2) a relação de pSiNP: siRNA: CaCl2 ou a conce...

Terapia genética modula a expressão de genes específicos para obter um resultado terapêutico. Inúmeras ferramentas para modulação de genes foram descobertas e estudadas, incluindo ácido ribonucleico interferência (RNAi) usando oligonucleotídeos (por exemplo, curto interferência do RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmídeo5,6, nucleases (por exemplo, dedo de zinco, TALENS)7,8e CRISPR/Cas9 sistemas9,10. Enquanto mecanismo de cada ferramenta de ação é diferente, todas as ferramentas devem alcançar o citoplasma da célula ou o núcleo para ser ativo. Como tal, embora estas ferramentas têm comprovado para induzir um efeito significativo na modulação de expressão gênica in vitro, a eficácia in vivo sofre entraves extracelulares e intracelulares. Devido ao fato de que as ferramentas são de origem biológica, muitas enzimas e sistemas de limpeza existem em nosso corpo que têm a capacidade de degradar ou remover as moléculas estrangeiras11. Mesmo no caso que as ferramentas atingem a célula-alvo, eles sofrem de endocitose; um modo de captação celular que encapsula e prende as ferramentas em vesículas ácidas do estômago-como que degradam ou expulsar as ferramentas fora da célula. De fato, estudos têm mostrado que nanopartículas de lipídios são endocytosed através de macropinocitose, da qual cerca de 70% do siRNA são exocytosed das células dentro de 24h de captação12,13. A maior parte do restante siRNA é degradada através da via lisossomal, e em última análise, apenas 1-2% de siRNA que inicialmente entra na célula com as nanopartículas alcançar CDDP fuga potencialmente submeter-se a RNAi13,14 .
Recentemente desenvolvemos a nanopartículas de silício poroso de fusogenic (F-pSiNPs) que têm um núcleo de siRNA-carregado composto de nanopartículas de silício poroso e um fusogenic lipídica shell15. Os F-pSiNPs apresenta três grandes vantagens sobre outros sistemas de entrega convencional do oligonucleotide: (1) um lipídio fusogenic revestimento que permite que as partículas de ignorar a endocitose e entregar a carga inteira diretamente no citoplasma celular (contra o 1-2% alcançado por partículas de endocytosed13,14) (Figura 1); (2) alto carregamento em massa de siRNA no pSiNPs (> 20% em peso em comparação com 1-15% em peso por sistemas convencionais)15, que rapidamente degradar no citoplasma (uma vez que as partículas do núcleo derramou o revestimento lipídico através de captação de fusogenic) para liberar o siRNA; e (3) visando a conjugação de peptídeo para orientação seletiva para desejado tipos de células in vivo.
O sistema F-pSiNP demonstrou silenciamento eficácia significativa do gene (> 95% in-vitro; > 80% in vivo) e o subsequente efeito terapêutico em um modelo de mouse fatal de S. aureus pneumonia; os resultados dos quais foram anteriormente publicados15. No entanto, a estrutura complexa do sistema F-pSiNP requer manipulação delicada e otimização de aperfeiçoá-lo para gerar nanopartículas uniformes e estáveis. Assim, o objetivo deste trabalho é apresentar um protocolo completo, bem como estratégias de otimização para a síntese, functionalization e caracterização de F-pSiNPs para ser usado no alvo entrega de siRNAs para efeito silencioso potente gene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

Com o advento da terapia gênica, tornou-se o desenvolvimento de um sistema de entrega eficaz em vivo do nucleotide-carga de importação paralela. Nanopartículas de silício poroso de Fusogenic (F-pSiNPs) recentemente demonstraram alto vivo em eficácia devido a sua alta do oligonucleotide carregar a capacidade e a via de absorção celular exclusivo que evita a endocitose de silenciamento do gene. A síntese de F-pSiNPs é um processo de várias etapa que inclui: (1) carregamento e selagem de payloads do oligonucleotide nos poros do silicone; (2) revestimento simultâneo e dimensionamento de lipídios fusogenic em torno dos núcleos de silício poroso; e (3) conjugação de direcionamento de peptídeos e de lavagem para remover o excesso do oligonucleotide, detritos de silício e peptídeo. Uniformidade de tamanho da partícula é caracterizada pela difusão dinâmica da luz, e sua estrutura casca-núcleo pode ser verificada por microscopia eletrônica de transmissão. A absorção de fusogenic é validada por carregar um lipofílico tingir, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), para a fusogenic lipídica e tratá-la às pilhas in vitro para observar para coloração contra a membrana plasmática endocítica localizações. As direcionamento e in vivo eficácias silenciar do gene anteriormente foram quantificadas em um modelo do rato de pneumonia de Staphylococcus aureus , em que o peptídeo alvo é esperado para ajudar o F-pSiNPs a casa para o local da infecção. Além da sua aplicação na infecção por S. aureus , o sistema F-pSiNP pode ser usado para entregar qualquer do oligonucleotide para a terapia de gene de uma vasta gama de doenças, incluindo doenças auto-imunes, câncer e infecções virais.

Uma síntese bem sucedida de fusogenic pSiNPs deve produzir uma solução homogênea, ligeiramente opaca (Figura 3a). Falha para otimizar a relação e a concentração de pSiNPs: siRNA: CaCl2 pode levar a agregação durante o carregamento (Figura 3b). Como as partículas são extrudadas através de membranas de 200 nm, o diâmetro médio hidrodinâmico da pSiNPs de fusogenic medidos por DLS deve ser aproximadamente 2...

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Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Demonstramos a síntese de nanopartículas de silício poroso fusogenic para entrega efectiva do oligonucleotide in vitro e in vivo. Nanopartículas de silício poroso são carregadas com siRNA para formar o núcleo, que é revestido por fusogenic lipídios através da extrusão para formar o reservatório. Direcionamento functionalization moiety e caracterização de partículas estão incluídos.

Síntese e caracterização de nanopartículas de silício poroso de Fusogenic para a entrega do Oligonucleotide Functionalization

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

Este protocolo descreve a síntese de um sistema de nanopartículas que é capaz de silenciar genes in vivo, fornecendo siRNAs com alta eficiência. Ao simplesmente trocar o peptídeo direcionado e a carga de siRNA, as nanopartículas fusogênicas podem ser usadas como uma formulação terapêutica potencial para doenças que requerem modulação genética in vivo. Publicamos resultados anteriormente usando a nanoplataforma fusogênica contra infecções bacterianas gram-positivas silenciando um gene que codifica para inflamação em macrófagos para acabar com a inflamação crônica.Antes de realizar este procedimento, monte uma célula de etch Teflon contendo um wafer de silício em uma solução de ácido fluorídrico de três para um. Execute uma corrente alternada de uma posição de onda quadrada com uma baixa densidade de corrente de 50 miliamperes por centímetro quadrado por 0,6 segundos e uma alta densidade de corrente de 400 miliamperes por centímetro quadrado por 0,36 segundos repetida por 500 ciclos. Uma vez que a gravação esteja terminada, remova a célula do circuito e enxágue cuidadosamente a solução de ácido fluorídrico usando uma seringa.Em seguida, enxágue três vezes com etanol. Para retirar a camada porosa do wafer de silício, primeiro encha o poço da célula de etch com 10 mililitros de uma solução de ácido fluorídrico de um a 29. Em seguida, execute uma constante de 3,7 miliamperes por centímetro quadrado por 250 segundos.Uma vez que a gravação esteja terminada, remova a célula do circuito. A camada de silício poroso pode ter ondulações visíveis, indicando desprendimento do wafer de silício cristalino. Lave suavemente a solução de ácido fluorídrico e enxágue três vezes cada com etanol e água.Usando uma ponta de pipeta, quebre firmemente a circunferência da camada de silício poroso para um desprendimento completo. Usando etanol, colete os fragmentos de silício porosos, ou chips, da célula de etch Teflon em um barco de pesagem. Em seguida, transfira os chips para um frasco de vidro para armazenamento.Em seguida, substitua o etanol no frasco de vidro contendo os chips de silício porosos por dois mililitros de água sem RNase. Tampe firmemente e sele o frasco usando Parafilm. Coloque o frasco de vidro em um banho de sonicator e suspenda de tal forma que o volume de chips de silício porosos esteja completamente submerso abaixo da superfície do banho de água.Para evitar perda significativa de água durante a sonicação, coloque um frasco volumoso cheio de água, invertido para que a abertura do frasco toque a superfície do banho de água. Em seguida, sonicar os chips de silício poroso por 12 horas a 35 kilohertz com uma potência RF de 48 watts. Após a sonicação, coloque o frasco de vidro em uma superfície plana por uma hora para permitir que as partículas maiores se instalem na parte inferior.Em seguida, colete o supernatante usando uma pipeta. Em um frasco de vidro, adicione 72,55 microliters de solução DMPC, 15,16 microliters de solução DSPE-PEG e 19,63 microliters de solução DOTAP, e misture por pipetação. Coloque o frasco em um capô de fumaça com uma tampa solta para permitir que o solvente evapore durante a noite.O filme seco será uma substância nublada, dura, semelhante a gel no fundo do frasco. Em seguida, coloque um tubo de microcentrifuge contendo 150 microliters de nanopartículas de silício porosas em um banho de sônica gelado previamente preparado. Sob uma ultrassonização de 15 minutos, pipeta suavemente 150 microliters de siRNA e 700 microliters de cloreto de cálcio de dois molares nas nanopartículas porosas de silício.Remova o tubo contendo um mililitro de nanopartículas de silício porosas revestidas de cálcio do sonicador. Encha um béquer largo com água deionizada. Mergulhe uma membrana de policarbonato e quatro suportes de filtro flutuando-os na superfície da água.Em seguida, monte um kit de extrusão liposoma seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, hidrate o filme lipídado seco no frasco de vidro com um mililitro das nanopartículas de silício porosas cobertas de cálcio. Pipeta até que todos os lipídios tenham levantado do fundo do frasco e uma solução nebulosa e homogênea seja observada.Adicione uma barra de agitação magnética ao frasco de vidro e coloque o frasco em uma placa quente para aquecer as partículas a 40 graus Celsius enquanto agita magneticamente a solução por 20 minutos. Depois disso, conecte uma seringa vazia a um lado da extrusora. Em seguida, encha outra seringa com um mililitro da solução de nanopartículas de silício revestida de lipídio, e anexe a seringa ao outro lado da extrusora.Comece a extrusão empurrando o pistão lentamente para empurrar as partículas de uma seringa, através da membrana de policarbonato, e para a outra seringa. Repita 20 vezes. Então, colete as partículas extrudadas em um tubo de microcentrífuga.Prepare um estoque de peptídeos com uma concentração de peptídeo de um miligrama por mililitro na água sem RNase. No tubo de microcentrifuge contendo as nanopartículas de silício porosas revestidas de lipídio fusogênico, adicione 100 microliters do caldo de peptídeo e pipeta suavemente. Mantenha o tubo estático à temperatura ambiente por 20 minutos.Para remover o excesso de peptídeo ou siRNA e outros excipientes, lave em um filtro centrífugo de 30 quilodalton girando a 5.000 vezes g à temperatura ambiente por uma hora. Centrifugar mais duas vezes com um mililitro de PBS sob as mesmas configurações. Após a centrifugação, resuspenque o último peptídeo-conjugado com nanopartículas de silício porosa revestida de lipídio em PBS na concentração desejada.As partículas podem ser aliquoted e armazenadas a menos 80 graus Celsius por pelo menos 30 dias. Uma síntese bem sucedida de nanopartículas de silício porosa fusogênicas deve produzir uma solução homogênea, ligeiramente opaca, que pode ser armazenada por 30 dias e descongelada sem causar alterações estruturais. A falha em otimizar a proporção e concentração, bem como ciclos repetidos de congelamento-degelo podem levar à agregação após o carregamento.À medida que as partículas são extrudidas, o diâmetro hidrodinâmico médio das nanopartículas de silício porosa fusogênicas medidos pela dispersão dinâmica da luz deve ser de aproximadamente 200 nanômetros e o potencial médio zeta aproximadamente positivo de sete milivolts. Após a modificação da superfície com peptídeos de mira, o diâmetro total deve ser inferior a 230 nanômetros, e o potencial zeta médio diminui para menos 3,4 milivolts. A fusão pode ser confirmada rotulando os lipídios fusogênicos com o Fluorophore Lipofófilo DiI e observando a localização in vitro usando microscopia confocal.A fusão bem sucedida é observada quando os lipídios das nanopartículas de silício porosas fusogênicas transferem o DI PARA a membrana plasmática e são localizados independentes de lisossomos. A fusão mal sucedida mostrará a localização do DII dentro do citoplasma da célula e a co-localização com licomentos. Este sistema de nanopartículas fusogênicas está sendo usado para aplicações terapêuticas não apenas em infecções bacterianas, mas também na terapia adjuvante do câncer e imunoterapia contra o câncer.Este protocolo pode ser ainda mais otimizado para carregar mais do que siRNAs. O sistema de nanopartículas fusogênicas tem mostrado potencial no carregamento e entrega de cargas aniônicas maiores, como os complexos mRNAs e CRISPR/Cas9.

Research

JoVE Journal

Engineering

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