Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Эта работа поддерживается национальными институтами здравоохранения через контракт # R01 AI132413-01.

1. синтез наночастиц пористого кремния (pSINPs)
Предупреждение: Всегда будьте осторожны при работе с фтористоводородную кислоту (HF). Выполните все руководства по безопасности согласно ее лист данным по безопасности (ПБ), обрабатывать любые ВЧ содержащих химические вещества в ...

<ol>
	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications.">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li><li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+gene+editing:+delivery+and+regulatory+perspectives.">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).</li><li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs.">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li><li>Dai, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

На рисунке 5показан синтеза наночастиц пористого кремния. Важным шагом в синтезе fusogenic pSiNPs находится в Загрузка шаг (шаг 3). Если объединение наночастиц fusogenic после синтеза (рис. 3), причиной может быть связано следующее: (1) хлорид кальция запасов не было под?...

Генная терапия модулирует конкретный ген выражение для получения терапевтические результаты. Многочисленные инструменты для модуляции гена были обнаружены и изучены, включая рибонуклеиновой кислоты вмешательства (RNAi) с помощью олигонуклеотиды (например, короткие интерферирующие РНК (siRNA)1,2, микроРНК (miRNA)3,4 ), ДНК плазмиды5,6, nucleases (например, цинковый палец, ТАЛЕНС)7,8и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем9,10. Хотя механизм действия каждого инструмента отличается, все инструменты должны достичь цитоплазмы клетки или ядро быть активными. Таким образом хотя эти инструменты доказали, чтобы вызвать значительный эффект в модуляции экспрессии генов в пробирке, в естественных условиях эффективность страдает от внеклеточные и внутриклеточных препятствий. С тем, что инструменты являются биологического происхождения, многие ферменты и распродажа систем существуют в нашем теле, которые имеют возможность снизить или удалить иностранных молекул11. Даже в случае инструменты достижения целевую ячейку, они страдают от эндоцитоз; режим клеточного поглощения, который инкапсулирует и ловушки инструменты в кислой желудка как пузырьки, которые деградируют или высылать инструменты из клетки. В самом деле исследования показали, что наночастицы липидов являются endocytosed через макропиноцитозом, из которых около 70% малых интерферирующих РНК exocytosed от клеток в течение 24 ч поглощения12,13. Большинство из оставшихся малых интерферирующих РНК деградации через лизосомальных пути, и в конечном итоге лишь 1-2% малых интерферирующих РНК, которая первоначально проникает в клетку с наночастицами добиться от англ побег подвергаться потенциально RNAi13,14 .
Мы недавно разработали fusogenic пористого кремния наночастиц (F-pSiNPs), у малых интерферирующих РНК загружается ядро, состоящий из пористого кремния наночастиц и липидов оболочки fusogenic15. F-pSiNPs представляют три основных преимущества перед другими системами доставки обычных олигонуклеотида: (1) fusogenic липидов, покрытие, что позволяет частицы обойти эндоцитоза и доставить все полезные данные непосредственно в цитоплазме клеток (по сравнению с 1-2% достигнутые endocytosed частицы13,14) (рис. 1); (2) высокая массовой загрузки интерферирующей РНК в pSiNPs (> 20 wt % по сравнению с 1-15 wt % обычных систем)15, который быстро деградируют в цитоплазме (после основных частиц пролить липидного покрытия через fusogenic поглощения) для выпуска малых интерферирующих РНК; и (3) ориентации пептид сопряжения для селективного самонаведения для желаемого типы клеток в естественных условиях.
F-pSiNP система продемонстрировала значительный Джин глушителей эффективность (> 95% в пробирке; > 80% в естественных условиях) и последующего терапевтического эффекта в роковой мыши модели S. aureus пневмонии; результаты которого были опубликованы ранее15. Однако сложная структура системы F-pSiNP требует осторожного обращения и доработаны оптимизации для создания единообразной и стабильной наночастиц. Таким образом цель этой работы – представить подробный протокол, а также стратегий оптимизации для синтеза, функционализации и характеристика F-pSiNPs использоваться в адресности малые интерферирующие РНК для глушителей эффект мощным ген.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

С появлением генной терапии разработка системы доставки эффективной в естественных условиях нуклеотида грузоподъемность стала параллельного импорта. Fusogenic пористого кремния наночастиц (F-pSiNPs) недавно продемонстрировали высокий в-vivo гена, глушителей эффективность из-за его высокой олигонуклеотида загрузки способности и уникальные клеточного поглощения путь, который избегает эндоцитоза. Синтез F-pSiNPs представляет собой многоэтапный процесс, который включает в себя: (1) Загрузка и герметизации полезных олигонуклеотида в порах кремния; (2) одновременно покрытие и калибровки fusogenic липидов вокруг ядра пористого кремния; и (3) спряжение ориентации пептидов и мойка для удаления избыточных олигонуклеотида, кремния мусора и пептида. Однородность размера частицы характеризуется Динамическое рассеяние света, и его структура ядро оболочка может быть проверена путем просвечивающей электронной микроскопии. Fusogenic усвоение проверяется путем загрузки липофильных красителя, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (дии), в fusogenic липидного бислоя и рассматривая его клетки in vitro соблюдать плазматической мембраны, окрашивание по сравнению с endocytic локализаций. Ориентации и in vivo гена глушителей узкоспециализированного ранее были количественно в мышиной модели пневмонии золотистый стафилококк , в котором, как ожидается, помочь F-pSiNPs в дом к месту инфекции таргетинга пептид. Помимо его применения в инфекции S. aureus F-pSiNP система может использоваться для доставки любого олигонуклеотида для генной терапии широкого спектра заболеваний, в том числе вирусные инфекции, рак и аутоиммунные заболевания.

Успешный синтез fusogenic pSiNPs следует производить однородный, слегка непрозрачные решения (рис. 3a). Неспособность оптимизировать соотношение и концентрации pSiNPs: siRNA: CaCl2 может привести к агрегации после загрузки (рис. 3b). Поскольку част?...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Мы демонстрируем синтеза наночастиц fusogenic пористого кремния для эффективного в vitro и in vivo олигонуклеотида доставки. Пористого кремния наночастиц загружаются с siRNA сформировать ядро, которое покрыно fusogenic липиды путем экструзии для формирования корпуса. Нацеленности остаток функционализации и гранулометрического состава.

Синтез, функционализации и характеристика Fusogenic пористого кремния наночастиц для доставки олигонуклеотида

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

Этот протокол описывает синтез системы наночастиц, которая способна заглушать гены in vivo, обеспечивая siRNAs с высокой эффективностью. Просто обмениваясь целевым пептидом и полезной нагрузкой siRNA, фузогенные наночастицы могут быть использованы в качестве потенциальной терапевтической формулировки для заболеваний, которые требуют модуляции гена in vivo. Ранее мы опубликовали результаты использования фузогенной наноплатформы против грамположительных бактериальных инфекций, заглушая ген, который кодирует для воспаления в макрофагах, чтобы прекратить хроническое воспаление.Перед выполнением этой процедуры, собрать тефлоновый etch ячейки, содержащие кремниевые пластины в три к одному раствора гидрофторной кислоты. Вы запустите переменный ток квадратной формы волны с низкой плотностью тока 50 миллиампер на сантиметр в квадрате в течение 0,6 секунды и высокой плотностью тока 400 миллиампер на сантиметр в квадрате в течение 0,36 секунды повторяется в течение 500 циклов. Как только травление закончено, удалите клетку из цепи и тщательно прополощите раствор гидрофторной кислоты с помощью шприца.Затем трижды промыть этанолом. Чтобы снять пористый слой с кремниевой пластины, сначала заполните колодец травяной клетки 10 миллилитров раствора гидрофторной кислоты от одного до 29. Затем запустите константу 3,7 миллиампера на сантиметр в квадрате в течение 250 секунд.Как только травление закончено, удалите ячейку из цепи. Пористый слой кремния может иметь видимые рябь, что указывает на отслоение от кристаллической кремниевой пластины. Аккуратно промыть раствор гидрофторной кислоты и промыть по три раза этанолом и водой.Используя наконечник пипетки, твердо трещины окружности пористого кремниевого слоя для полного отслоения. Используя этанол, соберите пористые фрагменты кремния, или чипы, из тефлоновой травяной клетки в лодку для взвешивания. Затем перенесите чипсы на стеклянный флакон для хранения.Затем замените этанол в стеклянном флаконе, содержащем пористую кремниевую стружку, двумя миллилитров воды без RNase. Твердо крышка и печать флакон с помощью Parafilm. Поместите стеклянный флакон в ванну sonicator и приостановлено таким образом, что объем пористых кремниевых чипов полностью погружены под поверхностью водяной ванны.Чтобы предотвратить значительную потерю воды во время звуковой связи, поместите объемную колбу, наполненную водой, перевернутую так, чтобы отверстие колбы касаось поверхности водяной бани. Затем sonicate пористые кремниевые чипы в течение 12 часов на 35 килогерц с RF мощностью 48 Вт. После sonication, поместите стеклянный флакон на плоскую поверхность в течение одного часа, чтобы более крупные частицы оседают на дне.Затем соберите супернатант с помощью пипетки. В стеклянный флакон добавьте 72,55 микролитров раствора DMPC, 15,16 микролитров раствора DSPE-PEG и 19,63 микролитров раствора DOTAP и смешайте с помощью пипетки. Поместите флакон в дымовой капот с свободной крышкой, чтобы растворитель испарился на ночь.Высушенная пленка будет облачным, твердым, гелеобразным веществом на дне флакона. Далее поместите микроцентрифуговую трубку, содержащую 150 микролитров пористых кремниевых наночастиц, в ранее подготовленную ледяную звуковую ванну. Под 15-минутной ультразвуковой системой аккуратно пипетки 150 микролитров сирны и 700 микролитров двухмяльного хлорида кальция в пористые кремниевые наночастицы.Удалить трубку, содержащую один миллилитр siRNA-загруженных кальция покрытием пористых кремниевых наночастиц из sonicator. Заполните широкий стакан с деионизированной водой. Замочите поликарбонатную мембрану и четыре фильтра, плавая их на поверхности воды.Затем соберите набор экструзии липосомы, следуя инструкциям производителя. Затем увлажняйте высушенную липидную пленку в стеклянном флаконе одним миллилитром пористых кремниевых наночастиц с покрытием siRNA. Пипетка до тех пор, пока все липиды не поднялись со дна флакона и не наблюдается мутный, однородный раствор.Добавьте магнитный перемешивая адвокатский стойку к стеклянному флакону, и поместите флакон на горячую плиту для того чтобы нагреть частицы до 40 градусов Celsius пока магнитно помешивая разрешение на 20 минут. После этого прикрепите пустой шприц к одной стороне экструдера. Затем заполните еще один шприц одним миллилитром пористого кремниевого наночастица с липидным покрытием и прикрепите шприц к другой стороне экструдера.Начните экструзию, нажав поршень медленно, чтобы подтолкнуть частицы от одного шприца, через поликарбонатную мембрану, и в другой шприц. Повторите 20 раз. Затем соберите экструдированные частицы в микроцентрифугную трубку.Приготовьте пептидный бульон с концентрацией пептида по миллиграмму на миллилитр в воде, свободной от RNase. В микроцентрифуговую трубку, содержащую фузогенные липидные пористые кремниевые наночастицы, аккуратно добавить 100 микролитров пептидного бульона и пипетку. Держите трубку статичной при комнатной температуре в течение 20 минут.Чтобы удалить избыток пептида или siRNA и других excipients, мыть в 30-килодальтон центробежный фильтр, вращаясь на 5000 раз г при комнатной температуре в течение одного часа. Центрифуга еще два раза с одним миллилитром PBS в тех же настройках. После центрифугации, повторное использование окончательного пептида спряженных фузогенных липидов покрытием пористых кремниевых наночастиц в PBS при желаемой концентрации.Частицы могут быть aliquoted и храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию, по крайней мере 30 дней. Успешный синтез фузогенных пористых кремниевых наночастиц должен производить однородный, слегка непрозрачный раствор, который может храниться в течение 30 дней и оттаивать, не вызывая структурных изменений. Неспособность оптимизировать соотношение и концентрацию, а также неоднократные циклы замораживания-оттепели могут привести к агрегированию при загрузке.По мере экструдирования частиц средний гидродинамический диаметр фузогенных пористых кремниевых наночастиц, измеряемых динамическим рассеянием света, должен быть примерно 200 нанометров, а средний зета-потенциал примерно положительные семь милливольт. После модификации поверхности с целевыми пептидами общий диаметр должен быть менее 230 нанометров, а средний зета-потенциал уменьшается до минус 3,4 милливольт. Слияние может быть подтверждено путем маркировки фузогенных липидов с липофилическим флюорофором DiI и наблюдения локализации in vitro с помощью конфокальной микроскопии.Успешное слияние наблюдается, когда фузогенные пористые липиды кремниевой наночастицы передают DiI в плазменную мембрану и локализируются независимо от лизосом. Неудачное слияние покажет локализацию DiI в цитоплазме клетки и ко-локализацию с лизосомами. Эта фузогенная система наночастиц в настоящее время используется для терапевтического применения не только в бактериальных инфекциях, но и в адъювантной терапии рака и иммунотерапии рака.Этот протокол может быть дополнительно оптимизирован для загрузки больше, чем siRNAs. Система фузогенных наночастиц продемонстрировала потенциал в погрузке и доставке более крупных анионных полезных нагрузок, таких как мРНК и комплексы CRISPR/Cas9.

Research

JoVE Journal

Engineering

Optical Trapping of Nanoparticles

Оптический захват наночастиц

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

Синтез и Функционализация легированного азотом Кубки углеродных нанотрубок наночастицами золота как корковыми пробками

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Monolayer Contact Doping of Silicon Surfaces and Nanowires Using Organophosphorus Compounds

Монослоя Связаться легирования кремния поверхностей и нанопроволок Использование фосфорорганических соединений

Monolayer Contact Doping (MLCD) is a simple method for doping of surfaces and nanostructures1. MLCD results in the formation of highly controlled, ultra ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

Селективный Площадь Модификация поверхности кремния смачиваемости импульсным УФ лазерного облучения в жидкой среде

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Silicon Metal-oxide-semiconductor Quantum Dots for Single-electron Pumping

Кремний Металл-оксид-полупроводниковых квантовых точек для одного электрона Перекачивание

As mass-produced silicon transistors have reached the nano-scale, their behavior and performances are increasingly affected, and often deteriorated, by ...

Synthesis and Functionalization of 3D Nano-graphene Materials: Graphene Aerogels and Graphene Macro Assemblies

Синтез и Функционализация 3D нано-графена материалов: графена АЭРОГЕЛЕЙ и графена Макро Ассамблей

Efforts to assemble graphene into three-dimensional monolithic structures have been hampered by the high cost and poor processability of graphene. ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

Интеграция легкими прилипания Серебряные наноструктур в гидрогенизированное микрокристаллическая кремниевых солнечных элементов по трансферная печать

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

В Ситу Синтез наночастиц золота без агрегации в прослойке пространстве Layered титаната прозрачные пленки

Combinations of metal oxide semiconductors and gold nanoparticles (AuNPs) have been investigated as new types of materials. The in situ synthesis of AuNPs ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Обогащать и расширять редких антиген специфические Т-клеток с магнитных наночастиц

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Procedure for the Transfer of Polymer Films Onto Porous Substrates with Minimized Defects

Процедура передачи полимерных пленок на пористые субстраты с минимичными дефектами

The fabrication of devices containing thin film composite membranes necessitates the transfer of these films onto the surfaces of arbitrary support ...