Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Este trabajo es apoyado por los institutos nacionales de salud a través de contrato # R01 AI132413-01.

1. síntesis de nanopartículas de silicio poroso (pSINPs)
PRECAUCIÓN: Siempre tenga cuidado al trabajar con ácido fluorhídrico (HF). Siga a todas las guías de seguridad según su hoja de datos de seguridad (SDS), manejar productos químicos que contiene HF en una campana de humos y usar equipo de protección personal (PPE, guantes doble con guantes de butilo en el exterior, delantal de butilo con bata de laboratorio por debajo, cara proteger con gafas de seguridad debajo). Todas las univers...

<ol>
	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications.">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li><li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+gene+editing:+delivery+and+regulatory+perspectives.">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).</li><li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs.">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li><li>Dai, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

Síntesis de nanopartículas de silicio poroso se muestran en la figura 5. El paso crítico en la síntesis de pSiNPs fusogénicas es en el paso de carga (paso 3). Si las nanopartículas fusogénicas están agregando la síntesis (figura 3), la razón puede deberse a lo siguiente: (1) stock de cloruro de calcio forma homogénea no estaba preparada, así paso 3.1.2 debe ser cuidadosamente seguido o refinado; o (2) la relación de pSiNP: siRNA: CaCl2 o ...

Terapia génica modula la expresión del gen específico para obtener un resultado terapéutico. Numerosas herramientas para modulación de genes han sido descubiertos y estudiados, incluyendo el ácido ribonucleico de interferencia (ARNi) usando oligonucleótidos (por ejemplo, corta interferencia RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), ADN plásmidos5,6, nucleasas (p. ej., dedo de zinc, TALENS)7,8y CRISPR/Cas9 sistemas9,10. Mientras que el mecanismo de la herramienta de acción es diferente, todas las herramientas deben alcanzar el citoplasma de la célula o el núcleo activo. Como tal, mientras que estas herramientas han demostrado para inducir un efecto significativo en la modulación de la expresión génica in vitro, la eficacia in vivo sufre obstáculos extracelulares e intracelulares. Debido a que las herramientas son de origen biológico, muchas enzimas y sistemas de separación existen en nuestro cuerpo que tienen la capacidad para degradar o eliminar los extranjeros moléculas11. Incluso en el caso que los instrumentos lleguen a la célula diana, sufren de endocitosis; un modo de absorción celular que encapsula y atrapa las herramientas en vesículas de estómago como ácidas que degradan o expulsan las herramientas fuera de la célula. De hecho, estudios han demostrado que las nanopartículas lipídicas son endocytosed través de macropinocitosis, de los cuales aproximadamente el 70% de lo siRNA se exocytosed de las células dentro de las 24h de absorción12,13. La mayoría de lo restantes siRNA es degradada a través de la vía lisosomal, y alcanzar en última instancia solamente 1-2% de lo siRNA que inicialmente entra en la célula con las nanopartículas escape endosomal a potencialmente ARNi13,14 .
Recientemente hemos desarrollado nanopartículas de silicio poroso fusogénica (F-pSiNPs) que tienen un núcleo cargado de siRNA compuesta por nanopartículas de silicio poroso y fusogénicas lípidos concha15. F-pSiNPs presenta tres grandes ventajas sobre otros sistemas convencionales de oligonucleótidos: (1) un lípido fusogénicas capa que permite que las partículas de omitir la endocitosis y entregar la carga entera directamente en el citoplasma de la célula (en comparación con el 1-2% mediante la endocitosis partículas13,14) (figura 1); (2) alta carga de masa siRNA en la pSiNPs (> 20% de peso en comparación con el 1-15% de peso por los sistemas convencionales)15, que rápidamente se degradan en el citoplasma (una vez que las partículas del núcleo arrojan la capa lipídica mediante absorción fusogénicas) para liberar el siRNA; y (3) orientación verbal de péptido homing selectivo a deseado tipos celulares in vivo.
El sistema F-pSiNP ha demostrado eficacia de silenciamiento del gen significativo (> 95% en vitro; > 80% in vivo) y posterior efecto terapéutico en un modelo de ratón fatal de la pulmonía de S. aureus ; los resultados de que se publicaron previamente15. Sin embargo, la compleja estructura del sistema F-pSiNP requiere manejo delicado y optimización optimizado para generar nanopartículas de uniforme y estables. Así, el propósito de este trabajo es presentar un protocolo exhaustivo, así como estrategias de optimización de la síntesis, funcionalización y caracterización de F-pSiNPs para ser utilizado en la entrega específica de siRNAs para efecto de silenciamiento del gene potente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

Con el advenimiento de la terapia génica, ha sido el desarrollo de un sistema de entrega de efectivo en vivo nucleótido-carga de importación paralela. Nanopartículas de silicio poroso fusogénica (F-pSiNPs) recientemente han demostrado alta eficacia debido a su alta capacidad de cargamento y vía única absorción celular que evita la endocitosis de oligonucleótidos de silenciamiento del gen en vivo. La síntesis de F-pSiNPs es un proceso de múltiples paso que incluye: (1) de carga y sellado de cargas útiles de los oligonucleótidos en los poros de silicio; (2) simultánea capa y apresto de lípidos fusogénicas alrededor de los núcleos de silicio poroso; y (3) Conjugación de dirigidos a péptidos y lavado para eliminar exceso de oligonucleótidos, restos de silicio y péptidos. Uniformidad de tamaño de partícula se caracteriza por la dispersión ligera dinámica y su estructura de core-shell puede ser verificada por microscopía electrónica de transmisión. La absorción fusogénicas es validada por cargar un lipofílico del tinte, 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), en el bilayer del lípido fusogénicas y tratar a las células in vitro para observar membrana de plasma versus la coloración endocíticas localizaciones. Previamente se cuantificaron los efficacies gene silenciamiento de segmentación e in vivo en un modelo murino de neumonía por Staphylococcus aureus en el targeting peptide se espera que a la F-pSiNPs a casa en el sitio de la infección. Más allá de su aplicación en S. aureus la infección, el sistema de F-pSiNP puede utilizarse para entregar cualquier oligonucleótidos para terapia del gene de una amplia gama de enfermedades, incluyendo infecciones virales, cáncer y enfermedades autoinmunes.

Una síntesis exitosa de fusogénicas pSiNPs debe producir una solución homogénea, ligeramente opaca (figura 3a). Fracaso para optimizar la relación y la concentración de pSiNPs: siRNA: CaCl2 puede conducir a la agregación a la carga (figura 3b). Como se sacan las partículas a través de 200 membranas nm, el diámetro medio de la hidrodinámico de la pSiNPs fusogénicas medido por DLS debe ser aproximadamente 200...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Demostramos la síntesis de nanopartículas de silicio poroso fusogénicas para la entrega eficaz de oligonucleótidos in vitro e in vivo. Nanopartículas de silicio poroso están cargadas de siRNA para formar el núcleo, que es cubierto por fusogénicas lípidos a través de la protuberancia para formar la cáscara. Funcionalización de parte de la segmentación y caracterización de partículas están incluidos.

Síntesis, funcionalización y caracterización de nanopartículas de silicio poroso fusogénicas para entrega de oligonucleótidos

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

Este protocolo describe la síntesis de un sistema de nanopartículas que es capaz de silenciar los genes in vivo mediante la entrega de siRNAs con alta eficiencia. Simplemente intercambiando el péptido de orientación y la carga útil del aresmo, las nanopartículas fusogénicas pueden utilizarse como una formulación terapéutica potencial para enfermedades que requieren modulación génica in vivo. Hemos publicado previamente resultados utilizando la nanoplataforma fusógena contra las infecciones bacterianas grampositivas al silenciar un gen que codifica para que la inflamación en los macrófagos termine la inflamación crónica.Antes de realizar este procedimiento, ensamble una célula de grabado de teflón que contenga una oblea de silicio en una solución de ácido fluorhídrico de tres a uno. Ejecute una corriente alterna de una forma de onda cuadrada con una densidad de corriente baja de 50 miliamperios por centímetro cuadrado durante 0,6 segundos y una alta densidad de corriente de 400 miliamperios por centímetro cuadrado durante 0,36 segundos repetidos durante 500 ciclos. Una vez terminado el grabado, retire la célula del circuito y enjuague cuidadosamente la solución de ácido fluorhídrico con una jeringa.Luego, enjuague tres veces con etanol. Para levantar la capa porosa de la oblea de silicio, primero llene el pozo de la célula de grabado con 10 mililitros de una solución de ácido fluorhídrico de uno a 29. A continuación, ejecute una constante de 3,7 miliamperios por centímetro cuadrado durante 250 segundos.Una vez terminado el grabado, retire la celda del circuito. La capa de silicio poroso puede tener ondas visibles, lo que indica el desprendimiento de la oblea de silicio cristalino. Lave suavemente la solución de ácido fluorhídrico y enjuague tres veces cada una con etanol y agua.Usando una punta de pipeta, agrieta firmemente la circunferencia de la capa de silicio poroso para un desprendimiento completo. Usando etanol, recoja los fragmentos de silicio poroso, o virutas, de la célula de grabado de teflón en un bote de pesaje. A continuación, transfiera las virutas a un vial de vidrio para su almacenamiento.A continuación, reemplace el etanol en el vial de vidrio que contiene los chips de silicio poroso con dos mililitros de agua libre de RNase. Tapar firmemente y sellar el vial con Parafilm. Coloque el vial de vidrio en un baño sonicador y suspendido de tal manera que el volumen de virutas de silicio poroso esté completamente sumergido debajo de la superficie del baño de agua.Para evitar una pérdida significativa de agua durante la sonicación, coloque un matraz volumétrico lleno de agua, invertido de modo que la abertura del matraz toque la superficie del baño de agua. A continuación, sonicar los chips de silicio poroso durante 12 horas a 35 kilohercios con una potencia de RF de 48 vatios. Después de la sonicación, coloque el vial de vidrio sobre una superficie plana durante una hora para permitir que las partículas más grandes se asienten en la parte inferior.A continuación, recoja el sobrenadante con una pipeta. En un vial de vidrio, agregue 72,55 microlitros de solución DMPC, 15,16 microlitros de solución DSPE-PEG y 19,63 microlitros de solución DOTAP, y mezcle por pipeteo. Coloque el vial en una campana de humo con una tapa suelta para permitir que el disolvente se evapore durante la noche.La película seca será una sustancia turbia, dura y similar a un gel en la parte inferior del vial. A continuación, coloque un tubo de microcentrífuga que contenga 150 microlitros de nanopartículas de silicio poroso en un baño de sonicación helada previamente preparado. Bajo una ultrasonicación de 15 minutos, pipetea suavemente 150 microlitros de siRNA y 700 microlitros de cloruro de calcio de dos molares en las nanopartículas de silicio poroso.Retire del sonicador el tubo que contiene un mililitro de nanopartículas de silicio porosa recubiertas de calcio cargadas con siRNA. Llene un vaso de precipitados ancho con agua desionizada. Remoje una membrana de policarbonato y cuatro soportes de filtro flotando sobre la superficie del agua.A continuación, ensamble un kit de extrusión de liposoma siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, hidratar la película de lípidos secos en el vial de vidrio con un mililitro de nanopartículas de silicio porosa recubiertas de calcio cargadas con siRNA. Pipetear hasta que todos los lípidos se hayan levantado de la parte inferior del vial y se observe una solución turbia y homogénea.Agregue una barra de agitación magnética al vial de vidrio y coloque el vial en una placa caliente para calentar las partículas a 40 grados Celsius mientras agita magnéticamente la solución durante 20 minutos. Después de esto, coloque una jeringa vacía a un lado del extrusor. A continuación, llene otra jeringa con un mililitro de la solución de nanopartícula de silicio poroso recubierto de lípidos y conecte la jeringa al otro lado del extrusor.Comience la extrusión empujando el pistón lentamente para empujar las partículas de una jeringa, a través de la membrana de policarbonato y hacia la otra jeringa. Repita 20 veces. A continuación, recoja las partículas extruidas en un tubo de microcentrífuga.Preparar un caldo de péptido con una concentración de péptido de un miligramo por mililitro en agua libre de RNase. En el tubo de microcentrífuga que contiene las nanopartículas de silicio porosas fusógenas recubiertas de lípidos, agregue 100 microlitros del material de péptidos y pipetee suavemente. Mantenga el tubo estático a temperatura ambiente durante 20 minutos.Para eliminar el exceso de péptido o siRNA y otros excipientes, lave en un filtro centrífugo de 30 kilodalton girando a 5.000 veces g a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugar dos veces más con un mililitro de PBS bajo la misma configuración. Después de la centrifugación, resuspender las nanopartículas de silicio poroso fusogénico conjugado con péptido final en PBS a la concentración deseada.Las partículas pueden ser alícuotas y almacenadas a menos 80 grados Celsius durante al menos 30 días. Una síntesis exitosa de nanopartículas de silicio poroso fusogénico debe producir una solución homogénea, ligeramente opaca que puede almacenarse durante 30 días y descongelarse sin causar cambios estructurales. La falta de optimización de la relación y la concentración, así como los ciclos repetidos de congelación-descongelación pueden dar lugar a la agregación al cargar.A medida que se extruyen las partículas, el diámetro hidrodinámico medio de las nanopartículas de silicio porosogénico medidas por dispersión dinámica de luz debe ser de aproximadamente 200 nanómetros y el potencial de zeta medio aproximadamente positivo siete milivoltios. Después de la modificación de la superficie con péptidos de orientación, el diámetro global debe ser inferior a 230 nanómetros, y el potencial de zeta promedio disminuye a menos 3,4 milivoltios. La fusión puede confirmarse etiquetando los lípidos fusogénicos con el fluoróforo lipofílico DiI y observando la localización in vitro mediante microscopía confocal.La fusión exitosa se observa cuando los lípidos de la nanopartícula de silicio poroso fusogénico transfieren el DiI a la membrana plasmática y se localizan independientemente de los lisosomas. La fusión sin éxito mostrará la localización de DiI dentro del citoplasma de la célula y la co-localización con lisosomas. Este sistema fusogénico de nanopartículas se utiliza ahora para aplicaciones terapéuticas no sólo en infecciones bacterianas, sino también en la terapia adyuvante contra el cáncer y la inmunoterapia contra el cáncer.Este protocolo se puede optimizar aún más para cargar más que los siRNAs. El sistema de nanopartículas fusogénicas ha demostrado potencial en la carga y entrega de cargas útiles aniónicas más grandes, como los mRNAs y los complejos CRISPR/Cas9.

Research

JoVE Journal

Engineering

Optical Trapping of Nanoparticles

Trampas ópticas de las nanopartículas

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Investigación

Ingeniería

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

Síntesis y funcionalización de nitrógeno dopados Copas de nanotubos de carbono con nanopartículas de oro como tapones de corcho

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Monolayer Contact Doping of Silicon Surfaces and Nanowires Using Organophosphorus Compounds

Monolayer Contact Doping (MLCD) is a simple method for doping of surfaces and nanostructures1. MLCD results in the formation of highly controlled, ultra ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

Área selectivo Modificación de humectabilidad de la superficie del silicio por pulsos láser UV irradiación en Ambiente Líquido

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Silicon Metal-oxide-semiconductor Quantum Dots for Single-electron Pumping

De silicio metal-óxido-semiconductor Quantum Dots para Bombeo solo electrón

As mass-produced silicon transistors have reached the nano-scale, their behavior and performances are increasingly affected, and often deteriorated, by ...

Synthesis and Functionalization of 3D Nano-graphene Materials: Graphene Aerogels and Graphene Macro Assemblies

Síntesis y funcionalización de 3D Materiales Nano-grafeno: grafeno aerogeles y grafeno Asambleas Macro

Efforts to assemble graphene into three-dimensional monolithic structures have been hampered by the high cost and poor processability of graphene. ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

Integración de luz de captura de plata de nanoestructuras en células solares de silicio hidrogenado microcristalina por transferencia Impresión

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Síntesis de nanopartículas de oro sin agregación en el espacio entre capas de Capas de titanato películas transparentes

Combinations of metal oxide semiconductors and gold nanoparticles (AuNPs) have been investigated as new types of materials. The in situ synthesis of AuNPs ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Procedure for the Transfer of Polymer Films Onto Porous Substrates with Minimized Defects

Procedimiento para la transferencia de películas de polímeros a sustratos porosos con defectos minimizados

The fabrication of devices containing thin film composite membranes necessitates the transfer of these films onto the surfaces of arbitrary support ...