Name: synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri ile tarafından desteklenen sözleşme # R01 AI132413-01.

1. gözenekli Silisyum nano tanecikleri (pSINPs) sentezi
Dikkat: Her zaman hidroflorik asit (HF) ile çalışırken dikkatli olun. Onun güvenlik bilgi formu (SDS) göre tüm güvenlik kılavuzları izleyin, HF içeren herhangi bir kimyasal bir duman başlıklı işlemek ve uygun kişisel koruyucu donanımları (PPE; dış butil eldivenler ile çift eldiven, butil önlük önlük altında yüz ile koruyucu gözlük altında ile kalkan). Bütün üniversiteler ve Ar- Ge laboratuarı kullanım ön...

<ol>
	<li>Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+therapeutics:+big+potential+from+small+RNAs.">siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.</a> Gene Therapy. 12, 5 (2004).</li><li>Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pharmacology:+progresses+in+siRNA+delivery+and+therapeutic+applications.">Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications.</a> Gene Therapy. 24, 151 (2017).</li><li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics.">MicroRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104 (2011).</li><li>Geisler, A., Fechner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-regulated+viral+vectors+for+gene+therapy.">MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy.</a> World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).</li><li>Williams, P. D., Kingston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-mediated+gene+therapy+for+cardiovascular+disease.">Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).</li><li>Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+plasmid+DNA+for+gene+therapy+and+DNA+vaccine+applications.">Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications.</a> Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).</li><li>Shim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+gene+editing:+delivery+and+regulatory+perspectives.">Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).</li><li>Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+With+Fingers+and+TALENs.">Targeting DNA With Fingers and TALENs.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).</li><li>Dai, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+for+in+vivo+Gene+Therapy:+Promise+and+Hurdles.">CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Pathways+of+RNA+Degradation.">The Many Pathways of RNA Degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wang, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+window+onto+siRNA+delivery.">A window onto siRNA delivery.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Kim, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogene+therapy+with+fusogenic+nanoparticles+modulates+macrophage+response+to+Staphylococcus+aureus.">Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Disruption+of+G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62;+Switch+Gene+2+Enhances+Adipose+Lipolysis,+Alters+Hepatic+Energy+Balance,+and+Alleviates+High-Fat+Diet&#8211;Induced+Liver+Steatosis.">Targeted Disruption of G&#60;sub&#62;0&#60;/sub&#62;/G&#60;sub&#62;1&#60;/sub&#62; Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet&#8211;Induced Liver Steatosis.</a> Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).</li><li>Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+MicroRNA+mimics+with+polyethylenimine+elevates+pulmonary+microRNA+levels,+but+lacks+pulmonary+selectivity.">Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).</li><li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure.">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death &#38; Disease. 7, e2145 (2016).</li></ol>

Gözenekli Silisyum nano tanecikleri sentezi şekil 5' te gösterilen. Fusogenic pSiNPs sentezi kritik adımda yükleme adım (Adım 3) var. Fusogenic nano tanecikleri toplayarak Eğer sonrası sentezi (şekil 3), nedeni aşağıdaki nedeniyle olabilir: (1) Kalsiyum klorür stok rastlanılmaması hazırlanan değil, böylece adım 3.1.2 olmalı dikkatle takip veya rafine; veya (2) pSiNP oranı: siRNA: CaCl2 veya bir veya daha fazla üç bileşeni kons...

Gen tedavisi tedavi edici bir sonuç elde etmek için belirli bir gen ifade modüle. Gen modülasyon için çok sayıda araç keşfetti ve okudu, oligonucleotides (örneğin, kısa sokan RNA (siRNA)1,2, mikroRNA (miRNA)3,4 kullanarak ribonükleik asit girişim de dahil olmak üzere (RNAi) ), DNA plazmid5,6, enzimler (örneğin, çinko parmak, TALENS)7,8ve CRISPR/Cas9 sistemleri9,10. Her aracın etki mekanizması farklı olsa da, tüm araçları hücrenin sitoplazma veya aktif olmak için çekirdek ulaşmak gerekir. Bu nedenle, bu araçları gen ekspresyonu tüp bebek oransal olarak önemli etkisi ikna etmek için kanıtlanmış olsa da, içinde vivo etkinliği hücre içi ve hücre dışı engel uğrar. Biyolojik kökenlidir araçlar nedeniyle gerçeğini, düşebilir veya yabancı molekülleri11Kaldır seçeneğine sahipsiniz vücudumuzda birçok enzim ve temizleme sistemleri mevcut. Durumda bile araçları hedef hücre ulaşmak endositoz acı; bir mod, saklar ve aşağılamak veya hücre dışı araçlar sınırdışı asitli mide benzeri veziküller araçlarında yakalar hücresel Alım. Aslında, çalışmalar lipid nano tanecikleri içinden alımı12,1324 h içinde hücrelerden siRNA yaklaşık % 70'i exocytosed macropinocytosis, via endocytosed olduğunu göstermiştir. Kalan siRNA çoğunluğu lizozomal yolu ile bozulmuş ve sonuçta RNAi13,14 potansiyel olarak geçmesi endosomal kaçış elde başlangıçta nano tanecikleri ile hücreye girer siRNA, sadece 1-%2 .
Biz son zamanlarda gözenekli Silisyum nano tanecikleri ve fusogenic lipid kabuk15oluşan bir siRNA yüklenen çekirdek olan fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri (F-pSiNPs) geliştirdik. F-pSiNPs diğer geleneksel Oligonükleotid vasıtalarının üzerinde üç büyük avantajları sunmak: (1) bir fusogenic lipid endositoz bypass ve tüm yükü (1-%2 karşı hücreyi sitoplazmada doğrudan teslim parçacıklar sağlayan kaplama endocytosed parçacıklar13,14tarafından elde) (Resim 1); pSiNPs siRNA (2) yüksek toplu yükleme (> 20 wt % 1-15 wt % tarafından geleneksel sistemleri ile karşılaştırıldığında) bir kez (çekirdek parçacıkları lipid kaplama fusogenic alımı ile shed) hangi hızla siRNA; serbest bırakmak içinde sitoplazma aşağılamak15, ve (3) peptid konjugasyon için seçici posta için hedefleme istenen hücre tipleri içinde vivo.
F-pSiNP sistemi önemli gen etkinliğini susturmak göstermiştir (> % 95'in vitro; > % 80'i içinde vivo) ve sonraki tedavi etkisi bir ölümcül fare modeli S. aureus pnömoni; sonuçlarını hangi daha önce15yayınlandı. Ancak, hassas işleme ve ince ayar en iyi duruma getirme düzgün ve istikrarlı nano tanecikleri oluşturmak için F-pSiNP sisteminin karmaşık yapısını gerektirir. Böylece, bu çalışmanın amacı ayrıntılı bir protokol yanı sıra, functionalization, malzemelerin ve çift hedeflenen teslimini güçlü gen susturmak etkisi için kullanılmak üzere F-pSiNPs için en iyi duruma getirme stratejileri sunmaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1192px;" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850345P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td style="width:512px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">12175-001</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:163px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">C1977</td>
			<td style="width:512px;">Anhydrous, Pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C6061</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:399px;">Computer</td>
			<td style="width:163px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Dimension 9200</td>
			<td style="width:512px;">Any computer with PCI card slot is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Dil Stain (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (&#39;DiI&#39;; DiIC18(3)))</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3911</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:163px;">UCSD Store</td>
			<td style="width:119px;">111</td>
			<td style="width:512px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Hydrofluric acid (HF)</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">MK264008&#160;</td>
			<td style="width:512px;">Purity: 48%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Keithley 2651a Sourcemeter</td>
			<td style="width:163px;">Keithley</td>
			<td style="width:119px;">2651A</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:163px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:512px;">Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">LysoTracker Green DND-26</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liposome extrusion set with heating block</td>
			<td style="width:163px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610000</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MRCF0R030</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">O-ring</td>
			<td style="width:163px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;">CG-305-220</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Platinum coil</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">AA10285-BU</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P250-3</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:163px;">Siltronix</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">siRNA</td>
			<td style="width:163px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">IRF5, sense 5&#8217;-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3&#8217; and antisense 5&#8217;-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sonicator</td>
			<td style="width:163px;">VWR International, LLC</td>
			<td style="width:119px;">97043-960</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Targeting peptide (CRV)</td>
			<td style="width:163px;">CPC Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;">sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">Teflon etch cell</td>
			<td style="width:163px;">Interface Performance Materials, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom order</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td style="width:512px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, functionalization, and characterization of fusogenic porous silicon nanoparticles for oligonucleotide delivery

Gen tedavisi ve advent ile bir etkili içinde vivo nükleotit yükü gönderim sisteminin geliştirilmesi paralel ithalat haline gelmiştir. Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri (F-pSiNPs) son zamanlarda yüksek içinde vivo gen etkinliği nedeniyle yükleme kapasitesi ve endositoz önler benzersiz hücresel alımı yolu onun yüksek Oligonükleotid susturmak gösterdi. F-pSiNPs sentezi içeren çok adımlı bir işlemdir: (1) yükleme ve in silikon gözenekleri; Oligonükleotid payloads mühürleme (2) aynı anda kaplama ve fusogenic lipidler gözenekli Silisyum çekirdek çevresinde boyutlandırma; ve peptidler hedefleme ve aşırı Oligonükleotid, silikon enkaz ve peptid kaldırmak için yıkama (3) oluşun. Parçacığın boyutu tekdüzelik dinamik ışık saçılma ile karakterizedir ve çekirdek-kabuk yapısını iletim elektron mikroskobu tarafından doğrulanmadı. Fusogenic alımını bir lipofilik yükleyerek doğrulanır, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (dıı), fusogenic lipid bilayer boya ve hücrelere plazma zarı karşı boyama için gözlemlemek için tüp bebek tedavisi endositik yerelleştirmeler. Hedefleme ve içinde vivo gen silencing efficacies daha önce Staphylococcus aureus pnömoni, hangi hedefleme peptid enfeksiyon sitesine giriş için F-pSiNPs yardım bekleniyor, bir fare modeli sayısal. S. aureus enfeksiyon kendi uygulamasında, F-pSiNP sistemi hastalıkları, viral enfeksiyonlar, kanser ve otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere geniş bir gen tedavisi için herhangi bir Oligonükleotid teslim etmek için kullanılabilir.

Fusogenic pSiNPs başarılı bir sentezi (şekil 3a) homojen, biraz opak bir çözüm üretmek gerekir. Başarısızlık oranı ve pSiNPs konsantrasyonu en iyi duruma getirmek için: siRNA: CaCl2 (şekil 3b) yükleme üzerine toplama için neden olabilir. Parçacıklar 200 nm membranlar uzatılır, fusogenic pSiNPs DLS tarafından ölçülen ortalama hidrodinamik çapı yaklaşık 200 olmalıdır nm ve <strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery at JoVE.com

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri etkili tüp bebek ve içinde vivo Oligonükleotid tesliminde sentezi göstermektedir. Gözenekli Silisyum nano tanecikleri tarafından fusogenic lipidler kabuk oluşturmak için ekstrüzyon ile kaplı çekirdek oluşturmak üzere siRNA ile yüklenir. Hedefleme yan functionalization ve parçacık karakterizasyonu yer almaktadır.

Functionalization, malzemelerin ve Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri'Oligonükleotid dır

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

Bu protokol, siRNA'ları yüksek verimlilikle sunarak in vivo genleri susturabilen bir nanopartikül sisteminin sentezini tanımlar. Sadece hedefleme peptid ve siRNA yükü değiş tokuş ederek, fusojenik nano tanecikleri in vivo gen modülasyonu gerektiren hastalıklar için potansiyel bir terapötik formülasyon olarak kullanılabilir. Daha önce kronik iltihabı sonlandırmak için makrofajlarda iltihabı kodlayan bir geni susturarak gram-pozitif bakteriyel enfeksiyonlara karşı fusojenik nanoplatform kullanarak sonuçlar yayınladık.Bu işlemi gerçekleştirmeden önce, üçe bir hidroflorik asit çözeltisinde silikon gofret içeren bir Teflon etch hücresi monte edin. 0,6 saniye kare lik 50 miliamperes santimetre kare lik bir kare dalga formu ve 500 döngü için tekrarlanan 0,36 saniye boyunca santimetre kare simetre başına 400 miliamperes yüksek akım yoğunluğu ile alternatif bir akım çalıştırın. Gravür bittikten sonra, hücreyi devreden çıkarın ve hidroflorik asit çözeltisini bir şırınga kullanarak dikkatlice durulayın.Sonra, etanol ile üç kez durulayın. Silikon gofret gözenekli tabaka kaldırmak için, ilk bir-to-29 hidroflorik asit çözeltisi 10 mililitre ile etch hücre kuyusu doldurun. Daha sonra, 250 saniye boyunca santimetre kare başına 3,7 miliamperes sabit çalıştırın.Gravür bittikten sonra, hücreyi devreden çıkarın. Gözenekli silikon tabakası, kristal silikon gofret ten kopma gösteren görünür dalgalanmalar olabilir. Hidroflorik asit çözeltisini hafifçe yıkayın ve her biri etanol ve suyla üçer kez durulayın.Bir pipet ucu kullanarak, tam bir kopuş için gözenekli silikon tabakasının çevresini sıkıca kırın. Etanol kullanarak, gözenekli silikon parçaları toplamak, veya cips, Teflon etch hücreden bir tartMa tekne içine. Sonra, depolama için bir cam şişe için cips aktarın.Daha sonra, gözenekli silikon yongaları içeren cam şişedeki etanolü iki mililitre RNase içermeyen su ile değiştirin. Sıkıca kap ve Parafilm kullanarak şişe mühür. Bir sonicator banyoda cam şişe yerleştirin ve gözenekli silikon yongaları hacmi tamamen su banyosu yüzeyinin altında batırılmış olduğu gibi askıya aldı.Sonication sırasında önemli su kaybını önlemek için, şişenin açılması su banyosu yüzeyine dokunur şekilde ters, su dolu bir hacimsel şişe yerleştirin. Daha sonra, 48 watt rf gücü ile 35 kilohertz 12 saat boyunca gözenekli silikon yongaları sonicate. Sonication sonra, büyük parçacıklar alt yerleşmek için izin vermek için bir saat düz bir yüzeye cam şişe yerleştirin.Sonra, bir pipet kullanarak supernatant toplamak. Bir cam şişede, 72,55 mikrolitre DMPC çözeltisi, 15,16 mikrolitre DSPE-PEG çözeltisi ve 19,63 mikrolitre DOTAP çözeltisi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Çözücü bir gecede buharlaşmasını sağlamak için gevşek bir kapak ile bir duman kaputuna şişe yerleştirin.Kurutulmuş film, şişenin altında bulutlu, sert, jel benzeri bir madde olacak. Sonra, daha önce hazırlanmış buzlu sonication banyo gözenekli silikon nano tanecikleri 150 mikrolitre içeren bir mikrosantrifüj tüp yerleştirin. 15 dakikalık ultrasonication altında, hafifçe pipet 150 siRNA mikrolitre ve gözenekli silikon nano tanecikleri içine iki molar kalsiyum klorür 700 mikrolitre.Sonicator siRNA yüklü kalsiyum kaplı gözenekli silikon nano tanecikleri bir mililitre içeren tüp çıkarın. Geniş bir kabı deiyonize suyla doldurun. Bir polikarbonat membran ve dört filtre desteklerini su yüzeyinde yüzdürerek ıslatın.Daha sonra, üreticinin talimatlarına uyarak bir lipozom ekstrüzyon kiti monte edin. Daha sonra, siRNA yüklü kalsiyum kaplı gözenekli silikon nano tanecikleri bir mililitre ile cam şişe kurutulmuş lipid film nemlendirin. Pipet, tüm lipidler şişenin altından kaldırılıncaya ve bulutlu, homojen bir çözelti gözlenene kadar.Cam şişeye manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve şişeyi sıcak bir plakaüzerine yerleştirin ve parçacıkları manyetik olarak 20 dakika boyunca karıştırarak 40 santigrat dereceye ısıtın. Bunu takiben, ekstrüderin bir tarafına boş bir şırınga takın. Daha sonra, lipid kaplı gözenekli silikon nanopartikül çözeltisi bir mililitre ile başka bir şırınga doldurun ve ekstrüder diğer tarafına şırınga takın.Bir şırıngadan parçacıkları, polikarbonat membranı ve diğer şırınga içine itmek için yavaş yavaş piston iterek ekstrüzyon başlayın. 20 kez tekrarlayın. Sonra, bir mikrosantrifüj tüp içine ekstrüzyon parçacıkları toplamak.RNase içermeyen suda mililitre başına bir peptit konsantrasyonu olan bir peptit stoku hazırlayın. Fusojenik lipid kaplı gözenekli silikon nano tanecikleri içeren mikrosantrifüj tüpünde, peptit stokunun 100 mikrolitresini ve pipeti hafifçe ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında 20 dakika sabit tutun.Aşırı peptid veya siRNA ve diğer eksipiyanları gidermek için, oda sıcaklığında 5,000 kez g'de bir saat boyunca eğilerek 30 kilodalton luk bir santrifüj filtrede yıkayın. Aynı ayarlar altında bir mililitre PBS ile iki kez daha santrifüj yapın. Santrifüjden sonra, PBS'deki son peptid konjuge fusojenik lipid kaplı gözenekli silikon nano partikülleri istenilen konsantrasyonda yeniden askıya alın.Parçacıklar en az 30 gün boyunca eksi 80 derecede saklanabilir. Fusojenik gözenekli silikon nano tanecikleri başarılı bir sentezi 30 gün boyunca saklanabilir ve yapısal değişikliklere neden olmadan çözülmüş homojen, biraz opak bir çözüm üretmelidir. Oran ve konsantrasyonun optimize edilmemesi ve tekrarlanan donma-çözülme döngüleri yükleme üzerine toplanmaya yol açabilir.Parçacıklar ekstrüzyon olarak, dinamik ışık saçılma ile ölçülen fusojenik gözenekli silikon nano tanecikleri ortalama hidrodinamik çapı yaklaşık 200 nanometre ve ortalama zeta potansiyeli yaklaşık yedi milivolt olmalıdır. Hedefleme peptidleri ile yüzey modifikasyonundan sonra, toplam çapı 230 nanometreden az olmalı ve ortalama zeta potansiyeli eksi 3,4 milivolta düşer. Füzyon, fusojenik lipit lipidlerin lipophilic florofor DiI ile etiketlenmesi ve konfokal mikroskopi ile in vitro lokalizasyonun gözlemlenmesi ile doğrulanabilir.Fusojenik gözenekli silikon nanopartikülün lipitlerinin DiI'yi plazma zarına aktarması ve izozomlardan bağımsız olarak lokalize olması yla başarılı füzyon gözlenir. Başarısız füzyon hücrenin sitoplazması içinde DiI lokalizasyonunu ve lizozomlarla birlikte lokalizasyonunu gösterecektir. Bu fusogenic nanopartikül sistemi şimdi sadece bakteriyel enfeksiyonlar değil, aynı zamanda kanser adjuvan tedavi ve kanser immünoterapi terapötik uygulamalar için kullanılmaktadır.Bu protokol, siRNA'lardan daha fazla yüklemek için daha iyi duruma getirilebilir. Fusojenik nanopartikül sistemi, mRNA'lar ve CRISPR/Cas9 kompleksleri gibi daha büyük aniyonik yüklerin yüklenmesi ve teslimi potansiyelini göstermiştir.

Research

JoVE Journal

Engineering

Optical Trapping of Nanoparticles

Nanopartiküllerin Optik Yakalama

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

Mantar Tıpa olarak Altın Nanopartiküller ile Azot-katkılı Karbon Nanotube Bardaklar sentezi ve fonksiyonlandırmalar

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Monolayer Contact Doping of Silicon Surfaces and Nanowires Using Organophosphorus Compounds

Organofosfor Bileşikleri Kullanma Silikon Yüzeyler ve Nanotellerin monolayer İletişim Doping

Monolayer Contact Doping (MLCD) is a simple method for doping of surfaces and nanostructures1. MLCD results in the formation of highly controlled, ultra ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

Sıvı Ortamda Darbeli UV Lazer Radyasyonla Silikon Yüzey Islanabilirliği Seçici Alan Değişikliği

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Silicon Metal-oxide-semiconductor Quantum Dots for Single-electron Pumping

Tek elektron pompalayabilme için Silikon Metal-oksit-yarıiletken Kuantum Noktaları

As mass-produced silicon transistors have reached the nano-scale, their behavior and performances are increasingly affected, and often deteriorated, by ...

Synthesis and Functionalization of 3D Nano-graphene Materials: Graphene Aerogels and Graphene Macro Assemblies

Sentezi ve 3D Nano-grafen Malzemelerin fonksiyonalizasyonu: Grafen Aerogels ve Graphene Makro Meclisleri

Efforts to assemble graphene into three-dimensional monolithic structures have been hampered by the high cost and poor processability of graphene. ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

Transfer Baskı ile Hidrojene Mikrokristal Silikon Güneş Pilleri Işık Yakalama Gümüş Nanoyapıların Entegrasyonu

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

In Situ Synthesis of Gold Nanoparticles without Aggregation in the Interlayer Space of Layered Titanate Transparent Films

Katmanlı Titanate Şeffaf Filmleri Interlayers Uzayda Toplama olmadan Altın Nanopartiküller Yerinde Sentez

Combinations of metal oxide semiconductors and gold nanoparticles (AuNPs) have been investigated as new types of materials. The in situ synthesis of AuNPs ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Procedure for the Transfer of Polymer Films Onto Porous Substrates with Minimized Defects

Polimer filmlerin küçültülmüş kusurlarla gözenekli substratlar üzerine aktarımı için prosedür

The fabrication of devices containing thin film composite membranes necessitates the transfer of these films onto the surfaces of arbitrary support ...