Name: a method for 3d reconstruction and virtual reality analysis of glial and neuronal cells
Uploaded: 2019-09-28T13:00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells at JoVE.com

इस काम को किंग अब्दुल्ला यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (KAUST) प्रतियोगी अनुसंधान अनुदान (सीआरजी) ने पी.जे.एम.

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GitHub &#8211; magus74/GLAM: Glycogen Lactate Absorption Model Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/magus74/GLAM">https://github.com/magus74/GLAM</a> (2019)</li><li>Agus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLAM:+Glycogen-derived+Lactate+Absorption+Map+for+visual+analysis+of+dense+and+sparse+surface+reconstructions+of+rodent+brain+structures+on+desktop+systems+and+virtual+environments.">GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments.</a> Dryad Digital Repository. , (2018).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from:+The+effects+of+aging+on+neuropil+structure+in+mouse+somatosensory+cortex&#8212;A+3D+electron+microscopy+analysis+of+layer+1.">Data from: The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex&#8212;A 3D electron microscopy analysis of layer 1.</a> Dryad Digital Repository. , (2018).</li></ol>

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

यहाँ प्रस्तुत विधि विभाजन और एक multiscale EM डेटासेट के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए एक उपयोगी कदम दर कदम गाइड है, चाहे वे उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीक से आते हैं, FIB-SEM, या अन्य स्वचालित सीरियल सेक्शनिंग और इमेजिंग तकनीक की तरह. FIB-SEM संभावित रूप से एक केंद्रित आयन बीम का उपयोग कर के रूप में पतली के रूप में वर्गों को काटने से voxel आकार में सही आइसोट्रोपी तक पहुँचने का लाभ है, इसकी FOV पक्ष कलाकृतियों की वजह से 15-20 डिग्री तक सीमित हो सकता है, जो संभवतः ऊतक कटौती के बयान के कारण कर रहे हैं अगर FO V इस मान से अधिक है। इस तरह की कलाकृतियों को अन्य तकनीकों का उपयोग करके बचा जा सकता है, जैसे SBEM, जो माइक्रोस्कोप कक्ष के अंदर सीरियल सेक्शन ों में कटौती करने के लिए एक हीरे की चाकू का उपयोग करता है। इस बाद के मामले में, z संकल्प के आसपास हो सकता है 20 एनएम सबसे अच्छा में (आमतौर पर, 50 एनएम), लेकिन FOV बड़ा हो सकता है, हालांकि पिक्सेल संकल्प ब्याज की एक विशाल क्षेत्र के लिए समझौता किया जाना चाहिए. ऐसी सीमाओं को दूर करने के लिए एक समाधान (आवर्धन बनाम FOV) टाइल में ब्याज के क्षेत्र को विभाजित करने और एक उच्च संकल्प पर उनमें से प्रत्येक के अधिग्रहण के लिए है। हम यहाँ से परिणाम दिखाया है दोनों एक SBEM स्टैक-डेटासेट (i) प्रतिनिधि परिणामों में- और एक FIB-SEM स्टैक-डेटासेट (ii) प्रतिनिधि परिणामों में।
जैसे-जैसे बड़े और बड़े डेटासेट का उत्पादन तेजी से अधिक आम होता जा रहा है, पिक्सेल वर्गीकरण और स्वचालित छवि विभाजन के लिए उपकरण बनाने के प्रयास बढ़ रहे हैं; फिर भी, आज तक, कोई सॉफ्टवेयर मानव proofreading, जो इसलिए अभी भी आवश्यक है, कोई फर्क नहीं पड़ता कि कैसे समय लेने वाली है की तुलना में विश्वसनीयता साबित कर दिया है. सामान्य तौर पर, छोटे डेटासेट जिन्हें डाउननमूना किया जा सकता है, जैसे डेटासेट (ii) के मामले में, एक सप्ताह में एकल, विशेषज्ञ उपयोगकर्ता द्वारा सघन रूप से पुनर्निर्माण किया जा सकता है, जिसमें प्रूफरीडिंग समय भी शामिल है।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल विशेष रूप से तीन सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग शामिल है: फिजी (संस्करण 2.0.0-rc-65/1.65b), ilastik (संस्करण 1.3.2 rc2), और ब्लेंडर (2.79), जो सभी खुले स्रोत और बहु मंच कार्यक्रमों और मुफ्त के लिए डाउनलोड कर रहे हैं. फिजी ImageJ की एक रिहाई है, जैविक छवि विश्लेषण के लिए plugins द्वारा संचालित. यह एक मजबूत सॉफ्टवेयर वास्तुकला है और सुझाव दिया है के रूप में यह जीवन वैज्ञानिकों के लिए एक आम मंच है और TrakEM2, छवि विभाजन के लिए पहली और सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल plugins में से एक भी शामिल है. एक मुद्दा कई उपयोगकर्ताओं द्वारा अनुभवी हाल ही में जावा 6 से जावा 8 के लिए संक्रमण है, जो संगतता मुद्दों पैदा कर रहा है; इसलिए, हम सुझाव है कि जावा 8 को अद्यतन करने से बचने के लिए, यदि संभव हो तो, फिजी ठीक से काम करने के लिए अनुमति देते हैं. ilastik पिक्सेल वर्गीकरण के लिए चौखटे की एक संख्या प्रदान करने के लिए एक शक्तिशाली सॉफ्टवेयर है, हर एक प्रलेखित और अपनी वेबसाइट पर समझाया. EM ढेर के अर्द्ध स्वचालित विभाजन के लिए इस्तेमाल नक्काशी मॉड्यूल सुविधाजनक है के रूप में यह बहुत समय बचाता है, वैज्ञानिकों को एक अनुभवी उपयोगकर्ता के लिए महीनों से दिनों के लिए मैनुअल काम पर खर्च समय को कम करने की अनुमति, के रूप में एक क्लिक के साथ एक पूरे neurite हो सकता है सेकंड में विभाजित किया गया. पूर्व प्रसंस्करण कदम देखने के एक हार्डवेयर बिंदु से बहुत तीव्र है, और बहुत बड़े डेटासेट, SBEM यहाँ प्रस्तुत ढेर की तरह, जो 26 जीबी था, अजीब रणनीतियों की आवश्यकता के लिए स्मृति में फिट, विचार है कि एक बड़े डेटासेट प्राप्त होगा क्योंकि नहीं कर सकते देखने और संकल्प के समझौता क्षेत्र. इसलिए, downsampling इस स्थिति में कोई उपयुक्त समाधान नहीं हो सकता है। सॉफ्टवेयर के नवीनतम रिलीज एक शक्तिशाली लिनक्स कार्य केंद्र के साथ कुछ ही घंटों में preprocessing कर सकते हैं, लेकिन विभाजन मिनट लग जाएगा, और ढेर के माध्यम से स्क्रॉल अभी भी अपेक्षाकृत धीमी गति से होगा. हम अभी भी एक पहले, किसी न किसी विभाजन के लिए इस विधि का उपयोग करें, और यह TrakEM2 का उपयोग कर proofread. अंत में, ब्लेंडर एक 3 डी मॉडलिंग सॉफ्टवेयर है, एक शक्तिशाली 3 डी प्रतिपादन इंजन के साथ, जो अजगर लिपियों कि ऐड-ऑन के रूप में मुख्य जीयूआई में एम्बेडेड किया जा सकता है के साथ अनुकूलित किया जा सकता है, इस तरह के NeuroMorph और ग्लाइकोजन विश्लेषण के रूप में. इस सॉफ्टवेयर का लचीलापन वापसी के साथ आता है कि, फिजी के विपरीत, उदाहरण के लिए, यह बड़े डेटासेट के ऑनलाइन दृश्य के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है; इसलिए, visualizing और बड़े meshes के माध्यम से नेविगेट (1 जीबी से अधिक) धीमी और कुशल नहीं हो सकता है. इस वजह से, यह हमेशा तकनीक है कि जाल जटिलता को कम करने का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है, लेकिन ब्याज की संरचना के मूल आकृति विज्ञान को बाधित नहीं सावधान कर रहे हैं. Remesh समारोह काम में आता है और NeuroMorph बैच आयात उपकरण की एक एम्बेडेड सुविधा है. इस समारोह के साथ एक मुद्दा यह है कि, मूल जाल के vertices की संख्या के आधार पर, octree गहराई मूल्य, जो अंतिम संकल्प से संबंधित है, तदनुसार संशोधित किया जाना चाहिए. छोटी वस्तुओं को एक छोटे से octree गहराई (उदाहरण के लिए 4) के साथ remeshed किया जा सकता है, लेकिन एक ही मूल्य बड़ा मूल्यों की आकृति विज्ञान को बाधित कर सकता है, जो बड़े मूल्यों की जरूरत है (6 सबसे अच्छा में, करने के लिए 8 या यहां तक कि 9 एक बहुत बड़ा जाल के लिए, इस तरह के एक पूर्ण सेल के रूप में). यह सलाह दी जाती है कि इस प्रक्रिया को पुनरावृत्तीय बनाएं और यदि वस्तु का आकार स्पष्ट नहीं है तो विभिन्न octree गहराई का परीक्षण करें।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एक पहलू है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए गणना शक्ति के पुनर्निर्माण और विश्लेषण के लिए समर्पित किया जा रहा है, सॉफ्टवेयर है कि इस्तेमाल किया जा रहा है से संबंधित है. इस पांडुलिपि के प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया सभी आपरेशनों एक MacPro का उपयोग कर प्राप्त किया गया, एक AMD FirePro D500 ग्राफिक्स कार्ड, राम के 64 जीबी, और 8 कोर के साथ एक इंटेल Xeon E5 सीपीयू के साथ सुसज्जित. फिजी में बड़े डेटासेट को संभालने के लिए एक अच्छा सॉफ़्टवेयर आर्किटेक्चर है; इसलिए, यह एक अच्छा हार्डवेयर प्रदर्शन के साथ एक लैपटॉप का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, इस तरह के एक मैकबुक प्रो के साथ एक 2.5 गीगा इंटेल i7 सीपीयू और राम के 16 जीबी के साथ. ilastik सॉफ्टवेयर हार्डवेयर संसाधनों के मामले में अधिक मांग है, विशेष रूप से पूर्व प्रसंस्करण कदम के दौरान. हालांकि छवि ढेर downsampling सॉफ्टवेयर से हार्डवेयर अनुरोधों को सीमित करने के लिए एक अच्छी चाल है और उपयोगकर्ता एक लैपटॉप के साथ एक ढेर प्रक्रिया करने के लिए अनुमति देता है (आमतौर पर अगर यह एक्समें 500 पिक्सल से नीचे है ,y,z), हम एक उच्च अंत के उपयोग का सुझाव कंप्यूटर इस सॉफ़्टवेयर को सुचारू रूप से चलाने के लिए. हम 16 कोर और राम के 500 जीबी के साथ एक इंटेल Xeon गोल्ड 6150 सीपीयू के साथ सुसज्जित एक कार्य केंद्र का उपयोग करें.
जब एक सटीक 3 डी पुनर्निर्माण के साथ प्रदान की, वैज्ञानिकों मूल micrographs त्याग सकते हैं और एक ही प्रकार की कोशिकाओं की तुलना करने के लिए उपयोगी morphometric डेटा निकालने के लिए 3 डी मॉडल पर सीधे काम करते हैं, साथ ही कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, और के लिए VR का लाभ ले लो morphologies के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन. विशेष रूप से, बाद का उपयोग घने या जटिल morphologies के विश्लेषण के मामले में फायदेमंद साबित हो गया है कि वर्तमान दृश्य occlusion (यानी, 3 डी अंतरिक्ष में ब्याज की एक वस्तु के देखने की रुकावट एक दूसरे से पर्यवेक्षक और फाई के बीच रखा rst वस्तु), यह मुश्किल का प्रतिनिधित्व करते हैं और उन्हें 3 डी में विश्लेषण करने के लिए कर रही है. प्रस्तुत उदाहरण में, एक अनुभवी उपयोगकर्ता डेटासेट का निरीक्षण और वस्तुओं की गणना करने के लिए लगभग 4 लगातार घंटे लग गए। वीआर विश्लेषण पर खर्च किया गया समय वीआर बीमारी जैसे पहलुओं के रूप में भिन्न हो सकता है (जो कुछ हद तक कार बीमारी से संबंधित हो सकता है) उपयोगकर्ता अनुभव पर नकारात्मक प्रभाव डाल सकता है; इस स्थिति में, उपयोगकर्ता अन्य विश्लेषण उपकरण पसंद कर सकता है और VR के लिए समर्पित अपने समय को सीमित कर सकता है.
अंत में, इन सभी चरणों छवि स्टैक जनरेट करें अन्य माइक्रोस्कोपी और गैर-EM तकनीकों के लिए लागू किया जा सकता है। EM छवियों है कि कर रहे हैं, सामान्य रूप में, को संभालने और खंड चुनौतीपूर्ण, के साथ तुलना में, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, जहां कुछ एक द्विआधारी मुखौटा के लिए तुलनीय (संकेत बनाम एक काली पृष्ठभूमि), कि सिद्धांत रूप में आसानी से 3 डी में गाया जा सकता है के लिए आगे प्रसंस्करण, अक्सर के साथ निपटा जाना चाहिए.

स्वचालित सीरियल सेक्शन और इमेजिंग की अनुमति देने वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेटअप के लिए पहला प्रस्तावित मॉडल 19811की तारीख है; इस तरह के स्वचालित, बेहतर setups के प्रसार EM का उपयोग कर बड़े नमूनों की छवि के लिए प्रसार पिछले दस वर्षों में वृद्धि हुई2,3, और प्रभावशाली घने पुनर्निर्माण या पूर्ण morphologies प्रदर्शन काम करता है तुरंत4के बाद, 5,6,7,8,9,10.
बड़े डेटासेट का उत्पादन छवि विभाजन के लिए बेहतर पाइपलाइनों की आवश्यकता के साथ आया था। सीरियल सेक्शन्स के मैन्युअल विभाजन के लिए सॉफ़्टवेयर उपकरण, जैसे RECONSTRUCT और TRAKEM211,12,संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) के लिए डिज़ाइन किए गए थे। के रूप में पूरी प्रक्रिया अत्यंत समय लेने वाली हो सकता है, इन उपकरणों के उपयुक्त नहीं हैं जब सीरियल micrographs के हजारों है कि स्वचालित रूप से राज्य के साथ उत्पन्न किया जा सकता है के साथ काम कर रहे हैं-कला, स्वचालित EM सीरियल अनुभाग तकनीक (3DEM), जैसे ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीईएम)3 या केंद्रित आयन बीम-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एफआईबी-सेम)2। इस कारण से, वैज्ञानिकों ने विभाजन दक्षता में सुधार करने के लिए अर्द्ध स्वचालित उपकरण, साथ ही पूरी तरह से स्वचालित उपकरण विकसित करने के प्रयास किए। पूरी तरह से स्वचालित उपकरण, मशीन सीखने13 या राज्य के अत्याधुनिक, अप्रशिक्षित पिक्सेल वर्गीकरण एल्गोरिदम14के आधार पर, एक बड़ा समुदाय द्वारा इस्तेमाल किया जा करने के लिए सुधार किया जा रहा है; फिर भी, विभाजन अभी भी पूरी तरह से विश्वसनीय होने से दूर है, और कई काम अभी भी मैनुअल श्रम पर आधारित हैं, जो विभाजन समय के मामले में अक्षम है, लेकिन अभी भी पूरी विश्वसनीयता प्रदान करता है. इस तरह के ilastik15के रूप में अर्द्ध स्वचालित उपकरण, एक बेहतर समझौते का प्रतिनिधित्व करते हैं, के रूप में वे विभाजन है कि कुछ हद तक सही किया जा सकता है के लिए एक तत्काल readout प्रदान करते हैं, हालांकि यह एक असली proofreading रूपरेखा प्रदान नहीं करता है, और एकीकृत किया जा सकता है समानांतर16में TrakEM2 का उपयोग कर .
बड़े पैमाने पर विभाजन, तारीख करने के लिए, ज्यादातर connectomics तक ही सीमित है; इसलिए, कंप्यूटर वैज्ञानिकों को सबसे बड़े, एनोटेट डेटासेट के एकीकृत दृश्यावलोकन के लिए चौखटे प्रदान करने में सबसे अधिक रुचि रखते हैं और synaptic संपर्कों की उपस्थिति से अनुमानित कनेक्टिविटी पैटर्न का विश्लेषण17,18. फिर भी, सटीक 3 डी पुनर्निर्माण मात्रात्मक morphometric विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बजाय 3 डी संरचनाओं के गुणात्मक आकलन. NeuroMorph19,20 और ग्लाइकोजन विश्लेषण10 जैसे उपकरण लंबाई, सतह क्षेत्रों, और मात्रा के लिए 3 डी पुनर्निर्माण पर माप लेने के लिए विकसित किया गया है, और बादल अंक के वितरण पर, पूरी तरह से मूल EM स्टैक8,10को त्याग देना . Astrocytes एक दिलचस्प मामले के अध्ययन का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि दृश्य सुराग या दोहराव संरचनात्मक पैटर्न की कमी जांचकर्ताओं व्यक्तिगत संरचनात्मक इकाइयों के समारोह और खगोल विज्ञान प्रक्रियाओं की एक पर्याप्त आंटलजी के परिणामस्वरूप कमी के बारे में एक संकेत दे 21, यह विश्लेषणात्मक उपकरण डिजाइन करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। हाल ही में एक प्रयास सार कोशिका22था , जो एस्ट्रोसाइटिक प्रक्रियाओं के दृश्य अन्वेषण और एस्ट्रोसाइटिक प्रक्रियाओं और न्यूराइट्स के बीच गुणात्मक संबंधों के अनुमान की अनुमति देता है।
फिर भी, EM के तहत इमेजिंग अनुभाग ऊतक की सुविधा तथ्य यह है कि बरकरार मस्तिष्क के नमूनों में छिपा जानकारी की मात्रा भारी है और एक अनुभाग छवियों की व्याख्या इस मुद्दे को दूर कर सकते हैं से आता है. मस्तिष्क में संरचनाओं का घनत्व इतना अधिक है कि एक बार में दिखाई देने वाली कुछ वस्तुओं के 3 डी पुनर्निर्माण उन्हें नेत्रहीनभेद करना असंभव बना देंगे। इस कारण से, हमने हाल ही में जटिल संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए एक बेहतर विधि के रूप में आभासी वास्तविकता (वीआर) के उपयोग का प्रस्ताव किया है। हम astrocytes पर ध्यान केंद्रित23 occlusion पर काबू पाने के लिए (जो एक दूसरे के साथ ब्याज की एक वस्तु की दृश्यता के अवरुद्ध है, एक 3 डी अंतरिक्ष में) और पुनर्निर्माण के गुणात्मक आकलन को कम, proofreading सहित, साथ ही परिमाणीकरण अंतरिक्ष में अंक की गिनती का उपयोग कर सुविधाओं की. हमने हाल ही में GLAM (ग्लाइकोजन व्युत्पन्न लैक्टेट अवशोषण मॉडल) के उपयोग के साथ वीआर दृश्य अन्वेषण को संयुक्त किया है, एक तकनीक, न्यूराइट्स के लैक्टेट शटल संभावना के मानचित्र को देखने के लिए, ग्लाइकोजन कणिकाओं को प्रकाश-उत्सर्जन निकायों के रूप में23के रूप में विचार करके; विशेष रूप से, हम GLAM द्वारा उत्पादित प्रकाश चोटियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए वीआर का इस्तेमाल किया।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>2.0.0-rc-65/1.65b</td>
			<td>Open Source image processing editor 
			www.fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLastik</td>
			<td>Open Source&#160;</td>
			<td>1.3.2 rc2</td>
			<td>Image Segmentation tool 
			www.ilastik.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Blender Foundation</td>
			<td>2.79</td>
			<td>Open Source 3D Modeling software 
			www.blender.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Vive Headset</td>
			<td>HTC</td>
			<td>Vive / Vive Pro</td>
			<td>Virtual Reality (VR) Head monted headset 
			www.vive.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromorph</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of Blender Addons for 3D Analysis 
			neuromorph.epfl.ch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen Analysis</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>Blender addon for analysis of Glycogen 
			https://github.com/daniJb/glyco-analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAM</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>C++ Code For generating GLAM Maps 
			https://github.com/magus74/GLAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for 3d reconstruction and virtual reality analysis of glial and neuronal cells

सीरियल सेक्शनिंग और बाद में उच्च संकल्प इमेजिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) का उपयोग कर के विभाजन और उच्च संकल्प छवि वाले ढेर के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देने के लिए ultrastructural पैटर्न है कि 2 डी का उपयोग कर हल नहीं किया जा सकता प्रकट करने के लिए छवियां. वास्तव में, बाद morphologies की एक गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, mitochondria के मामले में की तरह; 3 डी मॉडल का उपयोग, इसलिए, अधिक से अधिक आम है और आकृति विज्ञान आधारित कार्यात्मक hypotheses के निर्माण के लिए लागू किया. तारीख करने के लिए, प्रकाश या इलेक्ट्रॉन छवि ढेर से उत्पन्न 3 डी मॉडल का उपयोग गुणात्मक, दृश्य आकलन, साथ ही परिमाणीकरण, 3 डी में सीधे प्रदर्शन किया जा करने के लिए और अधिक सुविधाजनक बनाता है। के रूप में इन मॉडलों अक्सर बेहद जटिल हैं, एक आभासी वास्तविकता वातावरण भी occlusion पर काबू पाने के लिए और 3 डी संरचना का पूरा लाभ लेने के लिए स्थापित किया जा करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, छवि विभाजन से पुनर्निर्माण और विश्लेषण के लिए एक कदम दर कदम गाइड विस्तार से वर्णित है.

ऊपर प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करके, हम विभिन्न आकारों के दो छवि स्टैक पर परिणाम दिखाते हैं, यह प्रदर्शित करने के लिए कि उपकरणों का लचीलापन बड़े डेटासेट के लिए प्रक्रिया को स्केल करना कैसे संभव बनाता है. इस उदाहरण में, दो 3DEM डेटासेट हैं (i) P14 चूहा, somatosensory प्रांतस्था, परत VI, 100 $m x 100 $m x 76.4 m4 और (ii) P60 चूहा, हिप्पोकैम्पस CA1, 7.07 ]m x 6.75 m x 4.73 m10.
पूर्वप्रक्रमण चरण (चित्र 1) दोनों डेटासेट के लिए समान रूप से निष्पादित किए जा सकते हैं, बस यह ध्यान में रखते हुए कि पहला स्टैक, जो 25 GB है, जैसे बड़े डेटासेट को बड़े डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और प्रोसेसिंग को हैंडल करने के लिए अधिक प्रदर्शन हार्डवेयर की आवश्यकता होती है . दूसरा ढेर केवल 1 जीबी है, एक पूरी तरह से isotropic voxel आकार के साथ.
डेटा का आकार सीधे देखने के क्षेत्र से संबंधित नहीं हो सकता है (FOV), बजाय स्टैक खुद के संकल्प के लिए, जो माइक्रोस्कोप के सेंसर के अधिकतम पिक्सेल आकार पर निर्भर करता है, और ढेर के आवर्धन. किसी भी मामले में, तार्किक, बड़ा FOVs छोटे FOVs की तुलना में अधिक भौतिक स्थान पर कब्जा करने की संभावना है, अगर एक ही संकल्प में अधिग्रहण कर लिया.
एक बार छवि स्टैक आयात किया जाता है, जैसा कि प्रोटोकॉल के अनुभाग 1 में दर्शाया गया है, फिजी सॉफ्टवेयर(चित्र 1A) में, ImageJ12की एक वैज्ञानिक रिलीज़ , एक महत्वपूर्ण बिंदु यह सुनिश्चित करना है कि छवि स्वरूप 8-बिट (चित्र 1B) है। इसका कारण यह है कि कई अधिग्रहण सॉफ्टवेयर विभिन्न माइक्रोस्कोपी कंपनियों के निर्माता 16-बिट में अपने स्वामित्व फ़ाइल स्वरूप उत्पन्न प्राप्त करने की प्रक्रिया के बारे में जानकारी के लिए प्रासंगिक मेटाडेटा स्टोर करने के लिए (यानी, पिक्सेल आकार, मोटाई, वर्तमान / इलेक्ट्रॉन बीम, चैम्बर दबाव) छवि ढेर के साथ एक साथ. इस तरह के समायोजन वैज्ञानिकों स्मृति को बचाने के लिए अनुमति देते हैं, के रूप में अतिरिक्त 8-बिट मेटाडेटा युक्त छवियों को प्रभावित नहीं करता है। जांच करने के लिए दूसरा महत्वपूर्ण पैरामीटर voxel आकार है, जो तब विभाजन के बाद पुनर्निर्माण की अनुमति देता है सही पैमाने पर किया जा करने के लिए (माइक्रोमीटर या नैनोमीटर; चित्र 1B)
ढेर realignment और / या सिलाई की आवश्यकता हो सकती है अगर वे टाइल का उपयोग कर प्राप्त किया गया है; इन आपरेशनों TrakEM2 के भीतर किया जा सकता है (चित्र 2A),हालांकि realignment के बारे में, FIB-SEM या 3View की तरह स्वचालित 3DEM तकनीक आमतौर पर अच्छी तरह से realigned हैं.
एक अंतिम चरण को फ़िल्टर करने की आवश्यकता होती है और संभवतः, स्टैक को डाउनम्पलिंग की आवश्यकता होती है, जिसके आधार पर वस्तुओं को पुन: बनाया जाना चाहिए और क्या डाउनस्लिंग पुनर्निर्माण योग्य सुविधाओं की पहचान को प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, बड़ा ढेर के लिए (P14 चूहों के somatosensory प्रांतस्था के), यह पुनर्निर्माण दक्षता के लाभ के लिए संकल्प समझौता करने के लिए संभव नहीं था, जबकि छोटे ढेर के लिए (P60 चूहों के हिप्पोकैम्पस CA1 के), यह ऐसा करने के लिए संभव था क्योंकि संकल्प सबसे छोटी वस्तुओं के पुनर्निर्माण के लिए क्या जरूरत थी ऊपर था. अंत में, अशार्प मास्क का उपयोग झिल्ली और पृष्ठभूमि के बीच के अंतर को बढ़ाता है, जिससे इलैस्टिक जैसे सॉफ्टवेयर के पुनर्निर्माण के लिए अनुकूल होता है जो सीमाओं का पूर्व मूल्यांकन करने के लिए ग्रेडिएन्ट का उपयोग करता है।
छवि संसाधन के बाद, पुनर्निर्माण या तो मैन्युअल रूप से TrakEM2 का उपयोग कर, या अर्द्ध स्वचालित रूप से ilastik का उपयोग कर किया जा सकता है (चित्र 2C). यहाँ सूचीबद्ध छोटे डेटासेट (ii), जिसे स्मृति में फ़िट करने के लिए डाउननमूना किया जा सकता है, को सघन पुनर्निर्माण का उत्पादन करने के लिए इलैस्टिक (चित्र 2ख) का उपयोग करके पूरी तरह विभाजित किया जा सकता है। यहाँ सूचीबद्ध पहले डेटासेट (i) के मामले में, हम 500 GB RAM के साथ पूरे डेटासेट को लोड और प्री-प्रोसेस करने में कामयाब रहे हैं। 16 पूर्ण morphologies के विरल विभाजन एक संकर पाइप लाइन के साथ प्राप्त किया गया था, किसी न किसी विभाजन है कि मैन्युअल रूप से TrakEM2 का उपयोग कर proofread था निकालने के द्वारा.
सतह क्षेत्रों, मात्रा, या intracellular ग्लाइकोजन के वितरण की तरह सुविधाओं के 3 डी विश्लेषण एक ब्लेंडर वातावरण के भीतर किया जा सकता है (चित्र 3) ऐसे NeuroMorph 19 या ग्लाइकोजन विश्लेषण10 के रूप में कस्टम कोड का उपयोग कर .
ग्लाइकोजन granules युक्त डेटासेट के मामले में के रूप में अच्छी तरह से, उनके वितरण पर विश्लेषण GLAM, एक सी + + कोड है कि जाल पर सीधे प्रभाव क्षेत्र के साथ colormaps उत्पन्न होगा का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है.
अंत में, ऐसे जटिल डेटासेट ोंको वी.आर. का उपयोग करके कल्पना और विश्लेषित किया जा सकता है, जो किसी विशेष उद्देश्य के साथ डेटासेट के विश्लेषण के लिए उपयोगी सिद्ध हो गया है (चित्र 4)। उदाहरण के लिए, ग्लैम मानचित्रों से अनुमानित चोटियों को यहाँ चर्चा किए गए दूसरे डेटासेट में डेन्ड्राइट से नेत्रहीन रूप से अनुमान लगाया गया था।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig1.jpg"> चित्र 1: छवि संसाधन और छवि विभाजन के लिए तैयारी. (क)मुख्य फिजी जीयूआई। (ख)डेटासेट से खड़ी छवियों का उदाहरण (i) प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा की गई. सही पर पैनल उपयोगकर्ता voxel आकार सेट करने के लिए अनुमति देता है गुण से पता चलता है. (ग)एक फाइलर का उदाहरण और एकल छवि पर लागू की गई संक्रिया का आकार बदलें। सही पर पैनल छवि के केंद्र से आवर्धन दिखाते हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig2.jpg"> चित्र 2: TrakEM2 और ilastik का उपयोग करके विभाजन और पुनर्निर्माण. (a) TrakEM2 GUI ऑब्जेक्ट्स के साथ मैन्युअल रूप से विभाजित (लाल रंग में).। (ख)पैनल ए से निर्यातित मास्क का उपयोग इनपुट (बीज) के रूप में(ग) अर्ध-स्वचालित विभाजन (कार्टिंग) के रूप में किया जा सकता है। ilastik से, मास्क (लाल) आगे मैनुअल प्रूफरीडिंग के लिए TrakEM2 को निर्यात किया जा सकता है। (घ)मास्क को फिर पुनर्निर्माण संरचनाओं को प्रकट करने के लिए 3 डी त्रिकोणीय मेशे के रूप में निर्यात किया जा सकता है। इस उदाहरण में, डेटासेट से चार न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स, माइक्रोग्लिया, और पेरिसाइट्स (i) (प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा की गई) इस प्रक्रिया का उपयोग करके पुनर्निर्माण किया गया। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig3.jpg"> चित्र 3: अनुकूलित उपकरणों का उपयोग करके पुनर्निर्माण किए गएमॉर्फोलॉग का 3डी विश्लेषण। (क) एफआईबी-सेम डेटासेट से समस्थानिक छविकृत आयतन (ii) (जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा की गई है)। (ख) पैनल सेसघन पुनर्निर्माण . ग्रे जेड एक्सॉन्स; हरित - एस्ट्रोसाइटिक प्रक्रिया; नीले रंग की डेन्ड्राइट। (ग)सही आवर्धनों में सिनाप्स (डेटासेट (i)) और एस्ट्रोसाइटिक ग्लाइकोजन ग्रैन्युल्स (डेटासेट (ii) जैसे परिमाणीकरणों के लिए लक्ष्यों के उदाहरण दर्शाने वाला माइक्रोग्राफ। (घ)पैनल ग से मास्क, सिनाप्स के चारों ओर ग्लाइकोजन कणिकाओं का वितरण दर्शाता है। (e) ब्लेंडर से ग्लाइकोजन विश्लेषण टूलबॉक्स का उपयोग करते हुए पैनल गसे डेटासेट से ग्लाइकोजन वितरण का परिमाणीकरण। त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटियों को इंगित करती हैं. N ] 4,145 ग्लाइकोजन ग्रैन्युल्स। (च)जीएम के इनपुट और आउटपुट विज़ुअलाइज़ेशन का एक ग्राफिक चित्रण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig4.jpg"> चित्र 4: वी.आर. में विश्लेषण. (क)एक उपयोगकर्ता पर काम करते समय वी.आर. हेडसेट पहने हुए (ख) एफआईबी-सेम डेटासेट (ii) (जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा की गई) से सघन पुनर्निर्माण होता है। (ग)पैनल खसे न्यूराइट्स के एक सबसेट से इमर्सिव वी . सी . दृश्य . हरी लेजर एक GLAM चोटी की ओर इशारा कर रहा है. (घ)वीआर में जीएम पीक गणना से प्राप्त विश्लेषण का उदाहरण। प्रत्येक बार प्रति N $ 3 चूहे. पिछले प्रकाशन28से FIB-SEM का विश्लेषण | त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटियों को इंगित करती हैं; *पी एंड एलटी; 0.1, एक तरह से ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

वर्णित पाइपलाइन को गीगाबाइट से बड़े इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटासेट के विभाजन के लिए डिज़ाइन किया गया है, ताकि पूरे सेल मॉर्फोलॉग को निकाला जा सके। एक बार कोशिकाओं 3 डी में पुनर्निर्माण कर रहे हैं, अनुकूलित व्यक्तिगत जरूरतों के आसपास डिजाइन सॉफ्टवेयर एक गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण 3 डी में सीधे प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह भी देखने occlusion पर काबू पाने के लिए आभासी वास्तविकता का उपयोग.

3 डी पुनर्निर्माण और Glial और न्यूरोनल कोशिकाओं के आभासी वास्तविकता विश्लेषण के लिए एक विधि

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

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