Name: a method for 3d reconstruction and virtual reality analysis of glial and neuronal cells
Uploaded: 2019-09-28T13:00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione "KAUST-BBP Alliance for Integrative Modelling of Brain Energy Metabolism" della King Abdullah University of Science and Technology (KAUST) "KAUST-BBP Alliance for Integrative Modelling of Brain Energy Metabolism" a P.J.M.

1. Elaborazione delle immagini con Fiji
<ol><li>Aprire la pila di immagini trascinando e rilasciando il file nativo dal microscopio contenente la pila o trascinando e rilasciando la cartella contenente l'intera pila di immagini nella finestra del software. NOT:</</c0> Fiji è in grado di riconoscere automaticamente tutti i formati di immagine standard, come .jpg, .tif, e .png, così come i formati di file proprietari da fornitori di microscopio. Mentre il protocollo seguente è stato ottimizzato per gli stack di immagini da 3DEM, questi passaggi potrebbero essere utilizzati anche per i set di dati di microscopia leggera.</li>
	<li>Una volta aperto lo stack, vai a Immagine > Proprietà per assicurarti che la dimensione voxel sia stata letta dai metadati. In caso contrario, può essere immesso manualmente.</li>
	<li>Assicurati di trasformare l'immagine in 8 bit. Fare clic su Immagine > Tipo e selezionare 8-bit.</li>
	<li>Se lo stack originale si trovava in file/cartelle sequenziali diversi, utilizzare Concatena te per unirli in un unico stack selezionando Immagine > Stack > Strumenti > Concatena.</li>
	<li>Salvare la pila selezionando File > Salva con nome. Verrà salvato come singolo file .tif e può essere utilizzato come backup e per un'ulteriore elaborazione.</li>
	<li>Se la pila originale viene acquisita come piastrelle diverse, applicare cuciture all'interno di TrakEM2.
	<ol>
<li>Creare un nuovo progetto TrakEM2 utilizzando Nuovo > TrakEM2 (vuoto).</li>
		<li>All'interno dell'interfaccia utente grafica (GUI) del riquadro di visualizzazione, importare gli stack facendo clic con il pulsante destro del mouse > Importa > Importa pilae importando tutti i riquadri aperti nella GUI principale di Fiji. Assicurati di ridimensionare le dimensioni dell'area di disegno per adattarla all'intera pila facendo clic con il pulsante destro del mouse > Schermo > Ridimensiona canvas/insieme di livellie scegli la dimensione y /x pixel a seconda delle dimensioni finali del montaggio. NOT:</</c9> Ad esempio, se il montaggio deve essere finalizzato utilizzando quattro riquadri di 4.096 x 4.096 pixel, le dimensioni dell'area di disegno devono essere di almeno 8.192 x 8.192 pixel. Si consideri di renderlo leggermente più grande, e ritagliarlo più tardi.</li>
		<li>Sovrapporre le parti comuni dei singoli riquadri trascinandole e rilasciandole sul set di livelli. Utilizzare il dispositivo di scorrimento in alto a sinistra per modificare la trasparenza per facilitare la sovrapposizione.</li>
		<li>Montare e riallineare le pile facendo clic con il pulsante destro del mouse > Allinea, quindi selezionare una delle opzioni (vedere la nota seguente). NOT:</</c11> SBEM o FIB-SEM sono in genere già ben allineati, ma potrebbero verificarsi disallineamenti minori. Allinea livelli è la pipeline automatica per l'allineamento z; Montage più livelli è la pipeline automatica per allineare i piastrelle su ogni stack z, per l'intero volume; Il mosaico multistrato allinea combina le due opzioni precedenti. Questa operazione richiede molto tempo e soggetta alla memoria ad accesso casuale (RAM) della macchina. Considerare l'utilizzo di un computer di fascia alta e lasciarlo funzionare per ore/giorni, a seconda delle dimensioni dello stack.</li>
		<li>Infine, esportare le pile di immagini e salvarle utilizzando il pulsante destro del mouse > Crea immagine piatta, quindi assicurarsi di selezionare la prima e l'ultima immagine nei menu a discesa Inizio e Fine.</li>
		<li>Utilizzando le funzioni incorporate TrakEM2, segmentare le strutture di interesse, se necessario.<ol>
<li>Nella GUI di TrakEM2, fare clic con il pulsante destro del mouse su Qualsiasi cosa nella finestra Modello e selezionare Aggiungi nuovo figlio > Area_list.</li>
			<li>Trascinare e rilasciare Qualsiasi elemento nella parte superiore della cartella in Oggetti di progettoe verrà visualizzato Qualsiasi elemento.</li>
			<li>Trascinare l'elenco Area dal modello all'elenco Qualsiasi elemento che si trova in Oggetti progetto.</li>
			<li>Nella finestra dello stack di immagini, selezionare lo spazio con il cursore. Apparirà l'elenco delle aree, con un numero ID univoco. Selezionare lo strumento pennello in alto (in basso a destra) e utilizzare il mouse per segmentare una struttura riempiendo il suo citosol, sull'intero stack z.</li>
			<li>Esportare la maschera segmentata da utilizzare in ilastik come seeding per l'intaglio facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto elenco Area nell'elenco Spazio z o sulla maschera nella finestra e selezionare Esporta > Area elenchi come etichette (tif).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>A seconda della risoluzione necessaria per ulteriori ricostruzioni, se possibile, ridurre le dimensioni in pixel dello stack di immagini mediante il downsampling, considerando i requisiti di memoria del software che verrà utilizzato per la segmentazione e la ricostruzione. Usa immagine > Regola > Dimensioni. NOTA: ilastik gestisce stack fino a 500 pixel su xy pozzetto. Inoltre, il downsampling ridurrà la risoluzione dello stack; pertanto, prendere in considerazione la dimensione minima alla quale l'oggetto appare ancora riconoscibile e, quindi, può essere segmentato.</li>
	<li>Per migliorare il contrasto e aiutare la segmentazione, il filtro Maschera di contrasto può essere applicato per rendere le membrane più nitide. Usa Processo > Filtro > Maschera di contrasto.</li>
	<li>Esportare la pila di immagini come singole immagini per un'ulteriore elaborazione nel software di segmentazione (ad esempio, ilastik), utilizzando File > Salva con nome... > Sequenza immagini e scegliere formato .tif.</li>
</ol>2. Segmentazione (semi-automatica) e ricostruzione con ilastik 1.3.2
<ol><li>Nella GUI principale di ilastik, selezionare il modulo Intaglio.</li>
	<li>Caricare la pila di immagini utilizzando Aggiungi nuovo > Aggiungi un singolo volume 3D/4D dalla sequenza.</li>
	<li>Selezionare Intera directory e scegliere la cartella contenente la pila di immagini salvata come singoli file. Nella parte inferiore della nuova finestra, in cui sono presenti le opzioni per il caricamento delle immagini, assicurarsi di mantenere selezionata l'opzione .</li>
	<li>Per i seguenti passaggi, tutte le operazioni e i pulsanti si trovano sul lato sinistro della GUI principale del software. Nella scheda Pre-elaborazione, utilizzare le opzioni standard già selezionate. Utilizzare linee luminose (filtri di cresta) e mantenere la scala del filtro a 1.600. Questo parametro può essere modificato in seguito.</li>
	<li>Al termine della pre-elaborazione, selezionare la pagina successiva nel menu a discesa del modulo Etichettatura. Un oggetto e uno sfondo sono presenti per impostazione predefinita.</li>
	<li>
Selezionare il valore di serie dell'oggetto facendo clic su di esso e disegnare una linea sopra la struttura di interesse; quindi, selezionare il seme di sfondo e disegnare una o più linee all'esterno dell'oggetto da ricostruire. Quindi, fare clic su Segmento e attendere. NOTA: a seconda della potenza del computer e delle dimensioni dello stack, la segmentazione potrebbe richiedere da pochi secondi alle ore. Al termine, una maschera semitrasparente che evidenzia la segmentazione dovrebbe apparire sopra la struttura segmentata.<ol>
<li>Scorrere la pila per verificare la segmentazione. La segmentazione potrebbe non essere accurata e non seguire con precisione la struttura di interesse o fuoriuscire da essa. Correggere la fuoriuscita posizionando un seme di sfondo sulla segmentazione versata e aggiungere un valore di seme dell'oggetto non ricostruito dell'oggetto di interesse.</li>
		<li>Se la segmentazione non è ancora corretta, provare a modificare con il parametro Bias, che aumenterà o diminuirà la quantità di pixel classificati incerti come accettati. Il valore è 0,95 per impostazione predefinita; ridurlo per limitare eventuali ricadute (di solito a non meno di 0,9) o aumentare se la segmentazione è troppo conservativa (fino a 1).</li>
		<li>Un'altra possibilità è quella di tornare al passaggio 2.4 (cliccando su Pre-elaborazione)e di modificare le dimensioni del filtro; aumentando il valore (ad esempio, a 2) si ridurranno al minimo gli effetti simili al rumore di sale e pepe, ma renderà anche le membrane più sfocate e dettagli più piccoli più difficili da rilevare. Questo potrebbe limitare la fuoriuscita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ribadisci il più possibile, purché tutti gli oggetti desiderati siano stati segmentati. Una volta che un oggetto è finito, clicca su Salva oggetto corrente, sotto Segmento. Appariranno due nuovi semi, per iniziare la segmentazione di un nuovo oggetto.</li>
	<li>Estrarre le maglie di superficie immediatamente come file .obj facendo clic su Esporta tutte le maglie.</li>
	<li>Se è necessaria un'ulteriore correzione delle bozze, la segmentazione può essere estratta come maschere binarie. Selezionare la maschera per esportarla facendo clic su Sfoglia oggetti; quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse su Segmentazione > Esporta e, in Informazioni file di output,selezionare tif sequenza come formato.</li>
</ol>3. Correzione/Segmentazione (Manuale) in TrakEM2 (Fiji)
<ol><li>Caricare la pila di immagini e creare un nuovo progetto TrekEM2 come da passo 1.6.1.</li>
	<li>Importare le maschere che necessitano di correzione di bozze utilizzando l'opzione Importa etichette come elenchi di aree, disponibili nello stesso menu di importazione utilizzato per importare la pila di immagini.</li>
	<li>Selezionate l'elenco delle aree importato nello spazio z e usate lo strumento Pennello per rivedere la segmentazione.</li>
	<li>Visualizzare il modello in 3D facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'elenco Area > Mostra in 3D. Nella finestra seguente che richiede un numero di ricampionamento, un valore più alto genererà una mesh a risoluzione inferiore. NOT:</</c3> A seconda delle dimensioni dell'oggetto, prendere in considerazione l'utilizzo di un valore compreso tra 4 e 6, che di solito fornisce il miglior compromesso tra risoluzione e dettaglio morfologico.</li>
	<li>Esportare la mesh 3D come .obj fronte onda scegliendo dal menu File > Esporta superfici > Wavefront.</li>
</ol>4. Analisi 3D
<ol><li>Aprire Blender. Per i passaggi seguenti, assicurarsi di installare il toolkit NeuroMorph (disponibile all'https://neuromorph.epfl.ch/index.html) e il toolkit di analisi del glicogeno (disponibile allhttps://github.com/daniJb/glyco-analysis).
	<ol>
<li>Importare gli oggetti utilizzando l'importazione batch NeuroMorph facendo clic su Importa oggetti nel menu Scena per importare più oggetti contemporaneamente. Assicurarsi di attivare Usa mesh e Ombreggiatura uniforme. NOT:</</c6> Non è consigliabile fare clic su Finalizza remesh se c'è incertezza sulla dimensione iniziale dell'oggetto. La profondità dell'albero di importazione al valore 7 (predefinito) è in genere buona per mantenere una risoluzione e una morfologia accettabili dell'oggetto.</li>
		<li>Selezionare l'oggetto di interesse dal outliner e modificare la profondità octree della funzione remesh nel menu Modificatori in modo iterativo per ridurre al minimo il numero di vertici ed evitare di perdere dettagli in risoluzione e morfologia corretta. Quando si modifica la profondità dell'octree, la mesh sulla GUI principale cambierà di conseguenza. Al termine, fare clic su Applica per finalizzare il processo. NOT:</</c11> I valori intorno a 4 sono di solito buoni per piccoli oggetti (come le densità post-sinaptiche), i valori intorno a 7 per quelli più grandi (come assoni lunghi o dendriti), e i valori intorno a 8 o 9 per le morfologie complete in cui i dettagli delle diverse risoluzioni devono essere Mantenuto.</li>
		<li>Usate lo strumento di sovrapposizione delle immagini Interazioni stack di immagini nel pannello di sinistra, sotto il menu NeuroMorph, per caricare la pila di immagini. Assicurarsi di immettere le dimensioni fisiche della pila di immagini per x, ye x (in micron o nanometri, a seconda delle unità della mesh) e selezionare il percorso della pila facendo clic su Sorgente_. X e Y sono piani ortogonali; sono facoltativi e verranno caricati solo se l'utente inserisce un percorso valido.</li>
		<li>Quindi, selezionare una mesh sulla finestra facendo clic con il pulsante destro del mouse su di essa, accedere alla modalità di modifica premendo TAB, selezionare uno (o più) vertici con il tasto destro del mouse e infine fare clic su Mostra immagine al vertice. Uno (o più) piani tagliati con la micrografia appariranno sovrapposti sopra la mesh.</li>
		<li>Selezionare il piano di taglio facendo clic con il pulsante destro del mouse su di esso, premere CTRL e Ye scorrere il modello 3D utilizzando lo scorrimento del mouse. Questo può essere utilizzato anche come metodo di correzione delle bozze.</li>
		<li>Utilizzare gli strumenti di misurazione per le quantificazioni di superfici, volumi e lunghezze. Queste operazioni sono documentate in dettaglio da Jorstad et al.19 e sul sito Web NeuroMorph24.</li>
		<li>Utilizzare lo strumento di analisi glicogeno per quantificare la vicinanza del glicogeno verso spine e bouton. Le operazioni sono documentate in dettaglio in una precedente pubblicazione10 e nel repository di analisi del glicogeno25.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire GLAM23. Il codice, l'eseguibile e alcuni file di test sono disponibili nel repository GLAM26.
	<ol>
<li>Preparare due file di geometria in formato .ply: un file di origine contenente granuli di glicogeno e un file di destinazione contenente le superfici morfologia.</li>
		<li>Preparare tre file di mappa colori .ascii (ogni riga contenente t_norm(0..1) R(0..255) G(0..255) B(0..255)) per rappresentare i valori di assorbimento locali, i valori di picco e i valori medi di assorbimento.</li>
		<li>Eseguite lo script GLAM, con i file di geometria (passaggio 4.2.1) e i file colormap (passaggio 4.2.2), impostando il raggio di influenza (in micron), il valore massimo previsto di assorbimento e una soglia normalizzata per il clustering dei picchi di assorbimento. Per informazioni su altri parametri, eseguire lo script con l'opzione -help.</li>
		<li>Esportare i risultati come file .ply o .obj: oggetti di destinazione mappati a colori con valori GLAM, indicatori di picco di assorbimento rappresentati come sfere codificate a colori e oggetti con codifica a colori rispetto al valore medio di assorbimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Aprire VR Data Interact. VR Data Il codice eseguibile di interazione è disponibile in un repository pubblico27.
	<ol>
<li>Importa le maglie da visualizzare, seguendo le istruzioni nel menu VR. Assicurarsi di importare i file obj calcolati nel passaggio 4.2.1, nel caso in cui sia necessaria un'analisi GLAM.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLOS Biology. 2, e329 (2004).</li><li>Coggan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Process+for+Digitizing+and+Simulating+Biologically+Realistic+Oligocellular+Networks+Demonstrated+for+the+Neuro-Glio-Vascular+Ensemble.">A Process for Digitizing and Simulating Biologically Realistic Oligocellular Networks Demonstrated for the Neuro-Glio-Vascular Ensemble.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Profiles+of+Myelin+Distribution+Along+Single+Axons+of+Pyramidal+Neurons+in+the+Neocortex.">Distinct Profiles of Myelin Distribution Along Single Axons of Pyramidal Neurons in the Neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19, 816-825 (2016).</li><li>Kasthuri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saturated+Reconstruction+of+a+Volume+of+Neocortex.">Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex.</a> Cell. 162, 648-661 (2015).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+neuropil+structure+in+mouse+somatosensory+cortex&#8212;A+3D+electron+microscopy+analysis+of+layer+1.">The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex&#8212;A 3D electron microscopy analysis of layer 1.</a> PLOS ONE. 13, e0198131 (2018).</li><li>Cal&#236;, C., Agus, M., Gagnon, N., Hadwiger, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Analysis+of+Glycogen+Derived+Lactate+Absorption+in+Dense+and+Sparse+Surface+Reconstructions+of+Rodent+Brain+Structures.">Visual Analysis of Glycogen Derived Lactate Absorption in Dense and Sparse Surface Reconstructions of Rodent Brain Structures.</a> , (2017).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+immersive+virtual+reality+for+studying+cellular+compartments+in+3D+models+from+EM+preparations+of+neural+tissues.">Three-dimensional immersive virtual reality for studying cellular compartments in 3D models from EM preparations of neural tissues.</a> Journal of Comparative Neurology. 524, 23-38 (2016).</li><li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruct:+a+free+editor+for+serial+section+microscopy.">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7, e38011 (2012).</li><li>Januszewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+automated+reconstruction+of+neurons+with+flood-filling+networks.">High-precision automated reconstruction of neurons with flood-filling networks.</a> Nature Methods. 1, (2018).</li><li>Shahbazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+Learning-Free+Segmentation+and+Reconstruction+of+Neural+Volumes.">Flexible Learning-Free Segmentation and Reconstruction of Neural Volumes.</a> Scientific Reports. 8, 14247 (2018).</li><li>Sommer, C., Straehle, C., K&#246;the, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ilastik:+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit.">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> , (2011).</li><li>Holst, G., Berg, S., Kare, K., Magistretti, P., Cal&#236;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+large+EM+stack+support.">Adding large EM stack support.</a> , (2016).</li><li>Beyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ConnectomeExplorer:+query-guided+visual+analysis+of+large+volumetric+neuroscience+data.">ConnectomeExplorer: query-guided visual analysis of large volumetric neuroscience data.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 19, 2868-2877 (2013).</li><li>Beyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culling+for+Extreme-Scale+Segmentation+Volumes:+A+Hybrid+Deterministic+and+Probabilistic+Approach.">Culling for Extreme-Scale Segmentation Volumes: A Hybrid Deterministic and Probabilistic Approach.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer. , (2018).</li><li>Jorstad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroMorph:+A+Toolset+for+the+Morphometric+Analysis+and+Visualization+of+3D+Models+Derived+from+Electron+Microscopy+Image+Stacks.">NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks.</a> Neuroinformatics. 13, 83-92 (2015).</li><li>Jorstad, A., Blanc, J., Knott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroMorph:+A+Software+Toolset+for+3D+Analysis+of+Neurite+Morphology+and+Connectivity.">NeuroMorph: A Software Toolset for 3D Analysis of Neurite Morphology and Connectivity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 59 (2018).</li><li>Cal&#236;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+anatomy+in+the+times+of+connectomics.">Astroglial anatomy in the times of connectomics.</a> Journal of Translational Neuroscience. 2, 31-40 (2017).</li><li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abstractocyte:+A+Visual+Tool+for+Exploring+Nanoscale+Astroglial+Cells.">Abstractocyte: A Visual Tool for Exploring Nanoscale Astroglial Cells.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. , (2017).</li><li>Agus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLAM:+Glycogen-derived+Lactate+Absorption+Map+for+visual+analysis+of+dense+and+sparse+surface+reconstructions+of+rodent+brain+structures+on+desktop+systems+and+virtual+environments.">GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments.</a> Computers &amp; Graphics. 74, 85-98 (2018).</li><li>&#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeuroMorph Analysis and Visualization Toolset. , (2018).</li><li>. GitHub - daniJb/glycol-analysis: Glycogen_analysis.py is a python-blender API based script that performs analysis on a reconstructed module of glycogen data Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/daniJb/glyco-analysis">https://github.com/daniJb/glyco-analysis</a> (2018)</li><li>. GitHub &#8211; magus74/GLAM: Glycogen Lactate Absorption Model Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/magus74/GLAM">https://github.com/magus74/GLAM</a> (2019)</li><li>Agus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLAM:+Glycogen-derived+Lactate+Absorption+Map+for+visual+analysis+of+dense+and+sparse+surface+reconstructions+of+rodent+brain+structures+on+desktop+systems+and+virtual+environments.">GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments.</a> Dryad Digital Repository. , (2018).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from:+The+effects+of+aging+on+neuropil+structure+in+mouse+somatosensory+cortex&#8212;A+3D+electron+microscopy+analysis+of+layer+1.">Data from: The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex&#8212;A 3D electron microscopy analysis of layer 1.</a> Dryad Digital Repository. , (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo qui presentato è un'utile guida passo-passo per la segmentazione e la ricostruzione 3D di un set di dati EM multiscala, sia che provengano da tecniche di imaging ad alta risoluzione, come FIB-SEM, o altre tecniche di sezionamento e imaging seriali automatizzate. FIB-SEM ha il vantaggio di raggiungere potenzialmente l'isotropia perfetta in formato voxel tagliando sezioni sottili fino a 5 nm utilizzando un fascio ionico focalizzato, il suo FOV potrebbe essere limitato a 15-20 m a causa di artefatti laterali, che sono probabilmente dovuti alla deposizione del tessuto tagliato se la FO V supera questo valore. Tali artefatti possono essere evitati utilizzando altre tecniche, come SBEM, che utilizza un coltello di adiamante per tagliare sezioni seriali all'interno della camera del microscopio. In quest'ultimo caso, la risoluzione z può essere di circa 20 nm nella migliore delle posizioni (in genere, 50 nm), ma il FOV potrebbe essere più grande, anche se la risoluzione dei pixel deve essere compromessa per una vasta area di interesse. Una soluzione per superare tali limitazioni (ingrandimento contro FOV) è quella di dividere la regione di interesse nelle piastrelle e acquisire ciascuno di essi ad una risoluzione più alta. Abbiamo mostrato qui i risultati di un set di dati dello stack SBEM (i) nei risultati rappresentativi, sia di un set di dati dello stack FIB-SEM (ii) nei risultati rappresentativi.
Man mano che la generazione di set di dati sempre più grandi e grandi sta diventando sempre più comune, gli sforzi per la creazione di strumenti per la classificazione dei pixel e la segmentazione automatica delle immagini si moltiplicano; tuttavia, ad oggi, nessun software ha dimostrato un'affidabilità paragonabile a quella della revisione umana, che è quindi ancora necessaria, indipendentemente dal suo dispendioso in termini di tempo. In generale, i set di dati più piccoli che possono essere sottocampionati, come nel caso del set di dati (ii), possono essere ricostruiti densamente da un singolo utente esperto in una settimana, incluso il tempo di correzione delle revisioni.
Il protocollo qui presentato prevede l'uso di tre programmi software in particolare: Fiji (versione 2.0.0-rc-65/1.65b), ilastik (versione 1.3.2 rc2) e Blender (2.79), che sono tutti programmi open-source e multi-piattaforma e scaricabili gratuitamente. Fiji è un rilascio di ImageJ, alimentato da plugin per l'analisi biologica delle immagini. Ha un'architettura software robusta ed è suggerito in quanto è una piattaforma comune per gli scienziati della vita e comprende TrakEM2, uno dei primi e più ampiamente utilizzati plugin per la segmentazione delle immagini. Un problema sperimentato da molti utenti ultimamente è la transizione da Java 6 a Java 8, che sta creando problemi di compatibilità; pertanto, si consiglia di astenersi dall'aggiornamento a Java 8, se possibile, per consentire alle Figi di funzionare correttamente. ilastik è un potente software che fornisce una serie di quadri per la classificazione dei pixel, ognuno documentato e spiegato sul loro sito web. Il modulo di intaglio utilizzato per la segmentazione semi-automatica degli stack EM è conveniente in quanto consente di risparmiare molto tempo, consentendo agli scienziati di ridurre il tempo dedicato al lavoro manuale da mesi a giorni per un utente esperto, come con un solo clic un intero neurite può essere segmentati in pochi secondi. La fase di pre-elaborazione è molto intensa dal punto di vista hardware e set di dati molto grandi, come lo stack SBEM presentato qui, che era di 26 GB, richiedono strategie peculiari per adattarsi alla memoria, considerando che si acquisirebbe set di dati di grandi dimensioni perché non è possibile campo di opinione e risoluzione di compromesso. Pertanto, il downsampling potrebbe non essere una soluzione appropriata in questo caso. L'ultima versione del software può fare la pre-elaborazione in poche ore con una potente workstation Linux, ma la segmentazione richiederebbe minuti, e scorrendo attraverso lo stack sarebbe ancora relativamente lento. Usiamo ancora questo metodo per una prima segmentazione approssimativa e ne leggiamo la prova usando TrakEM2. Infine, Blender è un software di modellazione 3D, con un potente motore di rendering 3D, che può essere personalizzato con script pitone che possono essere incorporati nella GUI principale come componenti aggiuntivi, come NeuroMorph e analisi glicogeno. La flessibilità di questo software viene fornito con lo svantaggio che, a differenza delle Fiji, per esempio, non è progettato per la visualizzazione online di grandi set di dati; pertanto, la visualizzazione e la navigazione tra grandi dimensioni (superiore a 1 GB) potrebbero essere lente e non efficienti. Per questo motivo, è sempre consigliabile scegliere tecniche che riducano la complessità della maglia ma stiano attenti a non interrompere la morfologia originale della struttura di interesse. La funzione remesh è utile ed è una funzionalità incorporata dello strumento di importazione batch NeuroMorph. Un problema con questa funzione è che, a seconda del numero di vertici della mesh originale, il valore di profondità dell'octree, che è correlato alla risoluzione finale, deve essere modificato di conseguenza. Gli oggetti piccoli possono essere ristampati con una piccola profondità di octree (ad esempio 4), ma lo stesso valore potrebbe interrompere la morfologia di oggetti più grandi, che ha bisogno di valori più grandi (6 al massimo, a 8 o anche 9 per una mesh molto grande, come una cella completa). Si consiglia di rendere iterativo questo processo e testare le diverse profondità dell'octree se le dimensioni dell'oggetto non sono chiare.
Come accennato in precedenza, un aspetto che dovrebbe essere preso in considerazione è la potenza di calcolo da dedicare alla ricostruzione e all'analisi, relative al software che viene utilizzato. Tutte le operazioni mostrate nei risultati rappresentativi di questo manoscritto sono state ottenute utilizzando un MacPro, dotato di una scheda grafica AMD FirePro D500, 64 GB di RAM e una CPU Intel Xeon E5 con 8 core. Fiji ha una buona architettura software per la gestione di grandi set di dati; pertanto, si consiglia di utilizzare un computer portatile con buone prestazioni hardware, ad esempio un MacBook Pro con una CPU Intel i7 da 2,5 GHz e 16 GB di RAM. Il software ilastik è più esigente in termini di risorse hardware, in particolare durante la fase di pre-elaborazione. Anche se il downsampling dello stack di immagini è un buon trucco per limitare le richieste hardware dal software e consente all'utente di elaborare una pila con un computer portatile (in genere se è inferiore a 500 pixel in x,y,z), suggeriamo l'uso di un high-end computer per eseguire questo software senza problemi. Utilizziamo una workstation dotata di CPU Intel Xeon Gold 6150 con 16 core e 500 GB di RAM.
Quando viene fornita una ricostruzione 3D accurata, gli scienziati possono eliminare i micrografi originali e lavorare direttamente sui modelli 3D per estrarre dati morfometrici utili per confrontare cellule dello stesso tipo, nonché diversi tipi di cellule, e sfruttare la realtà virtuale per valutazioni qualitative e quantitative delle morfologie. In particolare, l'uso di quest'ultimo si è dimostrato vantaggioso nel caso di analisi di morfologie dense o complesse che presentano occlusione visiva (cioè il blocco di vista di un oggetto di interesse nello spazio 3D da parte di un secondo posto tra l'osservatore e la fi rst oggetto), rendendo difficile rappresentarli e analizzarli in 3D. Nell'esempio presentato, un utente esperto ha impiegato circa 4 ore non consecutive per osservare i set di dati e contare gli oggetti. Il tempo dedicato all'analisi della realtà virtuale può variare in quanto aspetti come la malattia della realtà virtuale (che può, in una certa misura, essere correlata al mal d'auto) possono avere un impatto negativo sull'esperienza utente; in questo caso, l'utente potrebbe preferire altri strumenti di analisi e limitare il tempo dedicato alla realtà virtuale.
Infine, tutti questi passaggi possono essere applicati ad altre tecniche di microscopia e non EM che generano pile di immagini. EM genera immagini che sono, in generale, difficili da gestire e segmentare, rispetto, ad esempio, alla microscopia a fluorescenza, dove qualcosa di paragonabile a una maschera binaria (segnale contro sfondo nero), che in linea di principio può essere prontamente resa in 3D per un'ulteriore elaborazione, spesso deve essere affrontata.

Il primo modello proposto per la configurazione di una microscopia elettronica che consente la sezione seriale automatizzata e l'imaging risale al 19811; la diffusione di tali configurazioni automatizzate e migliorate per immagini di grandi campioni utilizzando EM aumentata negli ultimi dieci anni2,3, e opere che mostrano impressionanti ricostruzioni dense o morfologie complete immediatamente seguito4, 5,6,7,8,9,10.
La produzione di set di dati di grandi dimensioni è stata fornita con la necessità di pipeline migliorate per la segmentazione delle immagini. Gli strumenti software per la segmentazione manuale delle sezioni seriali, come RECONSTRUCT e TrakEM211,12, sono stati progettati per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Poiché l'intero processo può richiedere molto tempo, questi strumenti non sono appropriati quando si tratta di migliaia di micrografie seriali che possono essere generati automaticamente con tecniche di sezione seriale EM automatizzate (3DEM), come microscopia elettronica a scansione a blocchi (SBEM)3 o microscopia elettronica a scansione del fascio focalizzato (FIB-SEM)2. Per questo motivo, gli scienziati hanno messo gli sforzi nello sviluppo di strumenti semi-automatizzati, nonché di strumenti completamente automatizzati, per migliorare l'efficienza della segmentazione. Strumenti completamente automatizzati, basati su machine learning13 o algoritmi di classificazione dei pixel non addestrati allo stato dell'arte14,vengono migliorati per essere utilizzati da una comunità più ampia; tuttavia, la segmentazione è ancora lungi dall'essere pienamente affidabile, e molte opere sono ancora basate sul lavoro manuale, che è inefficiente in termini di tempo di segmentazione, ma fornisce ancora completa affidabilità. Gli strumenti semiautomatici, come ilastik15, rappresentano un compromesso migliore, in quanto forniscono una lettura immediata per la segmentazione che può essere corretta in una certa misura, anche se non fornisce un quadro di correzione reale e può essere integrato utilizzando TrakEM2 in parallelo16.
La segmentazione su larga scala è, ad oggi, per lo più limitata alla connettomica; pertanto, gli informatici sono più interessati a fornire quadri per le visualizzazioni integrate di grandi set di dati annotati e ad analizzare i modelli di connettività dedotti dalla presenza di contatti sinaptici17,18. Tuttavia, ricostruzioni 3D accurate possono essere utilizzate per analisi morfometriche quantitative, piuttosto che valutazioni qualitative delle strutture 3D. Strumenti come NeuroMorph19,20 e analisi glicogeno10 sono stati sviluppati per prendere misure sulle ricostruzioni 3D per lunghezze, aree di superficie e volumi, e sulla distribuzione di punti nuvola, completamente scartando lo stack EM originale8,10. Gli astrociti rappresentano un caso di studio interessante, perché la mancanza di indizi visivi o modelli strutturali ripetitivi danno ai ricercatori un accenno sulla funzione delle singole unità strutturali e la conseguente mancanza di un'adeguata ontologia dei processi astrociti 21, rendere difficile la progettazione di strumenti analitici. Un recente tentativo è stato l'Assotite22, che consente un'esplorazione visiva dei processi astrociti e l'inferenza di relazioni qualitative tra processi astrociti citici e neuriti.
Tuttavia, la comodità dell'imaging del tessuto sezionato sotto EM deriva dal fatto che la quantità di informazioni nascoste in campioni di cervello intatti è enorme e l'interpretazione di immagini a sezione singola può superare questo problema. La densità delle strutture nel cervello è così alta che ricostruzioni 3D anche di pochi oggetti visibili contemporaneamente renderebbero impossibile distinguerli visivamente. Per questo motivo, abbiamo recentemente proposto l'uso della realtà virtuale (VR) come metodo migliorato per osservare strutture complesse. Ci concentriamo sugli astrociti23 per superare l'occlusione (che è il blocco della visibilità di un oggetto di interesse con un secondo spazio, in uno spazio 3D) e facilitare le valutazioni qualitative delle ricostruzioni, tra cui la correzione delle bozze, così come le quantificazioni di feature utilizzando il conteggio dei punti nello spazio. Recentemente abbiamo combinato l'esplorazione visiva VR con l'uso di GLAM (modello di assorbimento lattato derivato dal glicogeno), una tecnica per visualizzare una mappa della probabilità di navetta lattato di neuriti, considerando i granuli di glicogeno come corpi che emettono luce23; in particolare, abbiamo usato la VR per quantificare i picchi di luce prodotti da GLAM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>2.0.0-rc-65/1.65b</td>
			<td>Open Source image processing editor 
			www.fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLastik</td>
			<td>Open Source&#160;</td>
			<td>1.3.2 rc2</td>
			<td>Image Segmentation tool 
			www.ilastik.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Blender Foundation</td>
			<td>2.79</td>
			<td>Open Source 3D Modeling software 
			www.blender.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Vive Headset</td>
			<td>HTC</td>
			<td>Vive / Vive Pro</td>
			<td>Virtual Reality (VR) Head monted headset 
			www.vive.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromorph</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of Blender Addons for 3D Analysis 
			neuromorph.epfl.ch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen Analysis</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>Blender addon for analysis of Glycogen 
			https://github.com/daniJb/glyco-analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAM</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>C++ Code For generating GLAM Maps 
			https://github.com/magus74/GLAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for 3d reconstruction and virtual reality analysis of glial and neuronal cells

La sezionamento seriale e la successiva imaging ad alta risoluzione del tessuto biologico utilizzando la microscopia elettronica (EM) consentono alla segmentazione e alla ricostruzione di pile a immagine ad alta risoluzione di rivelare modelli ultrastrutturali che non potevano essere risolti utilizzando 2D Immagini. Infatti, quest'ultimo potrebbe portare a un'errata interpretazione delle morfologie, come nel caso dei mitocondri; l'uso di modelli 3D è, quindi, sempre più comune e applicato alla formulazione di ipotesi funzionali basate sulla morfologia. Ad oggi, l'uso di modelli 3D generati da pile di immagini di luce o elettroni rende le valutazioni qualitative e visive, così come la quantificazione, più convenienti da eseguire direttamente in 3D. Poiché questi modelli sono spesso estremamente complessi, è anche importante creare un ambiente di realtà virtuale per superare l'occlusione e sfruttare appieno la struttura 3D. Qui, una guida passo-passo dalla segmentazione dell'immagine alla ricostruzione e all'analisi è descritta in dettaglio.

Utilizzando la procedura presentata in precedenza, vengono illustrati i risultati in due stack di immagini di dimensioni diverse, per dimostrare come la flessibilità degli strumenti consente di scalare la procedura a set di dati più grandi. In questo caso, i due set di dati 3DEM sono (i) ratto P14, corteccia somatosensoriale, strato VI, 100 m x 100 m x 76,4 m4 e (ii) ratto P60, ippocampo CA1, 7,07 m x 6,75 m x 4,73 mx 10.
I passaggi di pre-elaborazione (Figura 1) possono essere eseguiti allo stesso modo per entrambi i set di dati, semplicemente tenendo conto che un set di dati più grande, ad esempio il primo stack, ovvero 25 GB, richiede hardware più performante per gestire la visualizzazione e l'elaborazione di dati di grandi dimensioni . Il secondo stack è solo 1 GB, con una dimensione voxel perfettamente isotropico.
La dimensione dei dati potrebbe non essere direttamente correlata al campo visivo (FOV), piuttosto che alla risoluzione dello stack stesso, che dipende dalla dimensione massima in pixel del sensore del microscopio e dall'ingrandimento dello stack. In ogni caso, logicamente, è probabile che i FOV più grandi occupino più spazio fisico rispetto ai FOV più piccoli, se acquisiti alla stessa risoluzione.
Una volta importato lo stack di immagini, come indicato nella sezione 1 del protocollo, nel software Fiji (Figura 1A), una versione scientifica di ImageJ12, un punto importante è assicurarsi che il formato dell'immagine sia a 8 bit (Figura 1B). Questo perché molte aziende di microscopia di acquisizione diverse produttori di produttori generano il loro formato di file proprietario a 16 bit per memorizzare i metadati rilevanti per le informazioni sul processo di acquisizione (cioè, dimensione dei pixel, spessore, corrente/tensione del fascio di elettroni, pressione della camera) insieme alla pila di immagini. Tali regolazioni consentono agli scienziati di risparmiare memoria, poiché l'extra 8 bit contenente metadati non influisce sulle immagini. Il secondo parametro importante da controllare è la dimensione del voxel, che consente quindi di eseguire la ricostruzione dopo la segmentazione sulla scala corretta (micrometri o nanometri; Figura 1B).
Le pile potrebbero richiedere il riallineamento e/o le cuciture se sono state acquisite utilizzando l'agustatura; queste operazioni possono essere eseguite all'interno di TrakEM2 (Figura 2A), anche se per quanto riguarda il riallineamento, le tecniche 3DEM automatizzate come FIB-SEM o 3View sono in genere ben riallineate.
Un ultimo passaggio richiede il filtraggio e, eventualmente, il downsampling della pila, a seconda di quali oggetti devono essere ricostruiti e se il downsampling influisce sul riconoscimento delle feature ricostruibili. Ad esempio, per lo stack più grande (della corteccia somatosensoriale dei ratti P14), non è stato possibile compromettere la risoluzione a beneficio dell'efficienza di ricostruzione, mentre per lo stack più piccolo (dell'ippocampo CA1 dei ratti P60), è stato possibile farlo perché la risoluzione era di gran lunga superiore a quella necessaria per ricostruire gli oggetti più piccoli. Infine, l'uso della maschera unsharp migliora la differenza tra le membrane e lo sfondo, rendendolo favorevole per le ricostruzioni di software come ilastik che utilizza gradienti per pre-valutare i confini.
Dopo l'elaborazione dell'immagine, la ricostruzione può essere eseguita manualmente utilizzando TrakEM2 o semi-automaticamente utilizzando ilastik (Figura 2C). Un set di dati come quello più piccolo elencato qui (ii), che può essere campionato per adattarsi alla memoria, può essere completamente segmentato utilizzando ilastik (Figura 2B) per produrre una ricostruzione densa. Nel caso del primo set di dati elencato qui (i), siamo riusciti a caricare e pre-elaborare l'intero set di dati con una workstation Linux con 500 GB di RAM. La segmentazione sparse di 16 morfologie complete è stata ottenuta con una conduttura ibrida, estraendo la segmentazione ruvida che è stata revisionata manualmente utilizzando TrakEM2.
L'analisi 3D di funzioni quali superfici, volumi o distribuzione del glicogeno intracellulare può essere eseguita all'interno di un ambiente Blender (Figura 3) utilizzando codici personalizzati, come NeuroMorph19 o analisi glicogeno10.
Nel caso di set di dati contenenti anche granuli di glicogeno, è possibile dedurre l'analisi sulla loro distribuzione utilizzando GLAM, un codice C , che genererebbe mappe colore con area di influenza direttamente sulla mesh.
Infine, tali set di dati complessi possono essere visualizzati e analizzati utilizzando VR, che è stato dimostrato utile per l'analisi di set di dati con una particolare vista occlusa (Figura 4). Ad esempio, i picchi dedotti dalle mappe GLAM sono stati facilmente dedotti visivamente dai dendriti nel secondo set di dati descritto qui.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig1.jpg"> Figura 1: Elaborazione dell'immagine e preparazione per la segmentazione dell'immagine. (a) GUI principale delle Figi. (b) Esempio di immagini impilate dal set di dati (i) discusse nei risultati rappresentativi. Il pannello a destra mostra le proprietà che consentono all'utente di impostare le dimensioni del voxel. (c) Esempio di operazione di ridimensionamento e filer applicata a una singola immagine. I pannelli a destra mostrano gli ingrandimenti dal centro dell'immagine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig2.jpg"> Figura 2: Segmentazione e ricostruzione con TrakEM2 e ilastik. (a) ComME2 GUI con oggetti segmentati manualmente (in rosso). (b) La maschera esportata dal pannello a può essere utilizzata come input (seme) per (c) segmentazione semiautomatica (intaglio). Da ilastik, le maschere (rosso) possono essere ulteriormente esportate in TrakEM2 per la correzione manuale delle bozze. (d) Le maschere possono essere esportate come maglie triangolari 3D per rivelare strutture ricostruite. In questo esempio, quattro neuroni, astrociti, microglia e periciti dal set di dati (i) (discusso nei risultati rappresentativi) sono stati ricostruiti utilizzando questo processo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig3.jpg"> Figura 3: Analisi 3D delle morfologie ricostruite mediante strumenti personalizzati. (a) Volume di immagini isotropiche dal set di dati FIB-SEM (ii) (come discusso nei risultati rappresentativi). (b) Ricostruzione densa dal pannello a. Grigio - assoni; verde - processo astrocitico; blu - dendriti. (c) Micrografo che mostra esempi di obiettivi per le quantificazioni quali sinapsi (i)) e granuli di glicogeno astrocitico (set di dati (ii)) nelle giuste. (d) Maschera del pannello c che mostra la distribuzione di granuli di glicogeno intorno alle sinapsi. (e) Quantificazione della distribuzione del glicogeno dal set di dati del pannello c, utilizzando la cassetta degli attrezzi per l'analisi del glicogeno di Blender. Le barre di errore indicano errori standard. N - 4.145 granuli di glicogeno. (f) Illustrazione grafica della visualizzazione di input e output di GLAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig4.jpg"> Figura 4: Analisi in VR. (a) Un utente che indossaun auricolare VR mentre lavora sulla densa ricostruzione dal set di dati FIB-SEM (ii) (come discusso nei risultati rappresentativi). (c) Scena VR immersiva da un sottoinsieme di neuriti dal pannello b. Il laser verde punta a un picco GLAM. (d) Esempio di analisi da conteggi picchi GLAM in VR. N - 3 topi per ogni barra. Analisi della FIB-SEM da una precedente pubblicazione28. Le barre di errore indicano gli errori standard; p < 0.1, ANOVA unidirezionale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells at JoVE.com

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

La pipeline descritta è progettata per la segmentazione di set di dati di microscopia elettronica più grandi di gigabyte, per estrarre morfologie intere celle. Una volta che le celle sono state ricostruite in 3D, software personalizzato progettato intorno alle esigenze individuali può essere utilizzato per eseguire un'analisi qualitativa e quantitativa direttamente in 3D, utilizzando anche la realtà virtuale per superare vista occlusione.

Un metodo per la ricostruzione 3D e l'analisi della realtà virtuale delle cellule gliali e neuronali

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Le tecniche automatizzate di microscopia elettronica a sezione seriale. Il passaggio di limitazione della velocità nella pipeline che porta alla generazione di modelli biologici tridimensionali di elaborazione delle immagini. Il nostro protocollo fornisce una linea guida passo-passo per produrre una costruzione più densa dei volumi di immagini in pochi giorni.Combinato con un approccio per le misurazioni quantitative utilizzando modelli tridimensionali. Con questa tecnica, la struttura 3D dei tessuti, diversa dal cervello, può potenzialmente essere analizzata per identificare le menomazioni strutturali tipiche di alcune malattie e per migliorare la strategia diagnostica. La segmentazione è un passo noioso.Prenditi il tempo necessario per renderlo il più accurato possibile per evitare la correzione di bozze di una segmentazione ccia e dover riavviare l'intero processo. Il design del software a volte non è molto intuitivo. Pertanto, è importante vedere i lavori di inizio sulla segmentazione.Aprire lo stack di immagini trascinando e rilasciando il file nativo dal microscopio contenente lo stack o acquistare il trascinamento della cartella contenente l'intero stack di immagini nella finestra del software Una volta aperto lo stack passare all'immagine, alle proprietà, per assicurarsi che la dimensione dei voxel sia stata letta dai metadati. Trasforma l'immagine in 8 bit facendo clic sull'immagine, digita e seleziona a 8 bit. Se la pila originale viene acquisita come tessere diverse, applicare le cuciture all'interno di TrakEM2.Create un nuovo progetto TrakEM2 utilizzando le strutture di segmento di segmento delle funzioni incorporate New, TrakEM2 Using TrakEM2, se necessario. Nel gooey del TrakEM2 fare clic con il pulsante destro del mouse su 'su qualsiasi cosa' sotto la finestra del modello e selezionare aggiungi nuovo elenco di area figlio'Trascina e rilascia qualsiasi elemento'nella cartella, sotto oggetti progetto', e lì apparirebbe un qualsiasi elemento. Trascinare, l'elenco di area'dal modello all'elemento che si trova sotto gli oggetti progetto'Nel riquadro di visualizzazione dello stack di immagini selezionare lo spazio Z' con il cursore.L'elenco di area verrà visualizzato con il numero ID univoco. Selezionate lo strumento pennello in alto e usate il mouse per segmentare una struttura riempiendola con il suo citosolo sull'intero stack Z. Esportare la massa segmentata, da utilizzare in Ilastik come seme per l'intaglio.A tal fine, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto elenco di area nell'elenco dello spazio Z o sulla maschera nella porta di visualizzazione e selezionare esporta 'elenco area' come etichette T-I-F. A seconda della risoluzione necessaria per ulteriori ricostruzioni, ridurre le dimensioni dei pixel dello stack di immagini mediante down-sampling. Considerare i requisiti di memoria del software che verrà utilizzato per la segmentazione e la ricostruzione.Ilastik gestisce pile fino a cinquecento pixel su X-Y. Prendi in considerazione la dimensione minima che gli oggetti appaiono ancora riconoscibili e quindi possono essere segmentati. Usa la dimensione di regolazione dell'immagine Per migliorare il contrasto e aiutare la segmentazione, il filtro maschera non nitida può essere applicato per rendere le membrane più nitide.Utilizzare il processo 'filtri'massa di contrasto'Esporta lo stack di immagini come singole immagini' per un'ulteriore elaborazione nel software di segmentazione, utilizzando il formato file 'salva come'sequenza di immagini' e scegli il formato TIFF'. Nel gooey principale di Ilastik, selezionare il modulo di intaglio. Caricare lo stack di immagini utilizzando aggiungi nuovo' e aggiungere un singolo volume 3D/4D dalla sequenza 'Seleziona intera directory' e scegliere la cartella contenente lo stack di immagini salvato come singoli file'Nella parte inferiore della nuova finestra, dove sono presenti le opzioni per caricare le immagini, assicurarsi di mantenere Z"selezionato.Per i passaggi seguenti, tutte le operazioni e i pulsanti si trovano sul lato sinistro del gooey del software principale. Nella scheda pre-elaborazione utilizzare le opzioni standard già selezionate. Utilizzare linee luminose 'filtri avanzati' e mantenere la scala del filtro a 1,600.Questo perimetro può essere modificato in seguito. Al termine della pre-elaborazione, selezionare la pagina successiva nel menu a discesa del modulo di etichettatura. Un oggetto e uno sfondo sono presenti per impostazione predefinita.Selezionare il seme dell'oggetto facendo clic su di esso e disegnare una linea sopra la struttura di interesse. Quindi, selezionare il seme di sfondo e disegnare una o più linee all'esterno dell'oggetto da ricostruire. Ora, fai clic sul segmento e attendi.A seconda della potenza del computer e delle dimensioni dello stack, la segmentazione potrebbe richiedere da pochi secondi a ore. Una volta fatto, una maschera semitrasparente che evidenzia la segmentazione dovrebbe apparire sopra la struttura segmentata. Scorrere lo stack per controllare la segmentazione.La segmentazione potrebbe non essere accurata se non segue la struttura degli interessi o si riversa da essa. Correggere qualsiasi fuoriuscita posizionando un seme di sfondo sulla segmentazione versata. E aggiungere un seme di oggetto sul segmento non ricostruito dell'oggetto di interesse.La correzione di bozze visiva accurata della segmentazione con Ilastik potrebbe essere noiosa, ma è essenziale assicurarsi che gli oggetti esportati non contengano artefatti. Se la segmentazione non è ancora corretta, provare a modificare con il parametro bias'che aumenterà o diminuirà la quantità di pixel classificati incerti accettati. Il suo valore è 0,95 per impostazione predefinita.Riducilo per limitare eventuali ricadute o aumenti se la segmentazione è troppo conservativa. Un'altra possibilità è fare clic sulla pre-elaborazione' e modificare le dimensioni del filtro. L'aumento del valore ridurrà al minimo gli effetti simili al rumore di sale e pepe, ma renderà anche le membrane più sfocate e i dettagli più piccoli più difficili da rilevare.Questo potrebbe limitare lo sversamento. Ripetere tutto il necessario purché tutti gli oggetti desiderati siano stati segmentati. Al termine di un oggetto, passare a segmentare' e fare clic su Salva oggetto corrente'Due nuovi semi appariranno per avviare la segmentazione di un nuovo oggetto.La superficie astratta misura immediatamente come file O-B-J facendo clic sull'esportazione di tutte le mesh'Per visualizzare i modelli segmentati manualmente in 3D all'interno di TrakEM2, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'elenco delle area, quindi selezionare mostra in 3D'Un valore più alto genererà una mesh a risoluzione inferiore. Infine, esportare la mesh 3D come WaveFront O-B-J'scegliendo dal file di menu 'export surfaces'WaveFront'Dopo aver installato il kit di strumenti neuromorfi come descritto nel protocollo di testo, open blender. Importare gli oggetti utilizzando l'importazione batch di neuromorfi facendo clic su importa oggetti 'sotto il menu scena per importare più oggetti contemporaneamente.Assicurarsi di attivare, utilizzare la mesh di nuovo e l'ombreggiatura liscia. Selezionate l'oggetto di interesse dall'out-liner e modificate la profondità di otturazione della funzione di mesh di nuovo nel menu del modificatore. Lavorare in modo iterativo per ridurre al minimo il numero di vertici ed evitare di perdere dettagli nella risoluzione e nella corretta morfologia.Quando modificate la profondità dell'ottreo, la mesh sul gooey principale cambierà di conseguenza. Una volta terminato, fare clic su applica per finalizzare il processo. Passare al menu dei neuromorfi sul pannello sinistro e utilizzare le interazioni dello stack di immagini dello strumento sovrapposizione immagini per caricare lo stack di immagini.Assicurati di immettere le dimensioni fisiche dello stack di immagini per X, Y e Z e selezionare il percorso della pila facendo clic sulle fonti Z.X e Y sono piani ortogonali. Sono facoltativi e verranno caricati solo se l'utente inserisce il percorso valido. Quindi, selezionare una mesh sulla porta di visualizzazione facendo clic con il pulsante destro del mouse su di essa.Immettere la modalità di modifica premendo tabulazione, selezionare uno o più vertici utilizzando il clic con il pulsante destro del mouse e infine fare clic su Mostra immagine al vertice. Uno o più piani tagliati con la micrografia appariranno sovrapposti alla rete. Selezionate il piano di taglio facendo clic con il pulsante destro del mouse su di esso.Quindi premere il controllo Y e scorrere il modello 3D utilizzando lo scorrimento del mouse. Questo può essere utilizzato anche come metodo di correzione di bozze. Qui è mostrata la segmentazione e la ricostruzione utilizzando TrakEM2 e Ilastik.Il gooey TrakEM2 viene visualizzato con oggetti segmentati manualmente in rosso. La maschera esportata può quindi essere utilizzata come input per la segmentazione semi-automatizzata. Da Ilastik, le maschere possono essere ulteriormente esportate in TrakEM2 per la correzione manuale.Le maschere possono essere esportate come mesh triangolari 3D per rivelare strutture ricostruite. In questo esempio, quattro neuroni, astrociti, microglia e periciti sono stati ricostruiti usando questo processo. Viene mostrata un'analisi 3D delle morfologie ricostruite utilizzando strumenti personalizzati.Ecco un volume di immagini isotrope da un set di dati di microscopia elettronica a scansione di fascio ionico focalizzato. Una fitta ricostruzione di questi dati rivela gli assoni, il processo astrocitico e i dendriti. Questa micrografia mostra esempi di obiettivi di quantificazione come sinapsi e granuli di glicogeno astrocitico.La maschera di quella micrografia mostra la distribuzione dei granuli di glicogeno attorno alle sinapsi. Ecco un'illustrazione grafica dell'input e dell'output della visualizzazione grafica del modello di assorbimento del lattato derivato dal glicogeno o GLAM'Qui, un utente viene mostrato mentre indossa una realtà virtuale o un auricolare V-R mentre lavora alla ricostruzione densa da un set di dati di microscopia elettronica a scansione di fascio ionico focalizzato. Da un sottoinsieme di neuriti, si può osservare una scena V-R immersiva.Il laser verde punta a un picco GLAM'. è di primaria importanza in quanto determina la dimensione corretta degli oggetti 3D esportati e ne determina le misure riflette le dimensioni effettive. Il concetto di imaging a sezione seriale, segmentazione dell'imaging e costruzione 3D è piuttosto vecchio.Scoprire l'accelerazione tecnica sta portando a progressi nelle colectomies nella revisione dei libri di testo di anatomia. Sebbene il metodo sia stato sviluppato per la ricerca cerebrale in microscopia elettronica, può essere generalizzato a qualsiasi tecnica di microscopia che genera dati Inoltre, qualsiasi tipo di tecnica di imaging 3D può beneficiare di tali tecniche di segmentazione e costruzione dell'imaging. Comprese le scansioni C-T e M-R-I.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Nervous System and Nervous Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

Human Fear Conditioning Conducted in Full Immersion 3-Dimensional Virtual Reality

La paura condizionata umani compiuta Full Immersion 3-Dimensional Realtà Virtuale

Fear conditioning is a widely used paradigm in non-human animal research to investigate the neural mechanisms underlying fear and anxiety. A major ...

Ricerca

Neuroscienze

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l&#39;estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Applicazione simultanea della stimolazione transcranica a corrente continua durante l'esposizione alla realtà virtuale

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a form of non-invasive brain stimulation that changes the likelihood of neuronal firing through ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...