Name: a method for 3d reconstruction and virtual reality analysis of glial and neuronal cells
Uploaded: 2019-09-28T13:00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av King Abdullah University of Science and Technology (KAUST) konkurransedyktige Research Grants (CRG) Grant "KAUST-BBP Alliance for Integrative modellering av Brain Energy metabolisme" til P.J.M.

1. bildebehandling bruke Fiji
<ol><li>Åpne bildes takken ved å dra og slippe den opprinnelige filen fra mikroskopet som inneholder stabelen, eller ved å dra og slippe mappen som inneholder hele bilde stabelen, inn i programvare vinduet. Merk: Fiji kan automatisk gjenkjenne alle standard bildeformater, for eksempel jpg, TIF og PNG, i tillegg til proprietære filformater fra mikroskop leverandører. Selv om følgende protokoll er optimalisert for bilde stabler fra 3DEM, kan disse trinnene også brukes for lys mikroskopi datasett.</li>
	<li>Når stabelen er åpnet, gå til bilde &Gt; egenskaper for å sikre at Voxel størrelsen er lest fra metadataene. Hvis ikke, kan det angis manuelt.</li>
	<li>Sørg for å forvandle bildet til 8-bits. Klikk på bildet &Gt; type og velg 8-bit.</li>
	<li>Hvis den opprinnelige stakken var i forskjellige sekvensielle filer/mapper, bruker du sammenkoble til å flette dem i én stabel ved å velge bilde &Gt; stabler &Gt; verktøy > sammenkoble.</li>
	<li>Lagre stakken ved å velge fil &Gt; lagre som. Det vil bli lagret som en enkelt TIF-fil og kan brukes som en sikkerhetskopi og for videre behandling.</li>
	<li>Hvis den opprinnelige stabelen er ervervet som forskjellige fliser, Påfør søm i TrakEM2.
	<ol>
<li>Opprett et nytt TrakEM2-prosjekt ved hjelp av nye &Gt; TrakEM2 (blank).</li>
		<li>Innenfor viewport grafiske brukergrensesnittet (GUI), importere stabler ved å klikke på høyre museknapp > importere > importere stabelen, og Importer alle flisene åpnet i Fiji viktigste GUI. Pass på at du endrer størrelsen på lerretet slik at det passer til hele stabelen, ved å høyreklikke > skjerm > endre størrelse på lerret/lag sett, og velg pikselstørrelsen y/x avhengig av den endelige størrelsen på Montage. Merk: For eksempel, hvis Montage skal være sluttført ved hjelp av fire fliser på 4 096 x 4 096 piksler, bør lerretet størrelse være minst 8 192 x 8 192 piksler. Vurder å gjøre den litt større og beskjære den senere.</li>
		<li>Sammenligne med de vanlige delene av enkelt brikker ved å dra og slippe dem på lagsettet. Bruk glidebryteren øverst til venstre for å endre gjennomsiktigheten for å hjelpe til med superimposition.</li>
		<li>Montage og justere stabler ved å klikke på høyre museknapp &Gt; Juster, og velg deretter ett av alternativene (se merknad nedenfor). Merk: SBEM eller liten LØGN-SEM er vanligvis allerede godt justert, men mindre avvik kan forekomme. Juster lag er den automatiserte rørledningen for z -justering; Montage flere lag er den automatiserte rørledningen for å samkjøre fliser på hver z -stabel, for hele volumet; Juster flerlags mosaikk kombinerer de to foregående alternativene. Denne operasjonen er tidkrevende og underlagt maskinens RAM (Random-Access Memory). Vurder å bruke en avansert datamaskin og la den kjøre i timer/dager, avhengig av størrelsen på stakken.</li>
		<li>Endelig eksportere bildet stabler og lagre dem ved hjelp av musen Høyreklikk &Gt; lag flatt bilde, og deretter sørge for å velge den første til det siste bildet i drop-down menyer Start og slutt.</li>
		<li>Bruke TrakEM2 innebygde funksjoner, segment strukturer av interesse om nødvendig.<ol>
<li>I TrakEM2's GUI, høyreklikk på alt under mal-vinduet og velg Legg til nytt barn &Gt; Area_list.</li>
			<li>Hemsko og miste alt på toppen av folderen under prosjekt emner, og ettall alt ville komme der.</li>
			<li>Dra og slipp områdelisten fra malen til alt som er plassert under prosjekt objekter.</li>
			<li>På bildet stabelen viewport, velger Z Space med markøren. Områdelisten vises med et unikt ID-nummer. Velg pensel verktøyet øverst (nederst til høyre), og Bruk musen til å segmentere en struktur ved å fylle stoffer over hele z -stakken.</li>
			<li>Eksportere segmentert masken som skal brukes i ilastik som frø for carving ved å høyreklikke enten på området liste objekt på Z Space listen, eller på masken i viewport, og velg Eksporter > områdelister som etiketter (TIF).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Avhengig av oppløsningen som trengs for ytterligere rekonstruksjoner, hvis mulig, Reduser pikselstørrelsen på bildes takken ved samplingsreduksjon, med tanke på Minnekravene til programvaren som skal brukes til segmentering og gjenoppbygging. Bruk bilde &Gt; juster &Gt; størrelse. Merk: ilastik håndterer stabler av opptil 500 piksler på XY godt. I tillegg vil samplingsreduksjon redusere oppløsningen til stakken. Derfor ta hensyn til minimumsstørrelsen der objektet fortsatt vises gjenkjennelig, og dermed kan segmentert.</li>
	<li>For å forbedre kontrasten og hjelpe til med segmentering, kan Uskarp maske -filteret brukes til å gjøre membraner skarpere. Bruk prosess &Gt; Filter &Gt; Uskarp maske.</li>
	<li>Eksporter bildet stabelen som enkeltbilder for videre behandling i segmentering programvare, (f. eks ilastik), ved hjelp av fil &Gt; lagre som... > Bildesekvens og velg TIF-format.</li>
</ol>2. segmentering (semi-automatisert) og rekonstruksjon bruke ilastik 1.3.2
<ol><li>I hoved ilastik GUI, velg carving modulen.</li>
	<li>Last inn bildes takken ved hjelp av Legg til ny &Gt; Legg til en enkelt 3D/4d-volum fra sekvensen.</li>
	<li>Velg hele katalogen og velg mappen som inneholder bildet stabelen lagret som enkeltfiler. På bunnen av det nye vinduet, der alternativer for lasting av bildene er til stede, sørg for å holde Z Selected.</li>
	<li>For følgende trinn, alle operasjoner og knapper kan bli funnet på venstre side av de viktigste programvaren GUI. I kategorien forhåndsbehandling bruker du standard alternativene som allerede er merket. Bruk lyse linjer (Ridge filtre) og holde filteret skalaen på 1,600. Denne parameteren kan endres etterpå.</li>
	<li>Når forhåndsbehandlingen er fullført, velger du den neste siden i rullegardinmenyen for etikett modulen. Et objekt og én bakgrunn finnes som standard.</li>
	<li>
Velg objekt frø ved å klikke på den, og tegne en linje på toppen av strukturen av interesse; deretter velger du bakgrunns frøet og tegner en eller flere linjer utenfor objektet som skal rekonstruert. Deretter klikker du på segment og venter. Merk: avhengig av kraften til datamaskinen og størrelsen på stabelen, kan segmentering ta fra noen sekunder til timer. Når det er gjort, en delvis gjennomsiktig maske fremheve segmentering skal vises på toppen av segmentert struktur.<ol>
<li>Bla gjennom stabelen for å se på segmentering. Den segmentering kan ikke være nøyaktig og ikke følge strukturen av interesse nøyaktig eller smitte ut fra den. Korrigere eventuelle smitteeffekter ved å plassere en bakgrunn seedet på sølt segmentering, og legge til et objekt frø over nonreconstructed segmentet av objektet av interesse.</li>
		<li>Hvis segmentering er fortsatt ikke riktig, kan du prøve å endre med bias parameter, som vil øke eller redusere mengden usikre klassifiserte piksler som akseptert. Verdien er 0,95 som standard. redusere det å begrense eventuelle smitteeffekter (vanligvis til ikke mindre enn 0,9) eller øke hvis segmentering er for konservative (opp til 1).</li>
		<li>En annen mulighet er å gå tilbake til trinn 2,4 (ved å klikke på forbehandling) og å endre størrelsen på filteret; øke verdien (for eksempel til 2) vil minimere salt-og-pepper støy-lignende effekter, men vil også gjøre membraner mer uskarpt og mindre detaljer vanskeligere å oppdage. Dette kan begrense smitteeffekter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gjenta så mye som nødvendig, så lenge alle ønskede objekter har blitt segmentert. En gang en gjenstand er ferdig, falle i staver opp på bevare aktuelle gjenstand, neden avsnitt. To nye frø vil vises, for å starte segmentering av et nytt objekt.</li>
	<li>Pakk overflaten maskene med en gang som. OBJ filer ved å klikke på Eksporter alle maskene.</li>
	<li>Hvis ytterligere korrekturlesing er nødvendig, kan segmentering trekkes ut som binære masker. Velg masken for å eksportere den ved å klikke Bla gjennom objekter; deretter høyreklikk på segmentering &Gt; Export , og deretter under Output File info, velg TIF sekvens som format.</li>
</ol>3. korrekturlesing/segmentering (manuell) i TrakEM2 (Fiji)
<ol><li>Belaste bildet stabel og opprette en ny TrekEM2 prosjekt idet per steg 1.6.1.</li>
	<li>Importer maskene som trenger korrektur ved hjelp av alternativet Importer etiketter som arealists, somer tilgjengelig i den samme import menyen som brukes til å importere bildes takken.</li>
	<li>Velg arealist som er importert i Z-området, og bruk pensel verktøyet til å gå gjennom segmentering.</li>
	<li>Visualiser modellen i 3D ved å høyreklikke områdelisten &Gt; Vis i 3D. I følgende vindu ber om et nytt nummer, en høyere verdi vil generere en lavere oppløsning mesh. Merk: Avhengig av størrelsen på objektet, bør du vurdere å bruke en verdi mellom 4 og 6, som vanligvis gir det beste kompromiss mellom oppløsning og morfologiske detaljer.</li>
	<li>Eksporter 3D mesh som Wavefront. OBJ ved å velge fra menyen fil &Gt; Eksporter overflater &Gt; Wavefront.</li>
</ol>4.3D analyse
<ol><li>Åpne blender. For følgende trinn, sørg for å installere NeuroMorph verktøykasse (tilgjengelig på tilgjengelig på https://neuromorph.epfl.ch/index.html) og glykogen analyseverktøy kasse (tilgjengelig på https://github.com/daniJb/glyco-analysis).
	<ol>
<li>Importer objektene ved hjelp av NeuroMorph satsvis import ved å klikke Importer objekter under scene -menyen for å importere flere objekter samtidig. Sørg for å aktivere Bruk remesh og jevn skyggelegging. Merk: Det anbefales ikke å klikke på Fullfør remesh hvis det er usikkerhet rundt objektets opprinnelige størrelse. Importer tre dybde i verdi 7 (standard) er vanligvis godt å opprettholde en akseptabel oppløsning og morfologi av objektet.</li>
		<li>Velg objektet av interesse fra outliner og endre octree dybden av remesh funksjonen under endrings meny iteratively å minimere antall hjørner og for å unngå å miste detaljer i oppløsning og riktig morfologi. Når skiftende det octree dybden, det maske på hovedavdeling GUI ville endre følgelig. Når ferdig, klikker du på Bruk for å fullføre prosessen. Merk: Verdier rundt 4 er vanligvis bra for små objekter (for eksempel postsynaptic tetthet), verdier rundt 7 for større (for eksempel lange axons eller dendrites), og verdier rundt 8 eller 9 for komplett mobil morfologier der detaljer om ulike oppløsninger bør Vedlikeholdt.</li>
		<li>Bruk bildet superimposition verktøyet bildet stabelen interaksjoner på venstre panel, under NeuroMorph menyen, for å laste bildet stabelen. Sørg for å angi den fysiske størrelsen på bildes takken for x, yog x (i mikron eller nanometer, avhengig av enhetene i mesh) og Velg banen til stabelen ved å klikke på Source_Z. X og Y er ortogonale fly; de er valgfrie og vil bli lastet inn bare hvis brukeren setter inn en gyldig bane.</li>
		<li>Så, velge en maske på viewport av rett-klikker opp på den, gå inn det redigere måte av trykker tab, velge ettall (eller flere) hjørnene benytter musen rett falle i staver, og til slutt, falle i staver opp på viser image for toppunktet. Ett (eller flere) skjære plan (er) med mikroskop vises oppå nettet.</li>
		<li>Velg skjæringsplanet ved å høyreklikke på den, trykk CTRL + Y, og bla over 3D-modellen ved hjelp av musen bla. Dette kan også brukes som korrekturlesing metode.</li>
		<li>Bruk måleverktøy for quantifications av overflateområder, volumer og lengder. Disse operasjonene er dokumentert i mer detaljer av Jørstad et al.19 og på NeuroMorph nettside24.</li>
		<li>Bruk glykogen analyseverktøy for kvantifisere glykogen nærhet mot pigger og boutons. Operasjoner er dokumentert i flere detaljer i en tidligere publikasjon10 og i glykogen analyse depotet25.</li>
	</ol></li>
	<li>Kjør GLAM23. Koden, kjørbar, og noen test filer er tilgjengelig i GLAM depotet26.
	<ol>
<li>Forbered to geometri filer i. Ply format: en kildefil som inneholder glykogen granulat og en målfil som inneholder morfologi overflater.</li>
		<li>Klargjør tre. ASCII fargekartet-filer (hver linje som inneholder t_norm (0.. 1) R (0.. 255) G (0.. 255) B (0.. 255)) for å representere lokale absorpsjons verdier, topp verdier og gjennomsnittlige absorpsjons verdier.</li>
		<li>Utfør C++ script GLAM, med geometri filer (trinn 4.2.1) og fargekartet filer (trinn 4.2.2), ved å sette innflytelse radius (i mikron), maksimal forventet absorpsjon verdi, og en normalisert terskel for klynger absorpsjonen toppene. Hvis du vil ha informasjon om andre parametere, kan du kjøre skriptet med-hjelp-alternativet.</li>
		<li>Eksportere resultatene som. Ply eller. OBJ filer: Target objekter farge-kartlagt med GLAM verdier, absorpsjon peak markører representert som fargekodede kuler, og målrette objekter fargekodet med hensyn til gjennomsnittlig absorpsjons verdien.</li>
	</ol></li>
	<li>Åpne VR data samhandle. VR data samhandle-kjørbar kode er tilgjengelig i et offentlig register27.
	<ol>
<li>Importer nett for å visualisere dette ved å følge instruksjonene i VR-menyen. Sørg for å importere OBJ-filer beregnet i trinn 4.2.1, i tilfelle en GLAM analyse er nødvendig.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLOS Biology. 2, e329 (2004).</li><li>Coggan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Process+for+Digitizing+and+Simulating+Biologically+Realistic+Oligocellular+Networks+Demonstrated+for+the+Neuro-Glio-Vascular+Ensemble.">A Process for Digitizing and Simulating Biologically Realistic Oligocellular Networks Demonstrated for the Neuro-Glio-Vascular Ensemble.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Profiles+of+Myelin+Distribution+Along+Single+Axons+of+Pyramidal+Neurons+in+the+Neocortex.">Distinct Profiles of Myelin Distribution Along Single Axons of Pyramidal Neurons in the Neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19, 816-825 (2016).</li><li>Kasthuri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saturated+Reconstruction+of+a+Volume+of+Neocortex.">Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex.</a> Cell. 162, 648-661 (2015).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+neuropil+structure+in+mouse+somatosensory+cortex&#8212;A+3D+electron+microscopy+analysis+of+layer+1.">The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex&#8212;A 3D electron microscopy analysis of layer 1.</a> PLOS ONE. 13, e0198131 (2018).</li><li>Cal&#236;, C., Agus, M., Gagnon, N., Hadwiger, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Analysis+of+Glycogen+Derived+Lactate+Absorption+in+Dense+and+Sparse+Surface+Reconstructions+of+Rodent+Brain+Structures.">Visual Analysis of Glycogen Derived Lactate Absorption in Dense and Sparse Surface Reconstructions of Rodent Brain Structures.</a> , (2017).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+immersive+virtual+reality+for+studying+cellular+compartments+in+3D+models+from+EM+preparations+of+neural+tissues.">Three-dimensional immersive virtual reality for studying cellular compartments in 3D models from EM preparations of neural tissues.</a> Journal of Comparative Neurology. 524, 23-38 (2016).</li><li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruct:+a+free+editor+for+serial+section+microscopy.">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7, e38011 (2012).</li><li>Januszewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+automated+reconstruction+of+neurons+with+flood-filling+networks.">High-precision automated reconstruction of neurons with flood-filling networks.</a> Nature Methods. 1, (2018).</li><li>Shahbazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+Learning-Free+Segmentation+and+Reconstruction+of+Neural+Volumes.">Flexible Learning-Free Segmentation and Reconstruction of Neural Volumes.</a> Scientific Reports. 8, 14247 (2018).</li><li>Sommer, C., Straehle, C., K&#246;the, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ilastik:+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit.">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> , (2011).</li><li>Holst, G., Berg, S., Kare, K., Magistretti, P., Cal&#236;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+large+EM+stack+support.">Adding large EM stack support.</a> , (2016).</li><li>Beyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ConnectomeExplorer:+query-guided+visual+analysis+of+large+volumetric+neuroscience+data.">ConnectomeExplorer: query-guided visual analysis of large volumetric neuroscience data.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 19, 2868-2877 (2013).</li><li>Beyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culling+for+Extreme-Scale+Segmentation+Volumes:+A+Hybrid+Deterministic+and+Probabilistic+Approach.">Culling for Extreme-Scale Segmentation Volumes: A Hybrid Deterministic and Probabilistic Approach.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer. , (2018).</li><li>Jorstad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroMorph:+A+Toolset+for+the+Morphometric+Analysis+and+Visualization+of+3D+Models+Derived+from+Electron+Microscopy+Image+Stacks.">NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks.</a> Neuroinformatics. 13, 83-92 (2015).</li><li>Jorstad, A., Blanc, J., Knott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroMorph:+A+Software+Toolset+for+3D+Analysis+of+Neurite+Morphology+and+Connectivity.">NeuroMorph: A Software Toolset for 3D Analysis of Neurite Morphology and Connectivity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 59 (2018).</li><li>Cal&#236;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+anatomy+in+the+times+of+connectomics.">Astroglial anatomy in the times of connectomics.</a> Journal of Translational Neuroscience. 2, 31-40 (2017).</li><li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abstractocyte:+A+Visual+Tool+for+Exploring+Nanoscale+Astroglial+Cells.">Abstractocyte: A Visual Tool for Exploring Nanoscale Astroglial Cells.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. , (2017).</li><li>Agus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLAM:+Glycogen-derived+Lactate+Absorption+Map+for+visual+analysis+of+dense+and+sparse+surface+reconstructions+of+rodent+brain+structures+on+desktop+systems+and+virtual+environments.">GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments.</a> Computers &amp; Graphics. 74, 85-98 (2018).</li><li>&#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeuroMorph Analysis and Visualization Toolset. , (2018).</li><li>. GitHub - daniJb/glycol-analysis: Glycogen_analysis.py is a python-blender API based script that performs analysis on a reconstructed module of glycogen data Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/daniJb/glyco-analysis">https://github.com/daniJb/glyco-analysis</a> (2018)</li><li>. GitHub &#8211; magus74/GLAM: Glycogen Lactate Absorption Model Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/magus74/GLAM">https://github.com/magus74/GLAM</a> (2019)</li><li>Agus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLAM:+Glycogen-derived+Lactate+Absorption+Map+for+visual+analysis+of+dense+and+sparse+surface+reconstructions+of+rodent+brain+structures+on+desktop+systems+and+virtual+environments.">GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments.</a> Dryad Digital Repository. , (2018).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from:+The+effects+of+aging+on+neuropil+structure+in+mouse+somatosensory+cortex&#8212;A+3D+electron+microscopy+analysis+of+layer+1.">Data from: The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex&#8212;A 3D electron microscopy analysis of layer 1.</a> Dryad Digital Repository. , (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Metoden som presenteres her er en nyttig steg-for-steg guide for segmentering og 3D rekonstruksjon av en multiscale EM datasett, enten de kommer fra høyoppløselig Imaging teknikker, som liten LØGN-SEM, eller andre automatiserte seriell snitting og Imaging teknikker. Liten LØGN-SEM har fordelen av potensielt nå perfekt isotropisk i Voxel størrelse ved å kutte seksjoner så tynne som 5 NM ved hjelp av en fokusert ion strålen, dens FOV kan være begrenset til 15-20 μm grunn av side gjenstander, som er muligens på grunn av deponering av kuttet vev hvis FO V overskrider denne verdien. Slike gjenstander kan unngås ved hjelp av andre teknikker, for eksempel SBEM, som bruker en diamant kniv til å kutte serielle seksjoner inne i mikroskopet kammeret. I dette sistnevnte tilfellet kan z -oppløsningen være rundt 20 NM i beste fall (vanligvis, 50 NM), men FOV kan være større, selv om piksel oppløsningen bør forringes for et stort område av interesse. En løsning for å overvinne slike begrensninger (forstørrelse g. FOV) er å dele regionen av interesse i fliser og erverve hver av dem på en høyere oppløsning. Vi har vist her resultater fra både en SBEM stack-datasett (i) i representative resultater-og en liten LØGN-SEM stabel-datasett (II) i representative resultater.
Ettersom generering av større og større datasett blir stadig mer vanlig, er arbeidet med å lage verktøy for piksel klassifisering og automatisert bilde segmentering multiplisere; Likevel, hittil har ingen programvare bevist pålitelighet sammenlignes med menneskets korrekturlesing, som derfor fortsatt er nødvendig, uansett hvor tidkrevende det er. Generelt kan mindre datasett som kan Nedsamples, for eksempel når det gjelder datasett (II), bli tett rekonstruert av en enkelt Ekspertbruker i en uke, inkludert korrekturlesing tid.
Protokollen som presenteres her innebærer bruk av tre programmer spesielt: Fiji (versjon 2.0.0-RC-65/1.65 b), ilastik (versjon 1.3.2 RC2), og blender (2,79), som alle er åpen kildekode og multi-plattform programmer og nedlastbare gratis. Fiji er en utgivelse av ImageJ, drevet av plugins for biologiske bildeanalyse. Den har en robust programvarearkitektur og foreslås som det er en felles plattform for livet forskere og inkluderer TrakEM2, en av de første og mest brukte plugins for bilde segmentering. Et problem som oppleves av mange brukere i det siste er overgangen fra Java 6 til Java 8, som skaper kompatibilitetsproblemer; Derfor foreslår vi avstå fra å oppdatere til Java 8, hvis mulig, for å tillate Fiji å fungere skikkelig. ilastik er en kraftfull programvare som gir en rekke rammeverk for Pixel klassifisering, hver og en dokumentert og forklart på deres hjemmeside. Den carving modul som brukes for semi-automatisert segmentering av EM stabler er praktisk som det sparer mye tid, slik at forskerne å redusere tiden brukt på manuelt arbeid fra måneder til dager for en erfaren bruker, som med et enkelt klikk en hel neurite kan være segmentert i sekunder. Den forbehandling trinnet er svært intens fra en hardware synspunkt, og svært store datasett, som SBEM stabelen presenteres her, som var 26 GB, krever særegne strategier for å passe inn i minnet, med tanke på at man skulle erverve store datasett fordi kan ikke kompromittere synsfelt og oppløsning. Det kan derfor hende at samplingsreduksjon ikke er en hensiktsmessig løsning i dette tilfellet. Den nyeste versjonen av programvaren kan gjøre forbehandling i et par timer med en kraftig Linux arbeidsstasjon, men segmentering ville ta minutter, og bla gjennom stabelen vil fortsatt være relativt treg. Vi bruker fortsatt denne metoden for en første, grov segmentering, og korrekturlese den ved hjelp TrakEM2. Endelig er blender en 3D-modellering programvare, med en kraftig 3D rendering motoren, som kan tilpasses med Python skript som kan bygges inn i hoved GUI som add-ons, slik som NeuroMorph og glykogen analyse. Fleksibiliteten av denne programvare kommer med det ulempen det, inne kontrasten å Fiji, for eksempel, det er ikke beregnet på det online visualisering av stor datasett; Derfor kan visualisering og navigering gjennom store nett (overstiger 1 GB) være treg og ikke effektiv. På grunn av dette, er det alltid tilrådelig å velge teknikker som reduserer mesh kompleksitet, men er forsiktig med å forstyrre den opprinnelige morfologi av strukturen av interesse. Det remesh funksjonen kommer inne hendig og er en lagt ned i ansiktstrekk av det NeuroMorph bakst import verktøyet. Et problem med denne funksjonen er at, avhengig av antall hjørner av det opprinnelige mesh, octree dybde verdi, som er relatert til den endelige oppløsningen, bør endres tilsvarende. Små gjenstander kan være remeshed med en liten octree dybde (f. eks 4), men den samme verdien kan forstyrre morfologi av større objekter, som trenger større verdier (6 i beste fall, til 8 eller 9 for en veldig stor mesh, for eksempel en full celle). Det er tilrådelig å gjøre denne prosessen gjentakende og teste de ulike octree dybder Hvis størrelsen på objektet er ikke klart.
Som nevnt tidligere, et aspekt som bør tas i betraktning er beregningsorientert kraft til å være dedikert til gjenoppbygging og analyse, knyttet til programvaren som brukes. Alle operasjonene vist i representative resultatene av dette manuskriptet ble innhentet ved hjelp av en Mac Pro, utstyrt med en AMD FirePro D500 grafikkort, 64 GB RAM, og en Intel Xeon E5 CPU med 8 kjerner. Fiji har en god programvarearkitektur for håndtering av store datasett. Derfor anbefales det å bruke en bærbar datamaskin med en god maskinvareytelse, for eksempel en MacBook Pro med en Intel i7-prosessor på 2,5 GHz og 16 GB RAM. ilastik programvare er mer krevende når det gjelder maskinvareressurser, spesielt under forbehandling trinn. Selv om reduksjon av bildes takken er et godt knep for å begrense maskinvare forespørslene fra programvaren, og lar brukeren behandle en stabel med en bærbar datamaskin (vanligvis hvis den er under 500 piksler i x,y,z), foreslår vi at du bruker en high-end datamaskinen til å kjøre denne programvaren jevnt. Vi bruker en arbeidsstasjon utstyrt med en Intel Xeon Gold 6150 CPU med 16 kjerner og 500 GB RAM.
Når det følger med en nøyaktig 3D-rekonstruksjon, kan forskerne forkaste de opprinnelige micrographs og arbeide direkte på 3D-modellene for å trekke ut nyttige morphometric data for å sammenligne celler av samme type, i tillegg til ulike typer celler, og dra nytte av VR for kvalitative og kvantitative vurderinger av morfologier. Spesielt har bruken av sistnevnte vist seg å være fordelaktig når det gjelder analyser av tette eller komplekse morfologier som presenterer visuell okklusjon (dvs. blokkering av visning av et objekt av interesse i 3D-rommet med en andre en plassert mellom observatøren og Fi første objekt), noe som gjør det vanskelig å representere og analysere dem i 3D. I eksempelet som ble presentert, tok en erfaren bruker ca 4 påfølgende timer for å observere datasettene og telle objektene. Tiden som brukes på VR-analyser kan variere ettersom aspekter som VR sykdom (som til en viss grad kan være relatert til bilsyke) kan ha en negativ innvirkning på brukeropplevelsen; i dette tilfellet kan brukeren foretrekke andre analyseverktøy og begrense tiden som er dedikert til VR.
Til slutt, alle disse trinnene kan brukes på andre mikroskopi og ikke-EM teknikker som genererer bilde stabler. EM genererer bilder som generelt er utfordrende å håndtere og segmentere, sammenlignet med for eksempel fluorescens mikroskopi, der noe kan sammenlignes med en binær maske (signal kontra en svart bakgrunn), som i prinsippet kan lett gjengis i 3D for videre behandling, må ofte håndteres.

Den første foreslåtte modellen for et elektron mikroskopi oppsett slik at automatiserte serielle delen og Imaging dateres tilbake til 19811; spredningen av slike automatiserte, forbedret oppsett til bilde store prøver å bruke EM økt i de siste ti årene2,3, og arbeider utstillingsvindu imponerende tette rekonstruksjoner eller full morfologier umiddelbart fulgt4, 5,6,7,8,9,10.
Produksjonen av store datasett kom med behovet for forbedrede rørledninger for bilde segmentering. Programvareverktøy for manuell segmentering av serielleseksjoner, sliksom rekonstruereog TrakEM2,ble utformet for overføring av elektron mikroskopi (TEM). Som hele prosessen kan være svært tidkrevende, disse verktøyene er ikke hensiktsmessig når du arbeider med tusenvis av serielle micrographs som kan automatisk generert med State-of-the-art, automatiserte EM seriell del teknikker (3DEM), for eksempel blokk-ansikt skanning elektron mikroskopi (SBEM)3 eller fokusert ion Beam-Scanning elektron MIKROSKOPI (LØGN-SEM)2. Av denne grunn, forskere legger innsats i å utvikle semi-automatiserte verktøy, samt helautomatisk verktøy, for å forbedre segmentering effektivitet. Helautomatisk verktøy, basert på maskinlæring13 eller State-of-the-art, uerfarne pixel klassifisering algoritmer14, blir forbedret for å brukes av et større fellesskap; Likevel er segmentering fortsatt langt fra å være fullt pålitelig, og mange arbeider er fortsatt basert på manuell arbeidskraft, som er ineffektiv i forhold til segmentering tid, men likevel gir fullstendig pålitelighet. Semi-automatiserte verktøy, for eksempel ilastik15, representerer et bedre kompromiss, som de gir en umiddelbar avlesning for segmentering som kan korrigeres til en viss grad, selv om det ikke gir en reell korrekturlesing rammeverk, og kan integreres ved hjelp av TrakEM2 i parallell16.
Stor skala segmentering er hittil, for det meste begrenset til connectomics; Derfor er dataforskere mest interessert i å tilby rammeverk for integrerte visualiseringer av store, kommenterte datasett og analysere tilkoblings mønstre utledes av tilstedeværelsen av Synaptic kontakter17,18. Likevel kan nøyaktige 3D-rekonstruksjoner brukes til kvantitative morphometric analyser, i stedet for kvalitative vurderinger av 3D-strukturene. Verktøy som NeuroMorph19,20 og glykogen analyse10 er utviklet for å ta målinger på 3D-rekonstruksjoner for lengder, overflateområder og volumer, og på fordelingen av Sky poeng, helt forkaster den opprinnelige EM-stakken8,10. Astrocytter representerer en interessant case-studie, fordi mangelen på visuelle ledetråder eller repeterende strukturelle mønstre gi etterforskere et hint om funksjonen til individuelle strukturelle enheter og påfølgende mangel på en adekvat ontologi av astrocytic prosesser 21, gjør det utfordrende å designe analytiske verktøy. Et siste forsøk var Abstractocyte22, som tillater en visuell utforskning av astrocytic prosesser og den slutning av kvalitative relasjoner mellom astrocytic prosesser og neurites.
Likevel, bekvemmeligheten av tenkelig delt vev under EM kommer fra det faktum at mengden av informasjon gjemt i intakt hjerne prøver er enorm og tolke enkelt del bilder kan overvinne dette problemet. Tettheten av strukturer i hjernen er så høy at 3D rekonstruksjoner av enda noen objekter synlig på en gang ville gjøre det umulig å skille dem visuelt. Av denne grunn har vi nylig foreslått bruk av Virtual Reality (VR) som en forbedret metode for å observere komplekse strukturer. Vi fokuserer på astrocytter23 for å overvinne okklusjon (som er blokkering av synligheten av et objekt av interesse med en andre, i et 3D-rom) og lette kvalitative vurderinger av rekonstruksjoner, inkludert korrekturlesing, samt quantifications av funksjoner ved hjelp av antall poeng i rommet. Vi kombinerte nylig VR visuell utforskning med bruk av GLAM (glykogen-avledet melkesyre absorpsjons modell), en teknikk for å visualisere et kart over neurites av melkesyre shuttle, ved å vurdere glykogen granulat som lys-Emitting organer23; spesielt brukte vi VR til å kvantifisere de lyse toppene produsert av GLAM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>2.0.0-rc-65/1.65b</td>
			<td>Open Source image processing editor 
			www.fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLastik</td>
			<td>Open Source&#160;</td>
			<td>1.3.2 rc2</td>
			<td>Image Segmentation tool 
			www.ilastik.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Blender Foundation</td>
			<td>2.79</td>
			<td>Open Source 3D Modeling software 
			www.blender.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Vive Headset</td>
			<td>HTC</td>
			<td>Vive / Vive Pro</td>
			<td>Virtual Reality (VR) Head monted headset 
			www.vive.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromorph</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of Blender Addons for 3D Analysis 
			neuromorph.epfl.ch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen Analysis</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>Blender addon for analysis of Glycogen 
			https://github.com/daniJb/glyco-analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAM</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>C++ Code For generating GLAM Maps 
			https://github.com/magus74/GLAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for 3d reconstruction and virtual reality analysis of glial and neuronal cells

Serial snitting og påfølgende Høyoppløselig bilde av biologisk vev ved hjelp av elektron mikroskopi (EM) tillater segmentering og rekonstruksjon av høyoppløselig avbildet stabler å avdekke ultrastructural mønstre som ikke kunne løses ved hjelp av 2D Bilder. Faktisk kan sistnevnte føre til en feil tolkning av morfologier, som i tilfelle av mitokondrier; Bruk av 3D-modeller er derfor mer og mer vanlig og brukt på formuleringen av morfologi-baserte funksjonelle hypoteser. Til dags dato gjør bruk av 3D-modeller generert fra lys eller elektron bilde stabler kvalitative, visuelle vurderinger, så vel som kvantifisering, mer praktisk å bli utført direkte i 3D. Ettersom disse modellene er ofte svært komplekse, er en virtuell virkelighet miljø også viktig å være satt opp til å overvinne okklusjon og å dra full nytte av 3D-strukturen. Her er en steg-for-steg guide fra bilde segmentering til rekonstruksjon og analyse er beskrevet i detalj.

Ved å bruke prosedyren presentert ovenfor, viser vi resultater på to bilde stabler av forskjellige størrelser, for å demonstrere hvordan fleksibiliteten til verktøyene gjør det mulig å skalere opp prosedyren til større datasett. I dette tilfellet er de to 3DEM datasettene (i) P14 rotte, somatosensory cortex, Layer VI, 100 μm x 100 μm x 76,4 μm4 og (II) P60 rotte, hippocampus CA1, 7,07 μm x 6,75 μm x 4,73 μm10.
Forbehandling trinn (figur 1) kan utføres på samme måte for begge datasettene, bare tar hensyn til at et større datasett som den første stakken, som er 25 GB, krever mer utfører maskinvare for å håndtere store data visualisering og prosessering . Den andre stabelen er bare 1 GB, med en perfekt isotropic Voxel størrelse.
Det kan hende at størrelsen på dataene ikke er direkte relatert til synsfeltet (FOV), i stedet for oppløsningen til selve stakken, som avhenger av den maksimale pikselstørrelsen til sensoren i mikroskopet og forstørrelsen av stakken. I alle fall, logisk, større FOVs er sannsynlig å oppta mer fysisk plass sammenlignet med mindre FOVs, hvis ervervet i samme oppløsning.
Når bildet stabelen er importert, som angitt i del 1 av protokollen, i Fiji programvare (figur 1a), en vitenskapelig utgivelse av ImageJ12, er et viktig poeng å sørge for at bildeformatet er 8-bit (figur 1B). Dette fordi mange oppkjøpet programvare ulike mikroskopi selskaper produsenter generere sine proprietære filformat i 16-bit for å lagre metadata relevant for informasjon om å anskaffe prosessen (dvs. pikselstørrelse, tykkelse, strøm/spenning av elektronstråle, kammer trykk) sammen med bildes takken. Slike justeringer tillate forskere å spare minne, som ekstra 8-bit som inneholder metadata påvirker ikke bildene. Den andre viktige parameteren for å sjekke er Voxel størrelse, som deretter tillater gjenoppbygging etter segmentering som skal utføres på riktig skala (mikrometer eller nanometer; Figur 1B).
Stabler kan trenge omstilling og/eller søm hvis de har blitt anskaffet ved hjelp av flislegging; disse operasjonene kan utføres innenfor TrakEM2 (figur 2a), selv om omstilling, automatiserte 3DEM teknikker som liten LØGN-SEM eller 3View er vanligvis godt realigned.
Et siste trinn krever filtrering og, muligens, samplingsreduksjon av stakken, avhengig av hvilke objekter som må bli rekonstruert og om reduksjon av oppløsning påvirker gjenkjenningen av de reconstructable funksjonene. For eksempel, for større stabel (av somatosensory cortex på P14 rotter), var det ikke mulig å kompromittere oppløsningen til fordel for gjenoppbygging effektivitet, mens for mindre stabel (av hippocampus CA1 av P60 rotter), var det mulig å gjøre det fordi resolusjonen var langt over det som var nødvendig for at de minste gjenstandene skulle bli rekonstruert. Til slutt øker bruken av Uskarp maske forskjellen mellom membraner og bakgrunnen, noe som gjør det gunstig for rekonstruksjoner av programvare som ilastik som bruker graderinger til pre-evaluere grenser.
Etter bildebehandlingen kan rekonstruksjon utføres enten manuelt ved hjelp av TrakEM2, eller semi-automatisk ved hjelp av ilastik (figur 2C). Et datasett som den minste som er oppført her (II), som kan være Nedsamples å passe inn i minnet, kan være fullt segmentert ved hjelp av ilastik (figur 2b) for å produsere en tett rekonstruksjon. Når det gjelder det første datasettet som er oppført her (i), har vi klart å laste inn og forhåndsbehandle hele datasettet med en Linux-arbeidsstasjon med 500 GB RAM. Den spredte segmentering av 16 fulle morfologier ble innhentet med en hybrid rørledning, ved å trekke ut grov segmentering som ble manuelt korrekturlese bruker TrakEM2.
3D-analyse av funksjoner som overflateområder, volumer, eller fordelingen av intracellulære glykogen kan utføres i en blender miljø (Figur 3) ved hjelp av egendefinerte koder, for eksempel NeuroMorph19 eller glykogen analyse10.
I tilfelle datasett som inneholder glykogen granulater også, analyse på distribusjonen deres kan utledes ved hjelp av GLAM, en c + + kode som vil generere colormaps med innflytelse området direkte på mesh.
Til slutt kan slike komplekse datasett bli vist og analysert ved hjelp av VR, som er bevist å være nyttig for analyse av datasett med en bestemt okkludert visning (Figur 4). For eksempel, topper utledes fra GLAM kart ble lett utledes visuelt fra dendrites i det andre datasettet diskutert her.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig1.jpg"> Figur 1: bildebehandling og forberedelse til bilde segmentering. (a) Main Fiji GUI. (b) eksempel på stablede bilder fra datasett (i) som diskuteres i representative resultater. Panelet til høyre viser egenskaper som tillater brukeren å angi Voxel størrelse. (c) eksempel på en filer og endre størrelsen på operasjonen som brukes på et enkelt bilde. Panelene til høyre viser forstørrelser fra midten av bildet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig2.jpg"> Figur 2: segmentering og gjenoppbygging ved hjelp av TrakEM2 og ilastik. (a) TrakEM2 GUI med objekter manuelt segmentert (i rødt). (b) den eksporterte masken fra panel a kan brukes som inn data (frø) for (c) semi-automatisert segmentering (utskjæring). Fra ilastik kan masker (rød) eksporteres videre til TrakEM2 for manuell korrekturlesing. (d) masker kan deretter eksporteres som 3D trekantede maskene å avdekke rekonstruert strukturer. I dette eksempelet ble fire neurons, astrocytter, mikroglia og pericytes fra datasett (i) (omtalt i representative resultater) rekonstruert ved hjelp av denne prosessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig3.jpg"> Figur 3: 3D-analyse av rekonstruert morfologier ved hjelp av tilpassede verktøy. (a) ISOTROPIC avbildet volum fra løgn-SEM datasett (II) (som diskutert i representative resultater). (b) tett rekonstruksjon fra panel a. Grå = axons; grønn = astrocytic prosess; blå = dendrites. (c) mikroskop viser eksempler på mål for quantifications som synapser (datasett (i)) og astrocytic glykogen granulat (datasett (II)) i riktig forstørrelser. (d) maske fra panel c viser fordelingen av glykogen granulat rundt synapser. (e) kvantifisering av glykogen distribusjon fra datasettet fra panel c, ved hjelp av glykogen analyseverktøy kasse fra blender. Feilfeltene angir standard feil. N = 4 145 glykogen granulat. (f) en grafisk illustrasjon av input og output VISUALISERING av glam. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig4.jpg"> Figur 4: analyse i vr. (a) en bruker på seg en vr headset mens du arbeider på (b) den tette REKONSTRUKSJON fra løgn-SEM datasett (II) (som diskutert i representative resultater). (c) engasjerende vr-scene fra et delsett av neurites fra panel b. Den grønne laseren peker mot en GLAM topp. (d) eksempel på en analyse fra glam peak teller i vr. N = 3 mus per linje. Analyse av LØGN-SEM fra en tidligere publikasjon28. Feilfeltene angir standard feilene. *p < 0,1, enveis Anova. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells at JoVE.com

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Den beskrevne rørledningen er utformet for segmentering av elektron mikroskopi datasett som er større enn gigabyte, for å trekke ut hele celle morfologier. Når cellene er rekonstruert i 3D, tilpasset programvare designet rundt individuelle behov kan brukes til å utføre en kvalitativ og kvantitativ analyse direkte i 3D, også ved hjelp av virtuell virkelighet å overvinne vise okklusjon.

En metode for 3D rekonstruksjon og Virtual Reality analyse av gliacellene og neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Den automatiserte seriell seksjon elektron mikroskopi teknikker. Hastighetsbegrensende trinn i rørledningen som fører til generering av biologiske tredimensjonale modeller bildebehandling. Vår protokoll gir en trinnvis retningslinje for å produsere en tyngre konstruksjon av bildevolumer på bare noen få dager.Kombinert med en tilnærming til kvantitative målinger ved hjelp av tredimensjonale modeller. Med denne teknikken kan 3D-strukturen av vev, annet enn hjernen, potensielt analyseres for å identifisere strukturelle funksjonsnedsettering som er typiske for visse sykdommer og for å forbedre diagnostisk strategi. Segmentering er et kjedelig skritt.Ta deg tid til å gjøre det så nøyaktig som mulig for å unngå korrekturlesing av en dårlig segmentering og måtte starte hele prosessen på nytt. Utformingen av programvaren noen ganger ikke veldig brukervennlig. Derfor er det viktig å se startarbeidet med segmenteringen.Åpne bildestakken ved å dra og slippe den opprinnelige filen fra mikroskopet som inneholder bunken, eller kjøp dra og slippe mappen som inneholder hele bildestakken inn i programvarevinduet Når stakken er åpnet, gå til bilde, egenskaper, for å sikre at voxels-størrelsen er lest fra metadataene. Forvandle bildet til 8-biters ved å klikke på bilde, skriv inn og velg 8-biters. Hvis den opprinnelige bunken er anskaffet som forskjellige fliser, påfør søm i TrakEM2.Opprett et nytt TrakEM2-prosjekt ved hjelp av Ny, TrakEM2 Bruke TrakEM2 innebygde funksjoner segmentstrukturer av interesse ved behov. I TrakEM2's gooey høyreklikker du'på noe'under malvinduet, og velg legg til ny underordnet områdeliste'Dra og slipp alt'i mappen, under prosjektobjekter', og en noe'ville vises der. Dra og slipp, områdelisten'fra malen til alt som er plassert under prosjektobjektene'På bildestakkvisningsporten velger du Z-space'med markøren.Områdelisten vises med det unike ID-nummeret. Velg penselverktøyet øverst, og bruk musen til å segmentere en struktur ved å fylle cytosolen over hele Z-stakken. Eksporter segmentert masse, som skal brukes i Ilastik som frø for carving.Hvis du vil gjøre dette, høyreklikker du enten på områdelisteobjektet på Z-plass-listen eller på masken i visningsporten, og velger export'area list'som etiketter T-I-F. Avhengig av oppløsningen som trengs for ytterligere rekonstruksjoner, kan du redusere pikselstørrelsen på bildestakken ved å prøve ned. Vurder minnekravene til programvaren som skal brukes til segmentering og rekonstruksjon.Ilastik håndterer stabler på opptil fem hundre piksler på X-Y. Ta hensyn til, minimumsstørrelsen som objektene fortsatt ser gjenkjennelig og dermed kan segmenteres. Bruk bilde'juster størrelse'For å forbedre kontrasten og hjelpe segmenteringen, kan det uskarpe maskefilteret brukes for å gjøre membranene skarpere.Bruk process'filters'unsharp mass'Export the image stack as single images'for videre behandling i segmenteringsprogramvare, ved hjelp av file'save as'image sequence'og velg TIFF'format. I hoved-Ilastik gooey velger du carving'modulen. Last inn bildestakken, ved hjelp av legg til nye'og legg til et enkelt 3D / 4D-volum fra sekvens'Velg hele katalogen'og velg mappen som inneholder bildestakken lagret som enkeltfiler'Nederst i det nye vinduet, hvor alternativer for lasting av bildene er til stede, sørg for å holde Z"valgt.For følgende trinn finner du alle operasjoner og knapper på venstre side av hovedprogramvaren gooey. Bruk standardalternativene som allerede er merket under kategorien forhåndsbehandling. Bruk rike linjers filtre og hold filterskalaen på 1.600.Denne omkretsen kan endres etterpå. Når forhåndsbehandlingen er fullført, velger du neste side i rullegardinmenyen i merkemodulen. Ett objekt og én bakgrunn finnes som standard.Velg objektfrøet ved å klikke på det og tegne en linje på toppen av strukturen av interesse. Deretter velger du bakgrunnsfrøet og tegner én eller flere linjer utenfor objektet som skal rekonstrueres. Nå klikker du på segmentet'og venter.Avhengig av kraften i datamaskinen, og størrelsen på stabelen, kan segmentering ta fra noen få sekunder til timer. Når den er ferdig, skal en halvgjennomsiktig maske som fremhever segmenteringen, vises på toppen av den segmenterte strukturen. Bla gjennom stakken for å kontrollere segmenteringen.Segmenteringen, kan ikke være nøyaktig hvis den ikke følger strukturen av interesse eller søl ut fra den. Korriger eventuelle søl over ved å plassere et bakgrunnsfrø på sølt segmentering. Og legg til et objektfrø over det ikke-rekonstruerte segmentet av gjenstanden av interesse.Nøyaktig visuell korrekturlesing av segmenteringen med Ilastik kan være kjedelig, men det er viktig å sørge for at de eksporterte objektene ikke inneholder artefakter. Hvis segmenteringen fortsatt ikke er riktig, kan du prøve å endre med bias-parameteren som vil øke eller redusere mengden usikre klassifiserte piksler som godtas. Verdien er 0,95 som standard.Reduser den for å begrense eventuelle oversvømmelser eller øke hvis segmenteringen er for konservativ. En annen mulighet er å klikke på forhåndsbehandling'og å endre størrelsen på filteret. Å øke verdien vil minimere salt- og pepperstøylignende effekter, men vil også gjøre membranene mer uskarpe og mindre detaljer vanskeligere å oppdage.Dette kan begrense søl. Gjenta så mye som nødvendig så lenge alle ønskede objekter har blitt segmentert. Når et objekt er ferdig, navigerer du til segmentet og klikker på lagre gjeldende objekt'To nye frø ser ut til å starte segmenteringen av et nytt objekt.Abstrakt overflate måler med en gang som O-B-J filer ved å klikke på eksport alle meshes'Å visualisere manuelt segmenterte modeller i 3D i TrakEM2, høyreklikk områdeliste, og velg deretter vis i 3D'A høyere verdi vil generere en lavere oppløsning mesh. Til slutt eksporterer du 3D-nettet som WaveFront O-B-J'ved å velge fra menyfilen'eksportoverflater'WaveFront'Etter å ha installert neuro morph verktøysettet som beskrevet i tekstprotokollen, åpne blender. Importer objektene ved hjelp av den satsvise importen av nevromorf ved å klikke importobjekter under scenemenyen for å importere flere objekter samtidig.Pass på å aktivere, bruk re-mesh og glatt skyggelegging. Velg objektet av interesse fra out-liner og endre Octree Dybde av re-mesh-funksjonen under spesialmenyen. Arbeid iterativt for å minimere antall toppunkt og for å unngå å miste detaljer i oppløsning og riktig morfologi.Når du endrer Octree Depth, vil nettet på hovedgatene endres tilsvarende. Når du er ferdig, klikk på gjelder for å fullføre prosessen. Naviger til neuro morph menyen på venstre panel og bruke bildet superimposition verktøy bilde stabel interaksjoner for å laste bildestakken.Pass på å angi den fysiske størrelsen på bildestakken for X, Y og Z og velg banen til stakken ved å klikke på kilde Z.X og Y er ortogonale plan. De er valgfrie og lastes bare inn hvis brukeren setter inn den gyldige banen. Velg deretter et nett på visningsporten ved å høyreklikke på den.Gå inn i redigeringsmodus ved å trykke på fanen, velg ett eller flere toppunkt ved hjelp av muse høyreklikk og til slutt klikker du på vis bilde på toppunktet. Ett eller flere kuttede fly med mikrografen vil vises lagt over nettet. Velg det kuttede flyet ved å høyreklikke på den.Trykk deretter på kontroll Y og bla over 3D-modellen ved hjelp av muserulle. Dette kan også brukes som korrekturlesingsmetode. Vist her er segmentering og rekonstruksjon ved hjelp av TrakEM2 og Ilastik.TrakEM2 gooey vises med objekter manuelt segmentert i rødt. Den eksporterte masken kan deretter brukes som inndata for halvautomatisk segmentering. Fra Ilastik kan masker videre eksporteres til TrakEM2 for manuell korrekturlesing.Masker kan eksporteres som 3D trekantede masker for å avsløre rekonstruerte strukturer. I dette eksemplet ble fire nevroner, astrocytter, microglia og pericytes rekonstruert ved hjelp av denne prosessen. En 3D-analyse av rekonstruerte morfologier ved hjelp av tilpassede verktøy vises.Her er et isotropisk bildevolum fra et fokusert iionstråleskanningsdatasett for elektronmikroskopi. En tett rekonstruksjon av disse dataene avslører aksoner, den astrocytiske prosessen og dendrittene. Denne mikrografen viser eksempler på mål for kvantifiseringer som synapser og astrocytisk glykogengranulat.Masken fra den mikrografen viser fordelingen av glykogengranulat rundt synapser. Vist her er en grafisk illustrasjon av inndata og utgang av grafisk visualisering av glykogen-avledet laktat absorpsjon modell eller GLAM'Her, en bruker er vist iført en virtuell virkelighet eller V-R headset mens du arbeider med tett rekonstruksjon fra en fokusert ion stråle skanning elektron mikroskopi datasett. Fra en undergruppe av neuritter kan en oppslukende V-R-scene observeres.Den grønne laseren peker på en GLAM'peak. er av primær betydning som den bestemmer riktig størrelse på de eksporterte 3D-objektene og bestemmer sine målinger gjenspeiler den faktiske størrelsen. Konseptet med seriel seksjon bildebehandling, bildesegmentering og 3D konstruksjon er ganske gammel.Å oppdage den tekniske akselerasjonen fører til fremskritt i kolektomier i gjennomgang av anatomilærebøkene. Selv om metoden ble utviklet for hjerneforskning i elektronmikroskopi, kan den generaliseres til hvilken som helst og mikroskopiteknikk som genererer data Videre kan enhver form for 3D-bildeteknikk dra nytte av slike bildesegmenterings- og konstruksjonsteknikker. Inkludert C-T-skanninger og M-R-I.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Nervous System and Nervous Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

Human Fear Conditioning Conducted in Full Immersion 3-Dimensional Virtual Reality

Fear conditioning is a widely used paradigm in non-human animal research to investigate the neural mechanisms underlying fear and anxiety. A major ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering av dendritter og pigger i Mus hjernebarken og hippocampus hjelp<em&gt; I fosterlivet</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducing Plasticity av astrocytic Reseptorer av Manipulering av nevronal utløsning priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Rewiring Neuronal Circuits: En ny metode for rask Neurite Extension og funksjonell Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Høyoppløselig AC Confocal avbildning av blod - hjerne barrieren: bildebehandling, 3D rekonstruksjon og kvantifisering av Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Samtidig påføring av transkraniell likestrømstimulering under virtual reality-eksponering

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a form of non-invasive brain stimulation that changes the likelihood of neuronal firing through ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Flowcytometrisk analyse av multiple mitokondrielle parametere i humaninduserte pluripotente stamceller og deres nevrale og gliaderivater

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

En vevsryddingsmetode for nevronal avbildning fra mesoskopisk til mikroskopisk skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Isolering og direkte neuronal omprogrammering av mus astrocytter

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...