Name: a method for 3d reconstruction and virtual reality analysis of glial and neuronal cells
Uploaded: 2019-09-28T13:00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells at JoVE.com

Bu çalışma Kral Abdullah Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (KAUST) Rekabetçi Araştırma Hibeleri (CRG) tarafından desteklenmiştir "BEYIN Enerjisi Metabolizmasının Bütünleştirici Modellemesi için KAUST-BBP İttifakı" p.j.m.

1. Fiji kullanarak görüntü işleme
<ol><li>Yerel dosyayı yığını içeren mikroskoptan sürükleyip bırakarak veya tüm görüntü yığınını içeren klasörü sürükleyip yazılım penceresine bırakarak görüntü yığınını açın. NOT: Fiji, mikroskop sağlayıcılarının özel dosya biçimlerinin yanı sıra .jpg, .tif ve .png gibi tüm standart görüntü biçimlerini otomatik olarak tanıyabilir. Aşağıdaki protokol 3DEM görüntü yığınları için optimize edilmiş olsa da, bu adımlar ışık mikroskobu veri kümeleri için de kullanılabilir.</li>
	<li>Yığın açıldıktan sonra, voxel boyutunun meta verilerden okunduktan emin olmak için Resim > Özellikler'e gidin. Değilse, el ile girilebilir.</li>
	<li>Görüntüyü 8 bit'e dönüştürdüğünüzden emin olun. Resim > Yazın'a tıklayın ve 8 bit seçin.</li>
	<li>Özgün yığın farklı sıralı dosya/klasörlerdeyse, Resim > Yığınlar > Araçlar > Concatenate'iseçerek bunları tek bir yığında birleştirmek için Concatenate'i kullanın.</li>
	<li>Dosya > Kaydet'iseçerek yığını kaydet. Tek bir .tif dosyası olarak kaydedilir ve yedekleme ve daha fazla işlem için kullanılabilir.</li>
	<li>Orijinal yığın farklı fayans olarak elde edilirse, TrakEM2 içinde dikiş uygulayın.
	<ol>
<li>Yeni > TrakEM2 (boş)kullanarak yeni bir TrakEM2 projesi oluşturun.</li>
		<li>Viewport grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içinde, sağ fare düğmesini tıklatarak yığınları içeri aktar > İçe > İtv-kur yığınıve Fiji ana GUI'de açılan tüm döşemeleri içeri aktarın. Sağ tıklatarak tuval boyutunu tüm yığına uyacak şekilde yeniden boyutlandırın > Ekran > Resize Canvas/Layer Set, ve montajın son boyutuna bağlı olarak y/x piksel boyutunu seçin. NOT: Örneğin, montaj 4.096 x 4.096 piksel dört fayans kullanılarak sonuçlandırılmalıdır, tuval boyutu en az 8.192 x 8.192 piksel olmalıdır. Biraz daha büyük yapmak düşünün ve daha sonra kırpmak.</li>
		<li>Tek tek karoların ortak bölümlerini katman kümesine sürükleyip bırakarak üst üste koyun. Üst üste binmeye yardımcı olmak için saydamlığı değiştirmek için sol üst kaydırıcıyı kullanın.</li>
		<li>Sağ fare düğmesini tıklatarak yığınları montaj ve yeniden hizalayın > Hizalave ardından seçeneklerden birini seçin (aşağıdaki nota bakın). NOT: SBEM veya FIB-SEM genellikle zaten iyi hizalanmış, ancak küçük yanlış hizalamalar oluşabilir. Katmanları hizala z hizalaması için otomatik ardışık ardışık dır; Montaj birden fazla katman, tüm hacim için, her z yığını üzerinde fayans hizalamak için otomatik ardışık ardışık; Hizala çok katmanlı mozaik önceki iki seçeneği birleştirir. Bu işlem zaman alır ve makinenin rasgele erişim belleği (RAM) tabidir. Üst düzey bir bilgisayar kullanmayı düşünün ve yığının boyutuna bağlı olarak saatlerce/günler boyunca çalışmasına izin verin.</li>
		<li>Son olarak, görüntü yığınlarını dışa aktarın ve fare sağ tıklayarak kaydedin > Düz görüntü yapınve ardından açılan menülerde ilki son görüntüye doğru seçtiğinizden emin olun Başlat ve Bırak.</li>
		<li>TrakEM2 gömülü işlevleri kullanarak, gerekirse ilgi segment yapıları.<ol>
<li>TrakEM2'nin GUI'sinde Şablon penceresinin altındaki Her Şey'e sağ tıklayın ve yeni alt > Alan_listesi ekle'yiseçin.</li>
			<li>Project Objectsaltındaki klasörün üstündeki Bir Şeyi sürükleyin ve bırakın ve bir Şey orada görünür.</li>
			<li>Alan listesini şablondan Project Nesnelerialtında bulunan her şeye sürükleyin ve bırakın.</li>
			<li>Görüntü yığını viewport'unda imleçli Z alanını seçin. Alan listesi, benzersiz bir kimlik numarasıyla görüntülenir. Üstteki fırça aracını seçin (sağ altta) ve fareyi kullanarak bir yapıyı tüm z yığınının üzerinde sitosolunu doldurarak parçalara ayırın.</li>
			<li>Ilastik'te kullanılacak segmentli maskeyi, Z uzay listesindeki Alan listesi nesnesine veya viewporttaki maskeye sağ tıklayarak oymak için tohum olarak dışa aktarın ve Dışa aktarma > Alan listelerini etiket (tif) olarakseçin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Daha fazla yeniden yapılandırma için gereken çözünürlüğe bağlı olarak, mümkünse, segmentasyon ve yeniden yapılandırma için kullanılacak yazılımın bellek gereksinimlerini göz önünde bulundurarak, görüntü yığınının piksel boyutunu alt örnekleme yaparak küçültün. Resim > Ayarla > Boyutkullan . NOT: ilastik, xy kuyusu üzerinde 500 piksele kadar yığınlar işler. Ayrıca, alt örnekleme yığının çözünürlüğünü azaltacaktır; bu nedenle, nesnenin hala tanınabilir göründüğü ve böylece parçalanabileceği minimum boyutu göz önünde bulundurun.</li>
	<li>Kontrastı artırmak ve segmentasyona yardımcı olmak için, keskinleşmemiş maske filtresi membranları daha canlı hale getirmek için uygulanabilir. İşlem > Filtre > Keskinliği yitirme maskesinikullanın.</li>
	<li>Görüntü yığınını, Dosya > Kaydet olarak kullanarak segmentasyon yazılımında (örneğin, ilastik) daha fazla işleme için tek bir görüntü olarak dışa aktarın... > Görüntü sırası ve .tif biçimini seçin.</li>
</ol>2. Segmentasyon (Yarı otomatik) ve İlastik 1.3.2 Kullanarak Yeniden Yapılanma
<ol><li>Ana ilastik GUI'de Oyma modülünü seçin.</li>
	<li>Yeni Ekle > Diziden tek bir 3D/4D birim ekle'yikullanarak görüntü yığınını yükleyin.</li>
	<li>Tüm dizin'i seçin ve tek dosya olarak kaydedilen görüntü yığınını içeren klasörü seçin. Görüntüleri yükleme seçeneklerinin bulunduğu yeni pencerenin alt kısmında, Z'yi seçili tuttuğundan emin olun.</li>
	<li>Aşağıdaki adımlar için, tüm işlemler ve düğmeler ana yazılım GUI'nin sol tarafında bulunabilir. Ön işleme sekmesialtında, önceden denetlenen standart seçenekleri kullanın. Parlak çizgiler (sırt filtreleri) kullanın ve filtre ölçeğini 1.600'de tutun. Bu parametre daha sonra değiştirilebilir.</li>
	<li>Ön işleme tamamlandıktan sonra, Etiketleme modülünün açılır menüsündeki bir sonraki sayfayı seçin. Varsayılan olarak bir Nesne ve bir Arka Plan vardır.</li>
	<li>
Üzerine tıklayarak nesne tohumseçin ve ilgi yapısının üstüne bir çizgi çizin; sonra, arka plan tohumünü seçin ve yeniden oluşturulacak nesnenin dışına bir veya birden fazla çizgi çizin. Ardından Segment'e tıklayın ve bekleyin. NOT: Bilgisayarın gücüne ve yığının boyutuna bağlı olarak, segmentasyon birkaç saniye ile saat arasında sürebilir. Bu yapıldıktan sonra, segmentasyonu vurgulayan yarı saydam bir maske, parçalı yapının üstünde görünmelidir.<ol>
<li>Segmentasyonu denetlemek için yığında ilerleyin. Segmentasyon doğru olmayabilir ve ilgi yapısını doğru bir şekilde takip etmeyebilir veya ondan dökülmeyebilir. Dökülen segmentasyona bir arka plan tohumu yerleştirerek herhangi bir dökülmeyi düzeltin ve ilgi alanının yeniden oluşturulmayan kesiminin üzerine bir nesne tohumu ekleyin.</li>
		<li>Segmentasyon hala doğru değilse, kabul edildiği gibi belirsiz sınıflandırılmış piksel miktarını artıracak veya azaltacak Önyargı parametresi ile değiştirmeye çalışın. Değeri varsayılan olarak 0,95'tir; herhangi bir dökülme sınırlamak için azaltmak (genellikle en az 0,9) veya segmentasyon çok konservatif ise artış (en fazla 1).</li>
		<li>Diğer bir olasılık da 2.4 adımına geri dönmek (Ön İşlemeyi tıklatarak) ve filtrenin boyutunu değiştirmektir; değerinin artırılması (örneğin, 2) tuz ve biber gürültü benzeri etkileri en aza indirecek ama aynı zamanda membranlar daha bulanık ve daha küçük ayrıntıları tespit etmek zor hale getirecek. Bu dökülmeyi sınırlayabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İstenilen tüm nesneler bölümlere alındığı sürece gerektiği kadar yineleme. Bir nesne tamamlandıktan sonra, Segment'inaltındaki geçerli nesneyi Kaydet'etıklayın. Yeni bir nesnenin segmentasyonunu başlatmak için iki yeni tohum görünür.</li>
	<li>Tüm meshes Dışaaktar'a tıklayarak .obj dosyaları olarak yüzey meshes ayıklayın.</li>
	<li>Daha fazla redaksiyon gerekiyorsa, segmentasyon ikili maskeler olarak ayıklanabilir. Nesnelere Gözat'ı tıklatarak maskeyi dışa aktarmak için maskeyi seçin; sonra, Segmentasyon > Dışa Aktarma'ya sağ tıklayın ve daha sonra Çıktı dosyası bilgisialtında biçim olarak tif sırasını seçin.</li>
</ol>3. TrakEM2 (Fiji) içinde Redaksiyon / Segmentasyon (Manuel)
<ol><li>Görüntü yığınını yükleyin ve adım 1.6.1'e göre yeni bir TrekEM2 projesi oluşturun.</li>
	<li>Görüntü yığınını almak için kullanılan aynı içeri aktarma menüsünde bulunan alan listeleri olarak etiketleri içe aktarmaseçeneğini kullanarak düzeltmeye ihtiyaç duyan maskeleri içeri aktarın.</li>
	<li>Z alanında içe aktarılan alan listesini seçin ve segmentasyonu gözden geçirmek için Fırça aracını kullanın.</li>
	<li>Alan listesi > 3D'de göster'esağ tıklayarak modeli 3B olarak görselleştirin. Yeniden örnekleme numarası isteyen aşağıdaki pencerede, daha yüksek bir değer daha düşük çözünürlükte bir ağ oluşturur. NOT: Nesnenin boyutuna bağlı olarak, genellikle çözünürlük ve morfolojik ayrıntı arasında en iyi uzlaşma verir 4 ve 6 arasında bir değer kullanmayı düşünün.</li>
	<li>3B kafesi wavefront .obj olarak menüden seçerek dışa aktarın Dosya > Yüzeyleri Dışa Aktar > Wavefront.</li>
</ol>4. 3D Analizi
<ol><li>Blender'ı aç. Aşağıdaki adımlar için NeuroMorph araç kitini (https://neuromorph.epfl.ch/index.html mevcuttur) ve glikojen analiz araç kitini (https://github.com/daniJb/glyco-analysis mevcuttur) taktığından emin olun.
	<ol>
<li>Aynı anda birden çok nesne almak için Sahne menüsü altında Nesneleri Alma'yı tıklatarak NeuroMorph toplu alma kullanarak nesneleri içe aktarın. Remesh ve Düzgün gölgelemekullanımı etkinleştirdiğinden emin olun. NOT: Nesnenin başlangıç boyutu hakkında belirsizlik varsa Finalize remesh'e tıklamanız önerilmez. Değer 7 (varsayılan) de alma ağacı derinliği genellikle kabul edilebilir bir çözünürlük ve nesnenin morfolojisi korumak için iyidir.</li>
		<li>Alt satırdan ilgi çekici nesneyi seçin ve vertices sayısını en aza indirmek ve çözünürlük ve doğru morfoloji ayrıntıları kaybetmesini önlemek için değiştirici menü altında yinelemeli remesh işlevinin octree derinliğini değiştirin. Octree derinliğini değiştirirken, ana GUI'deki kafes buna göre değişecektir. Tamamlandıktan sonra, işlemi sonuçlandırmak için Uygula'yı tıklatın. NOT: 4 civarındaki değerler genellikle küçük nesneler (postsinaptik yoğunluklar gibi), büyük nesneler için 7 civarındaki değerler (uzun aksonlar veya dendritler gibi) ve farklı çözünürlüklerin ayrıntılarının olması gereken tam hücresel morfolojiler için 8 veya 9 civarındaki değerler için iyidir. Tutulan.</li>
		<li>Görüntü yığınını yüklemek için, NeuroMorph menüsünün altındaki sol paneldeki görüntü biriktirme aracı Nı görüntü yığını etkileşimlerini kullanın. X, yve x (kafesin birimlerine bağlı olarak mikron veya nanometreler) için görüntü yığınının fiziksel boyutunu girdiğimden emin olun ve Source_Z'yetıklayarak yığının yolunu seçin. X ve Y ortogonal düzlemlerdir; isteğe bağlıdırlar ve yalnızca kullanıcı geçerli bir yol eklerse yüklenir.</li>
		<li>Daha sonra, viewport'ta sağ tıklayarak bir kafes seçin, Sekmetuşuna basarak düzenleme moduna girin, fare sağ tıklatarak bir (veya daha fazla) vertices seçin ve son olarak, tepe noktasında göster resmine tıklayın. Bir (veya daha fazla) kesilmiş düzlem(ler) mikrograf ile mesh üstüne üst üste görünür.</li>
		<li>Üzerine sağ tıklayarak kesilen düzlemi seçin, Ctrl + Ytuşuna basın ve fare kaydırma özelliğini kullanarak 3B modelüzerinde ilerleyin. Bu da düzeltme yöntemi olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Yüzey alanlarının, hacimlerin ve uzunlukların ölçülmesi için Ölçüm araçlarını kullanın. Bu operasyonlar Jorstad ve ark.19 ve NeuroMorph web sitesi24tarafından daha ayrıntılı olarak belgelenmiştir.</li>
		<li>Glikojen yakınlığını dikenlere ve boutonlara doğru ölçmek için Glikojen analiz aracını kullanın. İşlemler bir önceki yayında daha ayrıntılı olarak belgelenmiştir10 ve glikojen analizdeposunda 25.</li>
	</ol></li>
	<li>GLAM23çalıştırın. Kod, yürütülebilir ve bazı test dosyaları GLAM deposunda kullanılabilir26.
	<ol>
<li>.ply formatında iki geometri dosyası hazırlayın: glikojen granülleri içeren bir kaynak dosya ve morfoloji yüzeyleri içeren bir hedef dosya.</li>
		<li>Yerel soğurma değerlerini, tepe değerlerini ve ortalama soğurma değerlerini temsil etmek için üç .ascii colormap dosyası (her satır t_norm(0..1) R(0..255) G(0..255) B(0.255)) içeren üç hazırlayın.</li>
		<li>Etki yarıçapını (mikronlarda), beklenen maksimum soğurma değerini ve emilim tepelerini kümeleme için normalleştirilmiş bir eşik ayarlayarak, geometri dosyaları (adım 4.2.1) ve renk eşlemi dosyalarıyla (adım 4.2.2) C++ komut dosyası GLAM'ı çalıştırın. Diğer parametreler hakkında bilgi için komut dosyasını -yardım seçeneğiyle çalıştırın.</li>
		<li>Sonuçları .kat veya .obj dosyaları olarak dışa aktarın: GLAM değerleriyle renk eşlenen hedef nesneler, renk kodlu küreler olarak gösterilen emme tepe işaretleri ve ortalama soğurma değerine göre renk kodlu hedef nesneler.</li>
	</ol></li>
	<li>VR Veri Etkileşimini Açın. VR Data Interact-çalıştırılabilir kod genel bir depo27mevcuttur.
	<ol>
<li>VR menüsündeki talimatları izleyerek görselleştirilecek meshe'leri içe aktarın. Bir GLAM çözümlemesi gerekirse, adım 4.2.1'de hesaplanan .obj dosyalarını içe aktarmayı unutmayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLOS Biology. 2, e329 (2004).</li><li>Coggan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Process+for+Digitizing+and+Simulating+Biologically+Realistic+Oligocellular+Networks+Demonstrated+for+the+Neuro-Glio-Vascular+Ensemble.">A Process for Digitizing and Simulating Biologically Realistic Oligocellular Networks Demonstrated for the Neuro-Glio-Vascular Ensemble.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Profiles+of+Myelin+Distribution+Along+Single+Axons+of+Pyramidal+Neurons+in+the+Neocortex.">Distinct Profiles of Myelin Distribution Along Single Axons of Pyramidal Neurons in the Neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19, 816-825 (2016).</li><li>Kasthuri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saturated+Reconstruction+of+a+Volume+of+Neocortex.">Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex.</a> Cell. 162, 648-661 (2015).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+neuropil+structure+in+mouse+somatosensory+cortex&#8212;A+3D+electron+microscopy+analysis+of+layer+1.">The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex&#8212;A 3D electron microscopy analysis of layer 1.</a> PLOS ONE. 13, e0198131 (2018).</li><li>Cal&#236;, C., Agus, M., Gagnon, N., Hadwiger, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Analysis+of+Glycogen+Derived+Lactate+Absorption+in+Dense+and+Sparse+Surface+Reconstructions+of+Rodent+Brain+Structures.">Visual Analysis of Glycogen Derived Lactate Absorption in Dense and Sparse Surface Reconstructions of Rodent Brain Structures.</a> , (2017).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+immersive+virtual+reality+for+studying+cellular+compartments+in+3D+models+from+EM+preparations+of+neural+tissues.">Three-dimensional immersive virtual reality for studying cellular compartments in 3D models from EM preparations of neural tissues.</a> Journal of Comparative Neurology. 524, 23-38 (2016).</li><li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruct:+a+free+editor+for+serial+section+microscopy.">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7, e38011 (2012).</li><li>Januszewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+automated+reconstruction+of+neurons+with+flood-filling+networks.">High-precision automated reconstruction of neurons with flood-filling networks.</a> Nature Methods. 1, (2018).</li><li>Shahbazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+Learning-Free+Segmentation+and+Reconstruction+of+Neural+Volumes.">Flexible Learning-Free Segmentation and Reconstruction of Neural Volumes.</a> Scientific Reports. 8, 14247 (2018).</li><li>Sommer, C., Straehle, C., K&#246;the, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ilastik:+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit.">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> , (2011).</li><li>Holst, G., Berg, S., Kare, K., Magistretti, P., Cal&#236;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+large+EM+stack+support.">Adding large EM stack support.</a> , (2016).</li><li>Beyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ConnectomeExplorer:+query-guided+visual+analysis+of+large+volumetric+neuroscience+data.">ConnectomeExplorer: query-guided visual analysis of large volumetric neuroscience data.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 19, 2868-2877 (2013).</li><li>Beyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culling+for+Extreme-Scale+Segmentation+Volumes:+A+Hybrid+Deterministic+and+Probabilistic+Approach.">Culling for Extreme-Scale Segmentation Volumes: A Hybrid Deterministic and Probabilistic Approach.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer. , (2018).</li><li>Jorstad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroMorph:+A+Toolset+for+the+Morphometric+Analysis+and+Visualization+of+3D+Models+Derived+from+Electron+Microscopy+Image+Stacks.">NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks.</a> Neuroinformatics. 13, 83-92 (2015).</li><li>Jorstad, A., Blanc, J., Knott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroMorph:+A+Software+Toolset+for+3D+Analysis+of+Neurite+Morphology+and+Connectivity.">NeuroMorph: A Software Toolset for 3D Analysis of Neurite Morphology and Connectivity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 59 (2018).</li><li>Cal&#236;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+anatomy+in+the+times+of+connectomics.">Astroglial anatomy in the times of connectomics.</a> Journal of Translational Neuroscience. 2, 31-40 (2017).</li><li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abstractocyte:+A+Visual+Tool+for+Exploring+Nanoscale+Astroglial+Cells.">Abstractocyte: A Visual Tool for Exploring Nanoscale Astroglial Cells.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. , (2017).</li><li>Agus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLAM:+Glycogen-derived+Lactate+Absorption+Map+for+visual+analysis+of+dense+and+sparse+surface+reconstructions+of+rodent+brain+structures+on+desktop+systems+and+virtual+environments.">GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments.</a> Computers &amp; Graphics. 74, 85-98 (2018).</li><li>&#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeuroMorph Analysis and Visualization Toolset. , (2018).</li><li>. GitHub - daniJb/glycol-analysis: Glycogen_analysis.py is a python-blender API based script that performs analysis on a reconstructed module of glycogen data Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/daniJb/glyco-analysis">https://github.com/daniJb/glyco-analysis</a> (2018)</li><li>. GitHub &#8211; magus74/GLAM: Glycogen Lactate Absorption Model Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/magus74/GLAM">https://github.com/magus74/GLAM</a> (2019)</li><li>Agus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLAM:+Glycogen-derived+Lactate+Absorption+Map+for+visual+analysis+of+dense+and+sparse+surface+reconstructions+of+rodent+brain+structures+on+desktop+systems+and+virtual+environments.">GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments.</a> Dryad Digital Repository. , (2018).</li><li>Cal&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from:+The+effects+of+aging+on+neuropil+structure+in+mouse+somatosensory+cortex&#8212;A+3D+electron+microscopy+analysis+of+layer+1.">Data from: The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex&#8212;A 3D electron microscopy analysis of layer 1.</a> Dryad Digital Repository. , (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sunulan yöntem, fib-SEM veya diğer otomatik seri kesit ve görüntüleme teknikleri gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinden gelsin, çok ölçekli bir EM veri setinin segmentasyonu ve 3D rekonstrüksiyonu için yararlı bir adım adım kılavuzdur. FIB-SEM, voxel boyutunda, odaklanmış bir iyon ışını kullanarak 5 nm'ye kadar ince keserek mükemmel izotropiye ulaşma avantajına sahiptir, fov'u yan objeler nedeniyle 15-20 m ile sınırlı olabilir, ki bu da muhtemelen kesilen dokunun birikmesi nedeniyle fo V bu değeri aşıyor. Bu tür eserler, mikroskop odası nın içindeki seri bölümleri kesmek için elmas bir bıçak kullanan SBEM gibi diğer teknikler kullanılarak önlenebilir. Bu ikinci durumda, z çözünürlüğü en iyi ihtimalle 20 nm civarında olabilir (genellikle, 50 nm), ancak piksel çözünürlüğü ilgi geniş bir bölge için tehlikeye gerekir rağmen, FOV daha büyük olabilir. Bu tür sınırlamalar (büyütme vs FOV) aşmak için bir çözüm fayans ilgi bölgesi bölmek ve her biri daha yüksek bir çözünürlükte elde etmektir. Burada hem temsili sonuçlarda bir SBEM yığın-veri kümesinin (i) hem de temsilci sonuçlarında FIB-SEM yığın-dataset (ii) sonuçlarını gösterdik.
Daha büyük ve daha büyük veri kümelerinin oluşturulması giderek yaygınlaştıkça, piksel sınıflandırması ve otomatik görüntü bölümleme için araçlar oluşturma çabaları çoğalıyor; Yine de, bugüne kadar, hiçbir yazılım güvenilirliği insan redaksiyon, bu nedenle hala gerekli, ne kadar zaman alıcı olursa olsun karşılaştırılabilir kanıtlamıştır. Genel olarak, veri kümesi (ii) durumunda olduğu gibi alt örneklenebilen daha küçük veri kümeleri, düzeltme süresi de dahil olmak üzere bir hafta içinde tek bir uzman kullanıcı tarafından yoğun bir şekilde yeniden oluşturulabilir.
Burada sunulan protokol özellikle üç yazılım programlarının kullanımını içerir: Fiji (sürüm 2.0.0-rc-65/1.65b), ilastik (sürüm 1.3.2 rc2) ve Blender (2.79), hepsi açık kaynak ve çoklu platform programları ve ücretsiz indirilebilir. Fiji ImageJ bir sürüme, biyolojik görüntü analizi için eklentileri tarafından desteklenmektedir. Bu sağlam bir yazılım mimarisine sahiptir ve yaşam bilim adamları için ortak bir platform olarak önerilmektedir ve TrakEM2, görüntü segmentasyonu için ilk ve en yaygın olarak kullanılan eklentileri içerir. Son zamanlarda birçok kullanıcı tarafından yaşanan bir sorun java 6 Java 8, uyumluluk sorunları yaratıyor geçiş; bu nedenle, Fiji'nin düzgün çalışmasına izin vermek için mümkünse Java 8'e güncellemekten kaçınmanızı öneririz. ilastik piksel sınıflandırması için bir dizi çerçeve sağlayan güçlü bir yazılımdır, her biri kendi web sitesinde belgelenmiş ve açıklanmıştır. EM yığınlarının yarı otomatik bölümlemasyonu için kullanılan oyma modülü, bilim adamlarının deneyimli bir kullanıcı için el ile çalışma için harcanan zamanı aylardan günlere düşürmelerine olanak tanıyan, tek bir tıklamayla tüm bir neurite olabileceği için çok zaman kazandırır. saniyeler içinde bölümlenir. Ön işleme adımı donanım açısından çok yoğundur ve burada sunulan SBEM yığını gibi çok büyük veri kümeleri, 26 GB'lık bir özellikti, belleğe sığacak tuhaf stratejiler gerektirir, çünkü büyük veri seti elde edilemeyeceğini göz önünde bulundurarak görüş ve çözüm alanı uzlaşma. Bu nedenle, alt örnekleme bu durumda uygun bir çözüm olmayabilir. Yazılımın en son sürümü güçlü bir Linux iş istasyonu ile birkaç saat içinde önişleme yapabilirsiniz, ancak segmentasyon dakika sürer ve yığın arasında kaydırma hala nispeten yavaş olacaktır. Biz hala ilk, kaba segmentasyon için bu yöntemi kullanmak ve TrakEM2 kullanarak proofread. Son olarak, Blender bir 3D modelleme yazılımı, güçlü bir 3D render motoru ile, hangi eklentileri olarak ana GUI gömülü olabilir python komut ile özelleştirilebilir, NeuroMorph ve glikojen analizi gibi. Bu yazılımın esnekliği, örneğin Fiji'nin aksine, büyük veri kümelerinin çevrimiçi görselleştirmesi için tasarlanmadığının dezavantajıile birlikte gelir; bu nedenle, büyük meshes (1 GB aşan) ile görselleştirme ve gezinme yavaş ve verimli olmayabilir. Bu nedenle, her zaman örgü karmaşıklığıazaltmak ama ilgi yapısının orijinal morfolojisi bozmak için dikkatli teknikleri seçmek için tavsiye edilir. Remesh işlevi kullanışlı dır ve NeuroMorph toplu alma aracının gömülü bir özelliğidir. Bu işlevle ilgili bir sorun, özgün kafesin tepe sayısına bağlı olarak, son çözümle ilgili octree derinlik değerinin buna göre değiştirilmesi gerektiğidir. Küçük nesneler küçük bir octree derinliği (örneğin 4) ile yeniden kullanılabilir, ancak aynı değer daha büyük değerlere ihtiyaç olan büyük nesnelerin morfolojisini bozabilir (en iyi ihtimalle 6, tam hücre gibi çok büyük bir ağ için 8 hatta 9). Nesnenin boyutu net değilse, bu işlemi yinelemeli yapmak ve farklı octree derinliklerini test etmek tavsiye edilir.
Daha önce de belirtildiği gibi, dikkate alınması gereken bir yönü kullanılan yazılım ile ilgili, yeniden yapılanma ve analiz, adanmış olması hesaplama gücüdür. Bu makalenin temsili sonuçlarında gösterilen tüm işlemler, AMD FirePro D500 Ekran kartı, 64 GB RAM ve 8 çekirdekli Intel Xeon E5 Işlemci ile donatılmış bir MacPro kullanılarak elde edilebilmektedir. Fiji büyük veri kümelerini işlemek için iyi bir yazılım mimarisine sahiptir; bu nedenle, 2,5 GHz Intel i7 işlemcive 16 GB RAM ile MacBook Pro gibi iyi bir donanım performansına sahip bir dizüstü bilgisayar kullanılması önerilir. ilastik yazılım, özellikle ön işleme aşamasında donanım kaynakları açısından daha talepkardır. Görüntü yığınının alt örneklemesi yazılımdan gelen donanım isteklerini sınırlamak için iyi bir hile olsa da ve kullanıcının bir dizüstü bilgisayarla bir desteyi işlemesine izin veriyor (genellikle x, y ,z'de 500 pikselin altındaysa), üst düzey bir kullanım önermekteyiz. bilgisayar sorunsuz bu yazılımı çalıştırmak için. Intel Xeon Gold 6150 Işlemci ile donatılmış, 16 çekirdekli ve 500 GB RAM ile donatılmış bir iş istasyonu kullanıyoruz.
Doğru bir 3D rekonstrüksiyon sağlandığında, bilim adamları orijinal mikrografları atabilir ve aynı türdeki hücrelerin yanı sıra farklı hücre türlerini karşılaştırmak için yararlı morfometrik verileri ayıklamak için doğrudan 3B modeller üzerinde çalışabilir ve morfolojilerin nitel ve nicel değerlendirmeleri. Özellikle, ikincisinin kullanımı, görsel oklüzyon (yani, gözlemci ve fi arasında yerleştirilen ikinci bir ilgi nesnesinin görüş engellemesi) mevcut yoğun veya karmaşık morfolojilerin analizleri durumunda yararlı olduğu kanıtlanmıştır rst nesne), temsil etmek ve 3D onları analiz etmek zor. Sunulan örnekte, deneyimli bir kullanıcının veri kümelerini gözlemleyebilmek ve nesneleri saymak yaklaşık 4 saat üst üste zaman aldı. VR analizi nde harcanan zaman, VR hastalığı gibi yönleri (bir dereceye kadar araba hastalığı ile ilgili olabilir) kullanıcı deneyimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir gibi değişebilir; Bu durumda, kullanıcı diğer analiz araçlarını tercih edebilir ve VR'a adanmış zamanlarını sınırlandırabilir.
Son olarak, tüm bu adımlar görüntü yığınları oluşturmak diğer mikroskopi ve olmayan EM teknikleri uygulanabilir. EM, genel olarak, işlemek ve segment zor görüntüler üretir, örneğin, floresan mikroskopisi ile karşılaştırıldığında, bir şey ikili maske karşılaştırılabilir (siyah bir arka plan karşı sinyal), prensipte kolayca 3D işlenebilir daha fazla işleme, genellikle ele alınması gerekir.

Otomatik seri bölüm ve görüntülemeye izin veren elektron mikroskobu kurulumu için önerilen ilk model 19811'ekadar uzanır; EM kullanarak görüntü büyük örnekler için bu tür otomatik, geliştirilmiş kurulumları difüzyon son on yıl içinde arttı2,3, ve etkileyici yoğun rekonstrüksiyonlar veya tam morfolojileri sergileyen eserler hemen takip4, 5,6,7,8,9,10.
Büyük veri kümelerinin üretimi, görüntü bölümlemi için geliştirilmiş ardışık hatlar gereksinimiyle birlikte geldi. RECONSTRUCT ve TrakEM211,12gibi seri bölümlerin manuel bölümleme için yazılım araçları iletim elektron mikroskobu (TEM) için tasarlanmıştır. Tüm süreç son derece zaman alıcı olabileceğinden, bu araçlar otomatik olarak son teknoloji ürünü, otomatik EM seri bölüm teknikleri (3DEM) ile oluşturulabilen binlerce seri mikrograf ile uğraşırken uygun değildir. blok-yüz taramalı elektron mikroskobu (SBEM)3 veya odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM)2. Bu nedenle, bilim adamları segmentasyon verimliliğini artırmak için yarı otomatik araçların yanı sıra tam otomatik araçlar geliştirmek için çaba sarf etti. Makine öğrenimi13 veya son teknoloji ürünü, eğitimsiz piksel sınıflandırma algoritmaları14'ütemel alan tam otomatik araçlar, daha büyük bir topluluk tarafından kullanılmak üzere geliştirilmektedir; yine de, segmentasyon hala tamamen güvenilir olmaktan uzaktır ve birçok eser hala segmentasyon süresi açısından verimsiz ama yine de tam güvenilirlik sağlar el emeği, dayanmaktadır. Ilastik15gibi yarı otomatik araçlar, gerçek bir düzeltme çerçevesi sağlamasa da, bir dereceye kadar düzeltilebilen segmentasyon için anında bir okuma sağladığından, daha iyi bir uzlaşmayı temsil eder ve entegre edilebilir paralel TrakEM2 kullanarak16.
Büyük ölçekli segmentasyon, bugüne kadar çoğunlukla konektomik lerle sınırlıdır; bu nedenle, bilgisayar bilim adamları en büyük, açıklamalı veri kümeleri entegre görselleştirmeler için çerçeveler sağlamak ve sinaptik kişilerin varlığı 17 ,18ile çıkarılan bağlantı desenleri analiz ilgileniyoruz. Bununla birlikte, 3B yapıların nitel değerlendirmeleri yerine nicel morfometrik analizler için doğru 3B rekonstrüksiyonlar kullanılabilir. NeuroMorph19,20 ve glikojen analizi10 gibi araçlar uzunlukları, yüzey alanları ve hacimleri için 3D rekonstrüksiyonları ölçümleri almak için geliştirilmiştir ve bulut noktalarının dağılımı, tamamen orijinal EM yığını8,10atarak . Astrositler ilginç bir vaka çalışmasını temsil eder, çünkü görsel ipuçlarının veya tekrarlayan yapısal örüntülerin eksikliği araştırmacılara bireysel yapısal birimlerin işlevi hakkında bir ipucu verir ve bunun sonucunda astrositik süreçlerin yeterli ontolojisinin eksikliği 21,analitik araçlar tasarlamayı zorhale getirin. Bir son girişimi Abstractocyteoldu 22, hangi astrositik süreçlerin görsel bir keşif ve astrositik süreçler ve nöritler arasındaki nitel ilişkilerin çıkarım sağlar.
Bununla birlikte, EM altında görüntü kesitli doku kolaylığı bozulmamış beyin örnekleri gizli bilgi miktarı çok büyük olduğu gerçeği ve tek bölümgörüntüleri yorumlayarak bu sorunun üstesinden gelebilir gerçeği geliyor. Beyindeki yapıların yoğunluğu o kadar yüksektir ki, aynı anda görülebilen birkaç nesnenin bile 3 boyutlu yeniden yapılandırmaları onları görsel olarak ayırt etmeyi imkansız kılar. Bu nedenle, yakın zamanda sanal gerçekliğin (VR) karmaşık yapıları gözlemlemek için geliştirilmiş bir yöntem olarak kullanılmasını önerdik. Biz oklüzyon üstesindenastrosit23 odaklanmak (ikinci bir ilgi nesnenin görünürlüğünü engelleme, bir 3D alanda) ve rekonstrüksiyonlar nitel değerlendirmeler imanları kolaylığı, redaksiyon dahil, yanı sıra nicelemeler uzaydaki nokta sayısını kullanarak özelliklerin. Yakın zamanda GLAM kullanımı ile VR görsel keşif kombine (glikojen kaynaklı laktat emilimi modeli), nöritlerin laktat mekik olasılık bir harita görselleştirmek için bir teknik, ışık yayan organları olarak glikojen granülleri dikkate alarak23; özellikle GLAM tarafından üretilen ışık tepelerini ölçmek için VR'ı kullandık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>2.0.0-rc-65/1.65b</td>
			<td>Open Source image processing editor 
			www.fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLastik</td>
			<td>Open Source&#160;</td>
			<td>1.3.2 rc2</td>
			<td>Image Segmentation tool 
			www.ilastik.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Blender Foundation</td>
			<td>2.79</td>
			<td>Open Source 3D Modeling software 
			www.blender.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Vive Headset</td>
			<td>HTC</td>
			<td>Vive / Vive Pro</td>
			<td>Virtual Reality (VR) Head monted headset 
			www.vive.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromorph</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of Blender Addons for 3D Analysis 
			neuromorph.epfl.ch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen Analysis</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>Blender addon for analysis of Glycogen 
			https://github.com/daniJb/glyco-analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAM</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>---</td>
			<td>C++ Code For generating GLAM Maps 
			https://github.com/magus74/GLAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for 3d reconstruction and virtual reality analysis of glial and neuronal cells

Elektron mikroskobu (EM) kullanılarak biyolojik dokunun seri kesitlenmesi ve sonraki yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, yüksek çözünürlüklü görüntülenmiş yığınların 2D kullanılarak çözülemeyecek ultrayapısal desenleri ortaya çıkarmasını sağlar. Görüntü. Gerçekten de, ikincisi morfolojilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilir, mitokondri durumunda olduğu gibi; bu nedenle 3D modellerin kullanımı giderek daha yaygın hale gelmekte ve morfoloji temelli fonksiyonel hipotezlerin formülasyonuna uygulanmaktadır. Bugüne kadar, ışık veya elektron görüntü yığınlarından oluşturulan 3B modellerin kullanımı nitel, görsel değerlendirmelerin yanı sıra nicelleştirmeyi de doğrudan 3D olarak gerçekleştirilmeye daha uygun hale getirir. Bu modeller genellikle son derece karmaşık olduğundan, bir sanal gerçeklik ortamı da tıkanıklık üstesinden gelmek ve 3D yapısı tam olarak yararlanmak için kurulması önemlidir. Burada, görüntü bölümlemeden yeniden yapılandırma ve çözümlemeye kadar adım adım kılavuz ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Yukarıda sunulan yordamı kullanarak, araçların esnekliğinin yordamı daha büyük veri kümelerine ölçeklendirmeyi nasıl mümkün kdığını göstermek için farklı boyutlardaki iki görüntü yığınının sonuçlarını gösteririz. Bu durumda, iki 3DEM veri kümesi (i) P14 sıçan, somatosensoriyel korteks, katman VI, 100 μm x 100 μm x 76.4 μm4 ve (ii) P60 sıçan, hipokampus CA1, 7.07 μm x 6.75 μm x 4.73 μm10.
Ön işleme adımları(Şekil 1)her iki veri kümesi için de aynı şekilde gerçekleştirilebilir, sadece ilk yığın gibi daha büyük bir veri kümesinin, yani 25 GB'lık, büyük veri görselleştirme ve işleme işlemek için daha fazla performans donanımı gerektirdiği göz önünde bulundurularak . İkinci yığın sadece 1 GB, mükemmel bir isotropic voxel boyutu ile.
Verilerin boyutu, mikroskobun sensörünün maksimum piksel boyutuna ve yığının büyütülmesine bağlı olan yığının çözünürlüğü yerine doğrudan görüş alanıyla (FOV) ilişkili olmayabilir. Her durumda, mantıksal olarak, daha büyük FOV'lar aynı çözünürlükte elde edilirse, küçük FOVs ile karşılaştırıldığında daha fazla fiziksel alan işgal olasılığı yüksektir.
Görüntü yığını içe aktarıladıktan sonra, protokolün bölüm 1'inde belirtildiği gibi, Fiji yazılımında(Şekil 1A),ImageJ12'ninbilimsel bir sürümü, görüntü biçiminin 8-bit olduğundan emin olmaktır (Şekil 1B). Bunun nedeni, birçok satın alma yazılımı farklı mikroskopi şirketleri üreticileri 16-bit olarak edinme süreci (yani, piksel boyutu, kalınlığı, akım / gerilim hakkında bilgi ile ilgili meta verileri depolamak için kendi özel dosya biçimini oluşturmak elektron ışını, oda basıncı) ile birlikte görüntü yığını. Meta veriler içeren ekstra 8 bit görüntüleri etkilemez gibi bu tür ayarlamalar, bilim adamları bellek kaydetmek için izin verir. Kontrol etmek için ikinci önemli parametre voxel boyutu, daha sonra segmentasyon aşağıdaki rekonstrüksiyon doğru ölçekte (mikrometre veya nanometre; Şekil 1B).
Yığınlar, fayans kullanılarak elde edilmişse yeniden hizalama ve/veya dikiş gerekebilir; bu işlemler TrakEM2(Şekil 2A)içinde gerçekleştirilebilir, ancak yeniden hizalama ile ilgili olarak, FIB-SEM veya 3View gibi otomatik 3DEM teknikleri genellikle iyi hizalanır.
Son bir adım, hangi nesnelerin yeniden oluşturulması gerektiğine ve alt örneklemenin yeniden oluşturulabilir özelliklerin tanınmasını etkileyip etkilemediğine bağlı olarak filtreleme ve büyük olasılıkla yığının alt örneklemesini gerektirir. Örneğin, daha büyük yığın için (P14 sıçanların somatosensoriyel korteks) rekonstrüksiyon verimliliği yararına çözünürlüğü tehlikeye atmak mümkün değildi, daha küçük yığın (P60 sıçanların hipokampus CA1) için ise, bunu yapmak mümkün oldu çünkü çözünürlük, en küçük nesnelerin yeniden oluşturulabilmesi için gerekenin çok üzerindeydi. Son olarak, keskinolmayan maskenin kullanımı membranlar ve arka plan arasındaki farkı artırarak, sınırları önceden değerlendirmek için degradekullanan ilastik gibi yazılımların yeniden yapılandırılması için elverişli hale getirir.
Görüntü işleme sonrasında yeniden yapılandırma, TrakEM2 kullanılarak manuel olarak veya yarı otomatik olarak ilastik kullanılarak gerçekleştirilebilir (Şekil 2C). Burada listelenen küçük bir gibi bir veri kümesi (ii), belleğe sığacak şekilde alt örneklenebilir, yoğun bir yeniden yapılanma üretmek için ilastik(Şekil 2B)kullanılarak tam olarak segmente edilebilir. Burada listelenen ilk veri kümesi söz konusu olduğunda (i), 500 GB RAM ile bir Linux iş istasyonu ile tüm veri kümesini yüklemeyi ve önceden işlemeyi başardık. 16 tam morfolojinin seyrek segmentasyonu, TrakEM2 kullanılarak elle prova edilen kaba segmentasyon çıkarılarak hibrit bir boru hattı ile elde edildi.
Yüzey alanları, hacimler veya hücre içi glikojen dağılımı gibi özelliklerin 3B analizi, NeuroMorph19 veya glikojen analizi10gibi özel kodlar kullanılarak Blender ortamında(Şekil 3)gerçekleştirilebilir.
Glikojen granülleri içeren veri kümelerinin de olması durumunda, dağılımları üzerinde analiz, doğrudan kafes üzerinde etki alanına sahip renk eşlemleri oluşturacak bir C++ kodu olan GLAM kullanılarak çıkarılabilir.
Son olarak, bu tür karmaşık veri kümeleri, belirli bir tıkanmış görünüme sahip veri kümelerinin analizinde yararlı olduğu kanıtlanan VR kullanılarak görselleştirilebilir ve analiz edilebilir(Şekil 4). Örneğin, GLAM haritalarından çıkarılan zirveler, burada tartışılan ikinci veri setinde dendritlerden görsel olarak kolayca çıkarılmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig1.jpg"> Şekil 1: Görüntü işleme ve görüntü bölümleme için hazırlık. (a) Ana Fiji GUI. (b) Temsili sonuçlarda tartışılan veri kümesinin (i) yığılmış görüntüleriörneği. Sağdaki panel, kullanıcının voxel boyutunu ayarlamasına izin veren özellikleri gösterir. (c) Tek bir görüntüye uygulanan filer ve yeniden boyutlandırma işlemi örneği. Sağdaki paneller görüntünün merkezinden büyütmeler gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig2.jpg"> Şekil 2: TrakEM2 ve ilastik. (a) TrakEM2 GUI kullanılarak elle bölümlere ayrılmıştır (kırmızı) nesnelerle segmentasyon ve rekonstrüksiyon. (b) A panelinden dışa aktarılan maske ,(c)yarı otomatik segmentasyon (oyma) için giriş (tohum) olarak kullanılabilir. Ilastik itibaren, maskeler (kırmızı) daha trakEM2 manuel redreading için ihraç edilebilir. (d) Maskeler daha sonra yeniden yapılandırılan yapıları ortaya çıkarmak için 3D üçgen meshes olarak ihraç edilebilir. Bu örnekte, dataset (i) (i) (temsili sonuçlarda tartışılan) dört nöron, astrosit, mikroglia ve perisit bu süreç kullanılarak yeniden inşa edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig3.jpg"> Şekil 3: Özelleştirilmiş araçlar kullanılarak yeniden yapılandırılan morfolojilerin 3Boyutlu analizi. (a) FIB-SEM veri setinden (ii) izotropik görüntülenmiş hacim (temsili sonuçlarda anlatıldığı gibi). (b) Panel a'danyoğun rekonstrüksiyon . Gri = akson; yeşil = astrositik süreç; mavi = dendritler. (c)Doğru büyütmelerde sinapslar (dataset (i)) ve astrositik glikojen granülleri (dataset (ii)) gibi niceliklere yönelik hedef örneklerini gösteren mikrograf. (d) Sinapslar etrafında glikojen granüllerin dağılımını gösteren c panelinden maske. (e) Blender'dan glikojen analiz alet kutusunu kullanarak cpanelinden gelen veri setinden glikojen dağılımının ölçülmesi. Hata çubukları standart hataları gösterir. N = 4,145 glikojen granül. (f) GLAM'ın giriş ve çıktı görselleştirmesinin grafik selüliti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59444/59444fig4.jpg"> Şekil 4: VR analizi. (a) Üzerinde çalışırken VR kulaklık takan bir kullanıcı (b) FIB-SEM veri kümesinden (ii) yoğun yeniden yapılanma (temsili sonuçlarda anlatıldığı gibi). (c) B panelindenbir alt nötrit kümesinden sürükleyici VR sahnesi . Yeşil lazer GLAM zirvesini gösteriyor. (d) GLAM tepe sayar VR bir analiz örneği. N = 3 fare her çubuk başına. Bir önceki yayından FIB-SEM analizi28. Hata çubukları standart hataları gösterir; *p < 0.1, tek yönlü ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59444/59444fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells at JoVE.com

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Açıklanan boru hattı, gigabaytlardan daha büyük elektron mikroskobu veri kümelerinin tüm hücre morfolojilerini ayıklamak için segmentasyonu için tasarlanmıştır. Hücreler 3B olarak yeniden oluşturulduktan sonra, bireysel ihtiyaçlar etrafında tasarlanmış özelleştirilmiş yazılım, görüntüleme tıkanıklığının üstesinden gelmek için sanal gerçekliği kullanarak doğrudan 3D olarak nitel ve nicel bir analiz yapmak için kullanılabilir.

Glial ve Nöronal Hücrelerin 3D Rekonstrüksiyonu ve Sanal Gerçeklik Analizi Için Bir Yöntem

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Otomatik seri bölüm elektron mikroskobu teknikleri. Biyolojik üç boyutlu modeller görüntü işleme üretimine yol açan boru hattında hız sınırlayıcı adım. Protokolümüz, sadece birkaç gün içinde görüntü hacimlerinin daha yoğun bir şekilde oluşturulması nı sağlamak için adım adım bir kılavuz sağlar.Üç boyutlu modeller kullanarak nicel ölçümler için bir yaklaşım ile birlikte. Bu teknikle, dokuların beyin dışındaki 3Boyutlu yapısı, bazı hastalıklara özgü yapısal bozuklukları belirlemek ve tanı stratejisini geliştirmek için potansiyel olarak analiz edilebilir. Segmentasyon sıkıcı bir adımdır.Kötü bir bölümleme düzeltmeyi ve tüm işlemi yeniden başlatmak zorunda kalmamak için mümkün olduğunca doğru hale getirmek için zaman ayırın. Yazılımın tasarımı bazen çok kullanıcı dostu değil. Bu nedenle, segmentasyon üzerinde başlangıç çalışması görmek önemlidir.Yığın içeren mikroskoptan yerel dosyayı sürükleyip bırakarak veya tüm görüntü yığınını içeren klasörü yazılım penceresine sürükleyerek ve bırakarak görüntü yığınını açın yığın açıldıktan sonra, voxels boyutunun meta verilerden okunduktan emin olmak için görüntü, özellikler gidin. Görüntüye tıklayarak resmi 8-bit'e dönüştürün, yazın ve 8-bit'i seçin. Orijinal yığın farklı fayans olarak elde edilirse, TrakEM2 içinde dikiş uygulayın.Yeni, TrakEM2 kullanarak yeni bir TrakEM2 projesi oluşturun TrakEM2 gömülü fonksiyonlar gerekirse ilgi segment yapıları segment. TrakEM2'nin yapışkanında, şablon penceresinin altındaki 'click'click'on'under'on ve yeni alt alan listesi ekle'Sürükley ve klasörüne bir şey bırak' seçeneğini belirleyin, proje nesnelerinin altında ve bir şey orada görünür. Sürükle ve bırak, alan listesi şablonundan bir şey'in altında bulunan proje nesneleri'Görüntü yığını viewport', imleç ile Z-space'i seçin.Alan listesi benzersiz kimlik numarasıyla birlikte görünür. Üstteki fırça aracını seçin ve fareyi kullanarak bir yapıyı tüm Z yığınının üzerinde sitosol doldurarak parçalara ayırın. Oyma için tohum olarak Ilastik kullanılacak segmentli kitle, ihracat.Bunu yapmak için, Z-uzay listesindeki alan listesi nesnesine veya görünüm bağlantı noktasındaki maskeye sağ tıklayın ve export'area list'as labels T-I-F'yi seçin. Daha fazla yeniden yapılandırma için gereken çözünürlüğe bağlı olarak, aşağı örnekleme yaparak görüntü yığınının piksel boyutunu küçültün. Segmentasyon ve yeniden yapılandırma için kullanılacak yazılımın bellek gereksinimlerini göz önünde bulundurun.Ilastik, X-Y'de beş yüz piksele kadar yığın işler. Nesneleri hala tanınabilir görünen ve böylece segmente edilebilir minimum boyutu dikkate alın. Image'adjust size'Kontrastı artırmak ve segmentasyona yardımcı olmak için, membranları daha canlı hale getirmek için keskinleşmemiş maske filtresi uygulanabilir.Process'filters'unsharp mass'Insharp mass'In imaj yığınını segmentasyon yazılımında daha fazla işlem için tek bir görüntü olarak aktar', file'save as'image sequence' kullanarak ve TIFF'formatını seçin. Ana Ilastik gooey olarak, oyma modülü seçin. Yeni ekle'yi kullanarak görüntü yığınını yükleyin ve dizi 'Tüm dizin seç' dizisinden tek bir 3D/4D birim ekleyin ve tek dosya olarak kaydedilen görüntü yığınını içeren klasörü seçin'Resimleri yükleme seçeneklerinin bulunduğu yeni pencerenin altında, Z'yi seçtiğinizden emin olun.Aşağıdaki adımlar için, tüm işlemler ve düğmeler ana yazılım yapışkanının sol tarafında bulunabilir. Ön işleme sekmesialtında, önceden denetlenen standart seçenekleri kullanın. Parlak çizgilerin zengin filtrelerini kullanın ve filtre ölçeğini 1.600'de tutun.Bu çevre daha sonra değiştirilebilir. Ön işlem tamamlandıktan sonra, etiketleme modülünün açılır menüsündeki bir sonraki sayfayı seçin. Varsayılan olarak bir nesne ve bir arka plan vardır.Üzerine tıklayarak nesne tohumseçin ve ilgi yapısının üstüne bir çizgi çizin. Ardından, arka plan tohumünü seçin ve yeniden oluşturulacak nesnenin dışına bir veya birden fazla çizgi çizin. Şimdi, segment'e tıklayın ve bekleyin.Bilgisayarın gücüne ve yığının boyutuna bağlı olarak, segmentasyon birkaç saniye ile saat arasında sürebilir. Bu yapıldıktan sonra, segmentasyonu vurgulayan yarı saydam bir maske, parçalı yapının üzerinde görünmelidir. Segmentasyonu denetlemek için yığında ilerleyin.Segmentasyon, ilgi yapısını takip etmez veya ondan dökülür doğru olmayabilir. Dökülen segmentasyon üzerine bir arka plan tohumu yerleştirerek herhangi bir dökülme düzeltin. Ve ilgi nesnesinin yeniden oluşturulmayan kesiminin üzerine bir nesne tohumu ekleyin.Ilastik ile segmentasyonun doğru görsel düzeltmesi sıkıcı olabilir, ancak dışa aktarılan nesnelerin yapıtları içermediğinden emin olmak önemlidir. Segmentasyon hala doğru değilse, kabul edilen belirsiz sınıflandırılmış piksel miktarını artıracak veya azaltacak bias'parametresi ile değiştirmeye çalışın. Bu değeri varsayılan olarak 0,95 olduğunu.Segmentasyon çok tutucu ise herhangi bir dökülme veya artış sınırlamak için azaltın. Başka bir olasılık önişleme'yi tıklatmak ve filtrenin boyutunu değiştirmektir. Değeri artırmak tuz ve biber gürültü benzeri etkileri en aza indirecektir, ama aynı zamanda membranlar daha bulanık ve daha küçük ayrıntıları tespit etmek zor hale getirecek.Bu dökülmeyi sınırlayabilir. İstenilen tüm nesneler bölümlendirildiği sürece gerektiği kadar yineleme. Bir nesne tamamlandıktan sonra, segment'e gidin ve geçerli nesneyi kaydet'' yeni bir nesnenin segmentasyonunu başlatmak için iki yeni tohum görünür'' düğmesine tıklayın.Soyut yüzey önlemleri hemen O-B-J dosyaları olarak dışa aktarıntıkla tüm kafesler 'To trakEM2 içinde 3D el ile segmente modelleri görselleştirmek için, sağ tıklama alan listesi, sonra 3D'A daha yüksek değer göster seçin daha düşük çözünürlüklü örgü oluşturacaktır. Son olarak, wavefront O-B-J'by olarak 3D mesh dışa aktarın menü dosyası'export yüzeyler'WaveFront'Sonra metin protokolü açıklandığı gibi nöro morflama araç kiti yükledikten sonra, açık blender. Aynı anda birden fazla nesne almak için sahne nin altındaki nesneleri'nin altındaki netler menüsüne tıklayarak nöro morph toplu alma kullanarak nesneleri alma.Etkinleştirmeye, yeniden örgü ve düzgün gölgeleme kullandığınızdan emin olun. Dış astardan ilgi çekici nesneyi seçin ve değiştiricinin menüsü altında yeniden kafes işlevinin Octree Derinliğini değiştirin. Vertices sayısını en aza indirmek ve çözünürlük ve doğru morfoloji ayrıntıları kaybetmemek için yinelemeli çalışın.Octree Derinliği değiştirirken, ana yapışkan üzerinde mesh buna göre değişecektir. Tamamlandıktan sonra, işlemi sonuçlandırmak için uygula'ya tıklayın. Sol paneldeki nöro morf menüsüne gidin ve görüntü yığınını yüklemek için görüntü superimposition araç görüntü yığını etkileşimlerini kullanın.X, Y ve Z için görüntü yığınının fiziksel boyutunu girdiğimden emin olun ve kaynak Z.X ve Y'ye tıklayarak yığının yolunu seçin ortogonal düzlemlerdir. Bunlar isteğe bağlıdır ve yalnızca kullanıcı geçerli yolu eklerse yüklenir. Ardından, üzerine sağ tıklayarak görünüm bağlantı noktasında bir kafes seçin.Sekmeye basarak düzenleme moduna girin, faresağ tıklatarak bir veya daha fazla tepe noktası seçin ve son olarak tepe noktasındaki göster resmine tıklayın. Mikrograflı bir veya daha fazla kesilmiş düzlem kafesin üzerine yerleştirilmiş görünür. Üzerine sağ tıklayarak kesilen düzlemi seçin.Ardından Y denetimine basın ve fare kaydırma özelliğini kullanarak 3B modelüzerinde kaydırın. Bu da düzeltme yöntemi olarak kullanılabilir. Burada gösterilen segmentasyon ve rekonstrüksiyon TrakEM2 ve Ilastik kullanılarak.TrakEM2 yapışkanı, el ile kırmızı yla bölümlere ayrılmıştır. Dışa aktarılan maske daha sonra yarı otomatik segmentasyon için giriş olarak kullanılabilir. Ilastik'ten, maskeler manuel prova için TrakEM2'ye daha fazla ihraç edilebilir.Maskeler yeniden yapılandırılan yapıları ortaya çıkarmak için 3D üçgen meshes olarak ihraç edilebilir. Bu örnekte, dört nöron, astrosit, mikroglia ve perisit bu süreç kullanılarak yeniden inşa edilmiştir. Özelleştirilmiş araçlar kullanılarak yeniden oluşturulmuş morfolojilerin 3Boyutlu analizi gösterilmiştir.Burada elektron mikroskobu veri seti tarama odaklanmış bir iyon ışını bir isotropic görüntü hacmidir. Bu verilerin yoğun bir yeniden yapılanma akson, astrositik süreç ve dendritler ortaya koymaktadır. Bu mikrograf, sinapslar ve astrositik glikojen granüller gibi niceliksel hedeflerin örneklerini göstermektedir.Mikrograftaki maske glikojen granüllerin sinapsların etrafındaki dağılımını gösteriyor. Burada glikojen kaynaklı laktat emilim modeli veya GLAM'Here grafik görselleştirme giriş ve çıkış grafik bir grafik illüstrasyon gösterilmektedir, bir kullanıcı odaklanmış bir iyon ışını tarama elektron mikroskobu veri setinden yoğun rekonstrüksiyon üzerinde çalışırken bir sanal gerçeklik veya V-R kulaklık giyen gösterilir. Nöritlerin bir alt kümesinden, sürükleyici bir V-R sahnesi görülebilir.Yeşil lazer GLAM'ın zirvesini gösteriyor. dışa aktarılan 3B nesnelerin doğru boyutunu belirlediği ve ölçümlerinin gerçek boyutunu yansıttığını belirlediği için birincil öneme sahiptir. Seri kesit görüntüleme, görüntüleme segmentasyonu ve 3D konstrüksiyon kavramı oldukça eskidir.Teknik ivmekeşfetmek anatomi ders kitapları nın gözden colectomies gelişmelere yol açıyor. Elektron mikroskobunda beyin araştırmaları için yöntem geliştirilmiş olmasına rağmen, herhangi bir ve mikroskopi tekniği ne olursa olsun veri üreten tekniklerle genelleştirilebilmekte, her türlü 3Boyutlu görüntüleme tekniği bu görüntüleme segmentasyon ve yapım tekniklerinden yararlanabilir. C-T taramaları ve M-R-I dahil.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Nervous System and Nervous Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

Human Fear Conditioning Conducted in Full Immersion 3-Dimensional Virtual Reality

Tam Daldırma 3-Boyutlu Sanal Gerçeklik Yapılan İnsan Fear İklimlendirme

Fear conditioning is a widely used paradigm in non-human animal research to investigate the neural mechanisms underlying fear and anxiety. A major ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Kan - beyin bariyerini yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme: görüntüleme, 3D yeniden yapılanma ve Transcytosis miktar

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Simultaneous Application of Transcranial Direct Current Stimulation during Virtual Reality Exposure

Sanal Gerçekliğe Maruz Kalma Sırasında Transkraniyal Doğru Akım Stimülasyonunun Eşzamanlı Uygulaması

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a form of non-invasive brain stimulation that changes the likelihood of neuronal firing through ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...